JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

В данном исследовании описан метод конструирования агрегатов на основе самосборки мезенхимальных стволовых клеток человека и определены морфологические и гистологические характеристики для регенеративного лечения дефектов костей черепа.

Аннотация

Мезенхимальные стволовые клетки (МСК), характеризующиеся способностью к самообновлению и потенциалом многолинейной дифференцировки, могут быть получены из различных источников и становятся многообещающими кандидатами для регенеративной медицины, особенно для регенерации зубов, костей, хрящей и кожи. Самоорганизующийся подход к агрегации МСК, который, в частности, конструирует клеточные кластеры, имитирующие развивающуюся мезенхимальную конденсацию, позволяет доставлять стволовые клетки с высокой плотностью наряду с сохраненными межклеточными взаимодействиями и внеклеточным матриксом (ВКМ) в качестве ниши микроокружения. Было показано, что этот метод обеспечивает эффективное приживление и выживание клеток, тем самым способствуя оптимизированному применению экзогенных МСК в тканевой инженерии и обеспечивая клиническую регенерацию органов. В данной работе представлен подробный протокол построения и характеризации самоорганизующихся агрегатов на основе мезенхимальных стволовых клеток пуповины (UCMSCs), а также пример регенеративного применения костей черепа. Реализация этой процедуры поможет разработать эффективную стратегию трансплантации МСК для тканевой инженерии и регенеративной медицины.

Введение

Конденсация мезенхимальных стволовых клеток (МСК) является важным этапом для обеспечения нормального роста и развития организма на ранних этапах органогенеза 1,2, особенно при формировании костей, хрящей, зубов и кожи 1,3,4. За последние несколько десятилетий тканевая инженерная терапия с использованием культивируемых постнатальных МСК в сочетании с биоразлагаемыми каркасами достигла значительных успехов в остеогеннойрегенерации5 и хрящевойрегенерации6. Тем не менее, использование скаффолдов может иметь некоторые недостатки, такие как иммунное отторжение, а также низкая клеточная аффинность ипластичность. В связи с этим нами исследована целесообразность применения метода сфероидной клеточной культуры для получения самоорганизующихся агрегатов, не содержащих каркасов, имитирующих развивающееся явление конденсации, которые содержат только МСК и депонированный внеклеточный матрикс (ВКМ)8. Образование агрегатов повышает аппликативную пластичность в соответствии с формой дефекта и позволяет избежать имплантации скаффолда и его расщепления протеолитическими ферментами для сбора МСК для трансплантации9.

Агрегаты МСК широко используются для регенерации кости, пульпы зуба, пародонта и кожи10, а также других тканей и органов. В качестве кандидатов на роль затравочных клеток могут быть выбраны многие различные типы МСК, включая, помимо прочего, МСК костного мозга (BMMSC), МСК пуповины (UCMSC), стромальные клетки, полученные из жировой ткани (ADSC), и стоматологические МСК (например, мезенхимальные стволовые клетки пульпы зуба [DPSC], мезенхимальные стволовые клетки из молочных зубов [SHED]11 и мезенхимальные стволовые клетки периодонта [PDLSC])12. За последнее десятилетие было разработано множество технологий для трехмерных кластеров ячеек, включая ассистированную и самоорганизующуюся агрегацию. Тем не менее, подходы с помощью агрегации часто слабы в создании ЭКМ и формировании однородных и плотных агрегатов, и поэтому не подходят для имитации физиологических условий 13,14,15. Более того, некоторые вспомогательные методы агрегации требуют взаимодействия клетки с материалом для формирования стабильных структур 16,17,18,19, в то время как этот метод самоорганизующейся агрегации обычно доступен для широкого спектра МСК. Примечательно, что в наших недавних клинических испытаниях агрегаты МСК были успешно использованы для регенерации пульп-дентинового комплекса и пародонта после имплантации в поврежденные резцы человека которые достигли регенерации тканей de novo с физиологической структурой и функцией20,21.

В этой статье представлена тщательная процедура построения и определения характеристик агрегата МСК, а также трансплантации in vivo . Этот подход привлечет внимание исследователей, когда они стремятся исправить дефекты в тканях, таких как зубы, кости, хрящи и кожа, на основе применения стволовых клеток. Этот способ прост, удобен и полностью составлен из клеток и ЭХМ без дополнительных скаффолдов, которые можно культивировать в течение длительного времени для получения плотных и стабильных агрегатов22. Между тем, агрегаты, культивируемые таким образом, богаты ВКМ, который имитирует развивающуюся нишу для этих клеток высокой плотности и, таким образом, способствует регенерациитканей23. Процесс конструирования можно разделить на два этапа: подготовка и культивирование клеток, а также самоорганизующееся формирование и сбор клеточных агрегатов. Характеристика агрегатов включает морфологическую идентификацию с помощью инвертированного оптического микроскопа и сканирующего электронного микроскопа (СЭМ), а также гистологический анализ с помощью гематоксилина и эозина (ПЭ) и окрашивание по Массону. Полученные агрегаты были продемонстрированы для регенеративной имплантации с целью восстановления дефекта костей черепа. Реализация этой процедуры поможет разработать эффективную стратегию трансплантации МСК для тканевой инженерии и регенеративной медицины.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: Все процедуры на животных были одобрены Комитетом по уходу за животными и их использованию Четвертого военно-медицинского университета и выполнялись в соответствии с Руководством Национальных институтов здравоохранения по уходу и использованию лабораторных животных. Для настоящего исследования были использованы криоконсервированные человеческие UCMSC, полученные из коммерческого источника (см. Таблицу материалов). Использование человеческих клеток было одобрено Этическим комитетом Четвертого военно-медицинского университета. В качестве примера для описания процедуры были взяты UCMSC. Дефект черепа был взят в качестве примера для демонстрации необходимости восстановления для описания процедуры имплантации. Все эксперименты повторялись три раза.

1. Строительство агрегатов UCMSC

  1. Подготовка и культура УКМСК
    1. Добавьте 10 мл предварительно подогретого фосфатно-солевого буфера (PBS) в новую центробежную пробирку объемом 15 мл в стерильном шкафу биобезопасности.
    2. Извлеките морозильную трубку с замороженными UCMSC из жидкого азота и быстро поместите ее на водяную баню при температуре 37 °C. Осторожно встряхните пробирку, чтобы способствовать быстрому и тщательному размораживанию клеток.
      ВНИМАНИЕ: Вся процедура должна быть завершена в течение 1 минуты, так как диметилсульфоксид (ДМСО) в замораживающем растворе может вызвать цитотоксичность.
    3. Слегка подвесьте клетки в морозильной пробирке и перенесите все содержимое в центрифужную пробирку, содержащую 10 мл PBS (шаг 1.1.1). Центрифугируйте образец при 100 × г в течение 5 мин. Выбросьте надосадочную жидкость и промойте клетки 10 мл PBS.
    4. Центрифугируйте образец при 100 × г в течение 5 минут. Выбросьте надосадочную жидкость и осторожно восстановите клетки с помощью полной альфа-минимальной эссенциальной среды (α-MEM), содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS), 1% пенициллин-стрептомицина и 584 мг/л глутамина.
    5. Высевайте ресуспендированные клетки в 10-сантиметровые культуральные чашки (часто одну-две чашки на одну пробирку, в зависимости от общего количества клеток после центрифугирования, при плотности 5 ×10-6 клеток на чашку). Добавляйте в посуду полную среду α-MEM до общего объема 10 мл.
    6. Аккуратно встряхните посуду, чтобы распределить ячейки. Инкубируйте чашки при температуре 37 °C с 5%CO2 в увлажненной камере. После ночной инкубации выбросьте надосадочную среду и добавьте 5 мл PBS 1-2x для удаления неадгезивных клеток. Добавьте 10 мл свежей полной среды α-MEM. Меняйте питательные среды каждые 2 дня.
    7. Для пассирования клеток, когда клетки достигают 80%-90% слияния, выбросьте надосадочную жидкость и промойте клетки 5 мл PBS для тщательного удаления среды. Инкубируйте клетки в 2 мл 0,25% трипсина-1 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) при 37 °C в течение 2 мин.
    8. Когда клетки станут круглыми с нарушенными межклеточными соединениями под микроскопом, отделите клетки от чашек без слишком большого нарушения клеточной структуры. Нейтрализуйте трипсин, добавив 4 мл полной среды α-MEM.
    9. Соберите клетки из посуды несколько раз и осторожно с помощью пипетирования в свежую центрифужную пробирку объемом 15 мл. Центрифугируйте образец при 100 × г в течение 5 мин. Выбросьте надосадочную жидкость, повторно суспендируйте клетки полной средой α-MEM и засейте их в чашки для свежих культур или луночные тарелки. Меняйте питательные среды каждые 2 дня.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от размера дефектной области, дефект размером 25мм3 требует использования лунки из 6-луночных пластинчатых ячеек, культивируемых для образования агрегатов.
  2. Формирование и уборка агрегатов
    1. Приготовьте среды, индуцирующие клеточные агрегаты, добавив 50 мкг/мл витамина С в α-MEM с 10% FBS, 1% пенициллин-стрептомицином и 584 мг/л глутамина.
      ВНИМАНИЕ: При использовании витамина С следует избегать воздействия прямого света, так как витамин С окисляется под воздействием света и становится неэффективным.
    2. Когда клетки на шаге 1.1.12 достигнут 95% слияния (дополнительный рисунок S1), смените среду на среду, индуцирующую клеточный агрег; Меняйте свежие среды, индуцирующие клеточный агрегат, каждые 2 дня.
    3. После 7-10 дней индукции (продолжительность индукции зависит от типа стволовых клеток и часто составляет ~7 дней для края UCMSC) ищите под микроскопом формованные агрегаты с толстыми краями, отделенными от дна чашки.
    4. Выбросьте питательную среду и аккуратно промойте клетки 2 раза PBS. Аккуратно протолкните агрегаты от края к середине с помощью небольших стерильных щипцов, складывая агрегаты.
    5. В некоторых случаях UCMSC могут самопроизвольно скручиваться к центру, образуя твердую конденсацию. Эта структура эквивалентна агрегату, полученному на шаге 1.2.4.

2. Морфологическая идентификация агрегатов

  1. Общее и микроскопическое наблюдение
    1. Обратите внимание, что агрегаты плотные и цельные и не могут быть легко повреждены механическими силами, такими как вытягивание во время отсоединения и трансплантации.
    2. Под микроскопом ищите мембраноподобную структуру определенной толщины с тканым рисунком.
  2. Окрашивание живых/мертвых клеток
    1. Засейте клетки в 6-луночный планшет с плотностью 1 ×10-6 клеток в лунку.
    2. Приготовьте 2 μМ кальцеина AM и 4 μМ EthD-1 рабочий раствор и используя PBS.
    3. Добавьте 0,3% тритона в клетки на 5 минут, промойте PBS три раза, чтобы вызвать гибель клеток, в качестве контроля окрашивания.
    4. Промойте клетки, агрегаты и клетки, вызывающие мертвение, PBS дважды.
    5. Добавьте 100 мкл PBS и 100 мкл приготовленного окрашивающего раствора на шаге 2.2.2 в каждую лунку.
    6. Инкубируйте образец в течение 30 минут при RT. Промойте образец PBS дважды.
    7. Добавьте 200 мкл 10 мкг/мл Hoechst в каждую лунку и инкубируйте образец в течение 5 мин при RT. Дважды проведите отбор образца с PBS.
    8. Наблюдайте под флуоресцентным микроскопом.
  3. Наблюдение за СЭМ
    1. Затравить и индуцировать в клетку агрегаты, полученные на шаге 1.2.4 или 1.2.5. Промыть ячейки PBS после формирования агрегатов на шаге 1.2.4. или 1.2.5.
    2. Зафиксируйте клетки с помощью глутарового альдегида не менее чем на 4 ч.
    3. Промойте образцы PBS, затем обезвожьте через градиентную концентрацию этанола от 30%, 50%, 70%, 80%, 90% до 100% каждый в течение 5 минут. Обработайте 2 раза безводным этанолом.
    4. Погрузите агрегаты в 3 мл гексаметилдисилазана на 30 минут. Отсадите всю жидкость и естественным образом тщательно высушите образцы.
      ВНИМАНИЕ: Весь процесс необходимо проводить в вытяжном шкафу, потому что гексаметилдисилазан летуч и высокотоксичен.
    5. Наклейте высушенные образцы на стол для образцов с помощью двусторонней углеродной ленты и покройте поверхность металлом. Храните образец при комнатной температуре (RT) в течение нескольких дней.
    6. Наблюдайте под СЭМ.
      1. Установите образец на место внутри аппарата. Отрегулируйте напряжение станка на 5 К, а фокусное расстояние на ~12 мм. Отрегулируйте полосу фокусировки до тех пор, пока не появится четкое изображение.
      2. Делайте снимки с малым увеличением. Отрегулируйте увеличение и перефокусируйтесь, чтобы получить изображение с большим увеличением.
        ВНИМАНИЕ: Поверхность агрегатов нельзя трогать до начала наблюдения во избежание разрушения морфологии поверхности.

3. Гистологический анализ агрегатов

  1. Фиксация и секционирование образцов
    1. Зафиксируйте заполнители, полученные на шаге 1.2.4 или 1.2.5, с 4% параформальдегидом при температуре 4°С не менее чем на 24 часа. После фиксации промойте PBS и поместите образец в закладные кассеты на ночь для промывки проточной водой.
    2. Обезвоживайте образцы с помощью автоматических машин для обезвоживания с помощью градиентного этанола, ксилола и парафина, следуя инструкциям производителя. Весь процесс выглядит следующим образом: 85% этанола в течение 2 ч при RT, 95% этанола в течение 2 ч при RT, 95% этанола в течение 2 ч при RT, 100% этанола в течение 2 ч при RT, 100% этанола в течение 1,5 ч при RT, ксилола в течение 45 мин при RT, ксилола в течение 45 мин при RT, парафина в течение 30 мин при RT, парафин в течение 1,5 ч при RT и, наконец, парафин в течение 2 ч при 60 °C.
    3. Замажьте образцы парафином. Подготовьте срезы толщиной около 5 мкм, приклейте их к катионным предметным стеклам и высушите предметные стекла в течение 2 ч при 45 °C.
    4. Депарафинизируйте последовательно через ксилол в течение 15 минут, дважды и 100%, 90%, 80% и 70% этанола (каждый в течение 5 минут).
    5. Медленно промойте горки 3 раза проточной водой в течение 5 минут.
  2. Окрашивание HE
    1. Запачкайте гематоксилином в течение 3-5 минут, смойте водой, и тщательно удалите лишнюю жидкость вокруг ткани.
    2. Фракционировать этанолом, содержащим 1% соляной кислоты в течение 3-5 с и смыть проточной водой, во время которой цвет становится немного светлее и голубым. Удалите лишнюю воду вокруг ткани.
    3. Запачкайте эозином в течение 1 минуты, смойте проточной водой, удалите лишнюю жидкость вокруг ткани.
    4. Обезвожьте 70%, 80%, 90% и 100% этанолом в течение 10 секунд каждый, ксилолом в течение 15 минут, дважды и высушите естественным образом в вытяжном шкафу перед запечатыванием листа.
    5. Добавьте нейтральные капли смолы и запечатайте слайды покровными стеклами. Наблюдайте под световым микроскопом.
  3. Трихромное окрашивание Массона
    1. Запачкать гематоксилином железа Вейгерта в течение 5 минут, прополоскать водой, вытереть насухо.
    2. Фракционировать этанолом, содержащим 1% соляной кислоты в течение 3-5 с и смыть проточной водой, во время которой цвет становится немного светлее и голубым. Вытрите поверхность насухо.
    3. Окрасить раствором красного кислого пурпурного цвета Lixin на 5-10 мин и быстро смыть дистиллированной водой.
    4. Обработать водным раствором фосфомолибдиновой кислоты в течение 3-5 мин.
    5. Непосредственно повторно испачкать раствором анилинового синего в течение 5 минут, не смывая водой.
    6. Обработать 1% ледяной уксусной кислотой в течение 1 мин.
    7. Обезвожьте 70%, 80%, 90% и 100% этанолом в течение 10 секунд каждый, ксилолом в течение 15 минут, дважды и высушите естественным образом в вытяжном шкафу перед запечатыванием листа.
    8. Добавьте нейтральные капли смолы и запечатайте слайды покровными стеклами. Наблюдайте под световым микроскопом.

4. Имплантация

  1. Обезболите обнаженную мышь внутрибрюшинной инъекцией 50 мг/кг пентобарбитала натрия.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что мыши находятся под надлежащей анестезией, основываясь на отсутствии роговичного рефлекса и реакции конечностей при защемлении подушечки лапы. Наносите мазь для глаз для предотвращения сухости.
  2. Вырежьте поперечный разрез (~3-4 см) на коже за ушами голой мыши стерильными маленькими ножницами после дезинфекции йодофором.
  3. Потяните кожу вперед, чтобы обнажить черепную коробку. Слегка проведите лезвием 11# края запланированной области дефекта и удалите фрагмент кости. Область дефекта представляет собой круглую область диаметром около 4 мм. Используйте физиологический раствор для промывания раны и обеспечения адекватного гемостаза.
  4. Полученные на шаге 1.2.5 или 1.2.6 агрегаты обмакнуть в стерильную марлю для впитывания поверхностной влаги перед имплантацией. Поместите заполнители в область и слегка надавите, чтобы заполнить дефект.
  5. Замените кожу после вытягивания, чтобы убедиться, что имплантат зафиксирован. Закройте разрез 1/2, 4 × 10 угловыми швами и 4-0 швами.
  6. После операции поместите животных на согревающее одеяло, пока они не станут активными, а затем верните их в клетку.
    Примечание: Животных нельзя оставлять без присмотра до тех пор, пока они не придут в сознание, достаточное для поддержания лежачего положения на грудине. Животные, перенесшие операцию, не возвращаются в компанию других животных до полного выздоровления.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Агрегаты могут быть успешно построены из UCMSC в соответствии с экспериментальным рабочим процессом (рис. 1). Качество агрегатов должно быть оценено перед использованием с помощью морфологического наблюдения и гистологического анализа. Сформирова?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

С развитием биотехнологии тканевой инженерии многие ученые сосредоточили внимание многих ученых на стратегиях создания имплантируемой структуры с высокой пластичностью, содержащей долговременно выживающие клетки, способные достичь оптимальной регенерации. В нас?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Раскрытие информации

У авторов нет конфликта интересов, который можно было бы раскрыть.

Благодарности

Эта работа была поддержана грантами Национального фонда естественных наук Китая (81930025, 82100969 и 82071075) и Национальной программы ключевых исследований и разработок Китая (2022YFA1104400 и 2021YFA1100600). Мы благодарны за помощь Национальному экспериментальному учебно-демонстрационному центру фундаментальной медицины (АМФУ).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
0.25% Trypsin-EDTA (1x)SigmaT4049Cell passage
Automatic Dehydration MachineLEICAASP200sDehydrate aggregate
CentrifugeEppendorf5418RCentrifugation
Centrifuge tubeThermo Nunc339650Centrifugation
Culture dishThermo150466Culture of UCMSCs
EthanolSCR10009218Dehydrate aggregate
Fatal bovine serumSijiqing11011-8611Culture of UCMSCs
ForcepJZJD1080Harvest aggregate
GlutaraldehydeProandy10217-1Fixation of aggregate
Hematoxylin and Eosin Staining KitbeyotimeC0105SHE staining
HexamethyldisilazaneSCR80068416Dry aggregate surface
Hoechst33342Sigma14533Cell nuclei stain
L-glutamineSigmaG5792Culture of UCMSCs
Live/dead Viability/Cytotoxicity Kit InvitrogenL3224Live/dead cell stain
Masson's Staining KitZHCCD069Masson Staining
Minimum Essential Medium Alpha basic (1x)GibcoC12571500BTCulture of UCMSCs
ParaffinLeica39601006Tissue embedding
ParaformaldehydeSaint-BioD16013Fixation of aggregate
PBS (1x)MeilunbioMA0015Resuspend and purify UCMSCs
Penicillin/StreptomycinProcell Life SciencePB180120Culture of UCMSCs
Pentobarbital sodiumSigmaP3761Animal anesthesia
PolysporinPfizerPrevent eye dry
Scanning Electron MicroscopeHitachis-4800SEM observation
ScissorJZY00030Animal surgical incision
Six-well plateThermo140675Culture of UCMSCs
StitchJinhuanF603Close wounds
SutureXy4-0Close wounds
Thermostatic equipmentGrantv-0001-0005Water bath
UCMSCsBai'ao UKK220201Commercially UCMSCs
Vitamin CDiyibioDY40138-25gAggregate inducing
XyleneSCR10023418Dehydrate aggregate

Ссылки

  1. Hall, B. K., Miyake, T. Divide, accumulate, differentiate: cell condensation in skeletal development revisited. The International Journal of Developmental Biology. 39 (6), 881-893 (1995).
  2. Hall, B. K., Miyake, T. All for one and one for all: condensations and the initiation of skeletal development. Bioessays. 22 (2), 138-147 (2000).
  3. Salhotra, A., Shah, H. N., Levi, B., Longaker, M. T. Mechanisms of bone development and repair. Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 21 (11), 696-711 (2020).
  4. Mammoto, T., et al. Mechanochemical control of mesenchymal condensation and embryonic tooth organ formation. Developmental Cell. 21 (4), 758-769 (2011).
  5. Khanarian, N. T., Jiang, J., Wan, L. Q., Mow, V. C., Lu, H. H. A hydrogel-mineral composite scaffold for osteochondral interface tissue engineering. Tissue Engineering. Part A. 18 (5-6), 533-545 (2012).
  6. Liu, M., et al. Injectable hydrogels for cartilage and bone tissue engineering. Bone Research. 5, 17014(2017).
  7. Ai, C., et al. Osteochondral tissue engineering: Perspectives for clinical application and preclinical development. Journal of Orthopaedic Translatation. 30, 93-102 (2021).
  8. Huang, X., et al. Microenvironment influences odontogenic mesenchymal stem cells mediated dental pulp regeneration. Frontiers in Physiology. 12, 656588(2021).
  9. Li, M., Ma, J., Gao, Y., Yang, L. Cell sheet technology: a promising strategy in regenerative medicine. Cytotherapy. 21 (1), 3-16 (2019).
  10. An, Y., et al. marrow mesenchymal stem cell aggregate: an optimal cell therapy for full-layer cutaneous wound vascularization and regeneration. Scientific Reports. 5, 17036(2015).
  11. Miura, M., et al. SHED: stem cells from human exfoliated deciduous teeth. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100 (10), 5807-5812 (2003).
  12. Gronthos, S., et al. Stem cell properties of human dental pulp stem cells. Journal of Dental Research. 81 (8), 531-535 (2002).
  13. Chen, H., et al. Regeneration of pulpo-dentinal-like complex by a group of unique multipotent CD24a(+) stem cells. Science Advances. 6 (15), (2020).
  14. Yang, T., et al. hDPSC-laden GelMA microspheres fabricated using electrostatic microdroplet method for endodontic regeneration. Materials Science & Engineering. C: Materials for Biological Applications. 121, 111850(2021).
  15. Foty, R. A simple hanging drop cell culture protocol for generation of 3D spheroids. Journal of Visualized Experiments. (51), 2720(2011).
  16. Nakao, K., et al. The development of a bioengineered organ germ method. Nature Methods. 4 (3), 227-230 (2007).
  17. Hasani-Sadrabadi, M. M., et al. An engineered cell-laden adhesive hydrogel promotes craniofacial bone tissue regeneration in rats. Science Translational Medicine. 12 (534), (2020).
  18. Fan, L., et al. Gravitational sedimentation-based approach for ultra-simple and flexible cell patterning coculture on microfluidic device. Biofabrication. 12 (3), 035005(2020).
  19. Singh, R., et al. Cell specificity of magnetic cell seeding approach to hydrogel colonization. Journal of Biomedical Materials Research: Part A. 105 (11), 2948-2957 (2017).
  20. Guo, H., et al. Odontogenesis-related developmental microenvironment facilitates deciduous dental pulp stem cell aggregates to revitalize an avulsed tooth. Biomaterials. 279, 121223(2021).
  21. Xuan, K., et al. Deciduous autologous tooth stem cells regenerate dental pulp after implantation into injured teeth. Science Translational Medicine. 10 (455), (2018).
  22. Sui, B. D., et al. Stem cell-based bone regeneration in diseased microenvironments: Challenges and solutions. Biomaterials. 196, 18-30 (2019).
  23. Shang, F., et al. Human umbilical cord MSCs as new cell sources for promoting periodontal regeneration in inflammatory periodontal defect. Theranostics. 7 (18), 4370-4382 (2017).
  24. Arnold, A. M., Holt, B. D., Daneshmandi, L., Laurencin, C. T., Sydlik, S. A. Phosphate graphene as an intrinsically osteoinductive scaffold for stem cell-driven bone regeneration. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (11), 4855-4860 (2019).
  25. Wu, M., et al. SHED aggregate exosomes shuttled miR-26a promote angiogenesis in pulp regeneration via TGF-beta/SMAD2/3 signalling. Cell Proliferation. 54 (7), e13074(2021).
  26. Li, Z., et al. Apoptotic vesicles activate autophagy in recipient cells to induce angiogenesis and dental pulp regeneration. Molecular Therapy. 30 (10), 3193-3208 (2022).
  27. Vogel, V. Unraveling the mechanobiology of extracellular matrix. Annual Review of Physiology. 80, 353-387 (2018).
  28. Huebsch, N., et al. Harnessing traction-mediated manipulation of the cell/matrix interface to control stem-cell fate. Nature Materials. 9 (6), 518-526 (2010).
  29. Shuai, Y., et al. Melatonin treatment improves mesenchymal stem cells therapy by preserving stemness during long-term in vitro expansion. Theranostics. 6 (11), 1899-1917 (2016).
  30. Sui, B. D., Zhu, B., Hu, C. H., Zhao, P., Jin, Y. Reconstruction of regenerative stem cell niche by cell aggregate engineering. Methods in Molecular Biology. 2002, 87-99 (2019).
  31. Wei, F., et al. Vitamin C treatment promotes mesenchymal stem cell sheet formation and tissue regeneration by elevating telomerase activity. Journal of Cellular Physiology. 227 (9), 3216-3224 (2012).
  32. de Clerck, Y. A., Jones, P. A. The effect of ascorbic acid on the nature and production of collagen and elastin by rat smooth-muscle cells. The Biochemical Journal. 186 (1), 217-225 (1980).
  33. Fujisawa, K., et al. Evaluation of the effects of ascorbic acid on metabolism of human mesenchymal stem cells. Stem Cell Research & Therapy. 9 (1), 93(2018).
  34. Wang, T., et al. The histone demethylases Jhdm1a/1b enhance somatic cell reprogramming in a vitamin-C-dependent manner. Cell Stem Cell. 9 (6), 575-587 (2011).
  35. Sun, J., et al. Osthole improves function of periodontitis periodontal ligament stem cells via epigenetic modification in cell sheets engineering. Scientific Reports. 7 (1), 5254(2017).
  36. Wang, Y. J., et al. Resveratrol enhances the functionality and improves the regeneration of mesenchymal stem cell aggregates. Experimental and Molecular. 50 (6), 1-15 (2018).
  37. Shang, F., et al. The effect of licochalcone A on cell-aggregates ECM secretion and osteogenic differentiation during bone formation in metaphyseal defects in ovariectomized rats. Biomaterials. 35 (9), 2789-2797 (2014).
  38. Dissanayaka, W. L., Zhu, L., Hargreaves, K. M., Jin, L., Zhang, C. Scaffold-free prevascularized microtissue spheroids for pulp regeneration. Journal of Dental Research. 93 (12), 1296-1303 (2014).
  39. Dissanayaka, W. L., Zhu, L., Hargreaves, K. M., Jin, L., Zhang, C. In vitro analysis of scaffold-free prevascularized microtissue spheroids containing human dental pulp cells and endothelial cells. Journal of Endodontics. 41 (5), 663-670 (2015).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены