בנייה, אפיון ויישום רגנרטיבי של אגרגטים של תאי גזע מזנכימליים אנושיים בהרכבה עצמית

Shijie Li; Peisheng Liu; Ting Zhu; Bingdong Sui; Yan Jin; Kun Xuan; Chenxi Zheng

doi:10.3791/64697

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

Summary

מחקר זה מתאר שיטה לבניית אגרגטים המבוססת על הרכבה עצמית של תאי גזע מזנכימליים אנושיים ומזהה את המאפיינים המורפולוגיים וההיסטולוגיים לטיפול רגנרטיבי בפגמים בעצמות הגולגולת.

Abstract

תאי גזע מזנכימליים (MSCs), המאופיינים ביכולת ההתחדשות העצמית שלהם ובפוטנציאל ההתמיינות הרב-שושלתית, יכולים להיגזר ממקורות שונים ומסתמנים כמועמדים מבטיחים לרפואה רגנרטיבית, במיוחד להתחדשות השן, העצם, הסחוס והעור. גישת ההרכבה העצמית של צבירת MSC, הבונה באופן בולט אשכולות תאים המחקים את העיבוי המזנכימלי המתפתח, מאפשרת אספקת תאי גזע בצפיפות גבוהה יחד עם אינטראקציות תא-תא משומרות ומטריצה חוץ-תאית (ECM) כנישת מיקרו-סביבה. שיטה זו הוכחה כמאפשרת השתלת תאים והישרדות יעילה, ובכך מקדמת יישום אופטימלי של MSCs אקסוגניים בהנדסת רקמות ושמירה על התחדשות איברים קליניים. מאמר זה מספק פרוטוקול מפורט לבנייה ואפיון של אגרגטים בהרכבה עצמית המבוססים על תאי גזע מזנכימליים של חבל הטבור (UCMSC), כמו גם דוגמה ליישום התחדשות עצם הגולגולת. יישום הליך זה יסייע בהקמת אסטרטגיית השתלת MSC יעילה להנדסת רקמות ורפואה רגנרטיבית.

Introduction

עיבוי תאי גזע מזנכימליים (MSC) הוא שלב חיוני להבטחת צמיחה והתפתחות תקינה של הגוף באורגנוגנזה מוקדמת ^1,2, במיוחד ביצירת עצם, סחוס, שיניים ועור ^1,3,4. בעשורים האחרונים, טיפולי הנדסת רקמות באמצעות MSCs מתורבתים לאחר הלידה בשילוב עם פיגומים מתכלים עשו התקדמות חשובה^{ב-Osteogenic 5} ובהתחדשות סחוסית⁶. עם זאת, לשימוש בפיגומים עשויים להיות כמה חסרונות, כגון דחייה חיסונית, כמו גם זיקה תאית נמוכה ופלסטיות⁷. בהקשר זה, חקרנו את ההיתכנות של יישום שיטת תרבית תאים ספרואידית כדי לספק אגרגטים בהרכבה עצמית ללא פיגומים המחקים את תופעת העיבוי המתפתחת, המכילים רק MSCs ואת המטריצה החוץ-תאית המופקדת (ECM)⁸. היווצרות אגרגטים מגבירה את הפלסטיות האפליקטיבית כדי להתאים לצורת הפגם ומונעת השתלת פיגומים ועיכול על ידי אנזימים פרוטאוליטיים כדי לקצור MSCs להשתלה⁹.

אגרגטים של MSC שימשו באופן נרחב להתחדשות העצם, עיסת השיניים, פריודונטיום ועור¹⁰, בין רקמות ואיברים אחרים. ניתן לבחור סוגים רבים ושונים של MSCs כמועמדים לתאי זרע, כולל אך לא רק MSCs של מח עצם (BMMSCs), MSCs של חבל הטבור (UCMSC), תאי סטרומה שמקורם ברקמת שומן (ADSCs) ו-MSCs דנטליים (למשל, תאי גזע מזנכימליים של מוך השיניים [DPSCs], תאי גזע מזנכימליים משיני החלב [SHED]¹¹, ותאי גזע מזנכימליים חניכיים [PDLSCs])¹². טכנולוגיות רבות לאשכולות תאים תלת מימדיים פותחו בעשור האחרון, כולל צבירה בסיוע והרכבה עצמית. עם זאת, גישות צבירה בסיוע לרוב חלשות בייצור ECMs ויצירת אגרגטים הומוגניים ומהודקים, ולכן אינן מתאימות לחיקוי תנאים פיזיולוגיים 13,14,15. יתר על כן, חלק משיטות הצבירה המסייעות דורשות אינטראקציות תא-חומר כדי ליצור מבנים יציבים 16,17,18,19, בעוד ששיטת צבירה בהרכבה עצמית זו זמינה בדרך כלל עבור מגוון רחב של MSCs. יש לציין כי בניסויים הקליניים האחרונים שלנו, אגרגטים MSC שימשו בהצלחה לחידוש קומפלקס מוך השן והחניכיים לאחר השתלה בשיניים חותכות אנושיות פצועות, שהשיגו התחדשות רקמות דה נובו עם מבנה ותפקוד פיזיולוגיים^20,21.

מאמר זה מספק הליך יסודי לבנייה ואפיון אגרגטים של MSC, כמו גם השתלת in vivo . גישה זו תמשוך את תשומת ליבם של חוקרים כאשר הם שואפים לתקן פגמים ברקמות, כגון השיניים, העצם, הסחוס והעור, על סמך יישומי תאי גזע. שיטה זו פשוטה, נוחה ומורכבת לחלוטין מתאים ו-ECM ללא פיגומים נוספים, אותם ניתן לתרבת לאורך זמן לקבלת אגרגטים צפופים ויציבים²². בינתיים, האגרגטים המתורבתים בדרך זו עשירים ב-ECM, המחקה את הנישה המתפתחת עבור תאים בצפיפות גבוהה אלה ובכך מקדם התחדשות רקמות²³. ניתן לחלק את תהליך הבנייה לשני שלבים: הכנת תאים ותרבית, והרכבה עצמית וקציר של אגרגטים של תאים. אפיון האגרגטים כולל זיהוי מורפולוגי באמצעות מיקרוסקופ אופטי הפוך ומיקרוסקופ אלקטרונים סורק (SEM), וניתוח היסטולוגי באמצעות המטוקסילין ואאוזין (HE) וצביעה של מאסון. האגרגטים שנוצרו הודגמו להשתלה רגנרטיבית לתיקון הפגם בעצם הגולגולת. יישום הליך זה יסייע בהקמת אסטרטגיית השתלת MSC יעילה להנדסת רקמות ורפואה רגנרטיבית.

Protocol

הערה: כל ההליכים בבעלי חיים אושרו על ידי הוועדה לטיפול ושימוש בבעלי חיים של האוניברסיטה הרפואית הצבאית הרביעית ובוצעו בהתאם למדריך המכונים הלאומיים לבריאות לטיפול ושימוש בחיות מעבדה. UCMSCs אנושיים שמורים בהקפאה שהתקבלו ממקור מסחרי שימשו למחקר הנוכחי (ראה טבלת חומרים). השימוש בתאים אנושיים אושר על ידי ועדת האתיקה של האוניברסיטה הצבאית הרביעית לרפואה UCMSCs נלקחו כדוגמה לתיאור ההליך. הפגם בגולגולת נלקח כדוגמה להצגת הצורך בתיקון כדי לתאר את הליך ההשתלה. כל הניסויים חזרו על עצמם שלוש פעמים.

1. בניית אגרגטים של UCMSC

הכנה ותרבות של UCMSCs
1. הוסף 10 מ"ל של מי מלח מחוממים מראש (PBS) לצינור צנטריפוגלי חדש של 15 מ"ל בארון בטיחות ביולוגית סטרילי.
2. הסר את צינור ההקפאה המכיל UCMSCs קפואים מחנקן נוזלי והנח אותו במהירות באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס. יש לנער את השפופרת בעדינות כדי להקל על הפשרת תאים מהירה ויסודית.
  זהירות: יש לסיים את כל ההליך תוך דקה אחת, מכיוון שדימתיל סולפוקסיד (DMSO) בתמיסת ההקפאה עלול לגרום לציטוטוקסיות.
3. השעו מעט את התאים בצינור ההקפאה והעבירו את כל התוכן לצינור הצנטריפוגה המכיל 10 מ"ל PBS (שלב 1.1.1). צנטריפוגה את הדגימה ב 100 × גרם למשך 5 דקות. השליכו את הסופרנטנט ושטפו את התאים עם 10 מ"ל PBS.
4. צנטריפוגה את הדגימה ב 100 × גרם למשך 5 דקות. השליכו את הסופרנטנט והשעו בעדינות את התאים עם מדיום חיוני אלפא מינימלי (α-MEM) המכיל 10% סרום בקר עוברי (FBS), 1% פניצילין-סטרפטומיצין ו-584 מ"ג/ליטר גלוטמין.
5. זרעו את התאים התלויים בצלחות תרבית של 10 ס"מ (לרוב צלחת אחת עד שתיים לצינור אחד, תלוי בכמות התאים הכוללת לאחר צנטריפוגה, בצפיפות של 5 × 10⁶ תאים למנה). הוסף מדיום α-MEM שלם בכלים לנפח כולל של 10 מ"ל.
6. נענע בעדינות את הכלים כדי להפיץ את התאים. דגרו את הכלים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5%_CO2 בתא לח. לאחר דגירה של לילה, השליכו את המדיום הסופרנטנט והוסיפו 5 מ"ל של PBS 1-2x כדי להסיר את התאים הלא נצמדים. הוסף 10 מ"ל של מדיום α-MEM שלם טרי. החלף את המדיה התרבותית כל יומיים.
7. למעבר תאים, כאשר התאים מגיעים למפגש של 80%-90%, השליכו את הסופרנטנט ושטפו את התאים עם 5 מ"ל PBS כדי להסיר את המדיום ביסודיות. דגרו את התאים ב-2 מ"ל של 0.25% טריפסין-1 מ"מ חומצה אתילנדיאמינטטראצטית (EDTA) ב-37 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות.
8. כאשר התאים נעשים עגולים עם צמתים בין-תאיים שבורים תחת מיקרוסקופ, הפרד את התאים מהכלים ללא הפרעה רבה מדי למבנה התא. נטרל את הטריפסין על ידי הוספת 4 מ"ל של מדיום α-MEM שלם.
9. אוספים את התאים מהכלים שוב ושוב ובעדינות על ידי פיפטינג בצינור צנטריפוגה טרי של 15 מ"ל. צנטריפוגה את הדגימה ב 100 × גרם למשך 5 דקות. השליכו את הסופרנטנט, השעו מחדש את התאים במדיום α-MEM מלא, וזרעו אותם בכלי תרבית טריים או בצלחות באר. החלף את המדיה התרבותית כל יומיים.
  הערה: על פי גודל שטח הפגם, פגם בגודל 25 מ"מ³ מחייב שימוש בבאר של תאי צלחת 6 בארות שגודלו ליצירת אגרגטים.
היווצרות וקציר אגרגטים
1. הכן מדיה מעוררת אגרגציה של תאים על ידי הוספת 50 מיקרוגרם/מ"ל ויטמין C ל-α-MEM עם 10% FBS, 1% פניצילין-סטרפטומיצין ו-584 מ"ג/ליטר גלוטמין.
  אזהרה: יש להימנע מחשיפה ישירה לאור בעת שימוש בוויטמין C, מכיוון שוויטמין C מתחמצן כאשר הוא נחשף לאור והופך ללא יעיל.
2. כאשר התאים בשלב 1.1.12 מגיעים למפגש של 95% (איור משלים S1), שנה את המדיה למדיה מעוררת צבירה של תאים; החלף מדיה חדשה הגורמת לצבירה של תאים כל יומיים.
3. לאחר 7-10 ימים של זירוז (משך זמן ההשראה תלוי בסוגי תאי הגזע ולעתים קרובות הוא ~7 ימים עבור קצה ה-UCMSC), חפש אגרגטים מעוצבים מתחת למיקרוסקופ, עם קצוות עבים מופרדים מתחתית הצלחת.
4. השליכו את אמצעי התרבות ושטפו בעדינות את התאים פעמיים עם PBS. דחף בעדינות את האגרגטים מהקצה לאמצע בעזרת מלקחיים סטריליים קטנים, וקפל את האגרגטים.
5. במקרים מסוימים, UCMSCs יכולים להתכרבל באופן ספונטני לכיוון המרכז כדי ליצור עיבוי מוצק. מבנה זה שווה ערך לאגרגט שהתקבל בשלב 1.2.4.

2. זיהוי מורפולוגי של אגרגטים

תצפית כללית ומיקרוסקופית
1. שימו לב שהאגרגטים צפופים ומשולבים ואינם נפגעים בקלות מכוחות מכניים, כגון משיכה במהלך ניתוק והשתלה.
2. תחת מיקרוסקופ, חפש מבנה דמוי קרום בעובי מסוים עם דפוס ארוג.
צביעת תאים חיים/מתים
1. זרע את התאים בצלחת 6 בארות בצפיפות של 1 × 10⁶ תאים לבאר.
2. הכן תמיסת עבודה של 2 מיקרומטר קלצין AM ו-4 מיקרומטר EthD-1 ושימוש ב-PBS.
3. הוסף 0.3% טריטון לתאים למשך 5 דקות, שטוף עם PBS שלוש פעמים כדי לגרום לתאים למוות, כבקרה על צביעה.
4. שטפו את התאים, האגרגטים והתאים המעוררים מתים עם PBS פעמיים.
5. הוסף 100 מיקרוליטר PBS ו -100 מיקרוליטר תמיסת צביעה מוכנה בשלב 2.2.2 לכל באר.
6. דגרו את הדגימה למשך 30 דקות ב-RT. שטפו את הדגימה עם PBS פעמיים.
7. הוסף 200 מיקרוליטר של 10 מיקרוגרם/מ"ל Hoechst לכל באר ודגר את הדגימה למשך 5 דקות ב-RT. Wah הדגימה עם PBS פעמיים.
8. התבונן תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי.
תצפית SEM
1. זרע וגרם לתא את האגרגטים שהתקבלו בשלב 1.2.4 או 1.2.5. שטפו את התאים עם PBS לאחר היווצרות האגרגטים בשלב 1.2.4. או 1.2.5.
2. תקן את התאים באמצעות גלוטרלדהיד למשך 4 שעות לפחות.
3. שטפו את הדגימות עם PBS, ואז יבשו דרך ריכוז שיפוע של אתנול מ-30%, 50%, 70%, 80%, 90% עד 100%, כל אחד למשך 5 דקות. טפל פי 2 באתנול נטול מים.
4. טבלו את האגרגטים ב -3 מ"ל של hexamethyldisilazane למשך 30 דקות. שאפו את כל הנוזלים וייבשו היטב את הדגימות באופן טבעי.
  זהירות: כל התהליך צריך להתבצע במכסה אדים מכיוון שהקסמתילדיזילזאן הוא נדיף ורעיל מאוד.
5. הדביקו את הדגימות המיובשות על שולחן הדגימה בעזרת סרט פחמן דו צדדי ומצפים את המשטח במתכת. אחסן את הדגימה בטמפרטורת החדר (RT) למשך מספר ימים.
6. התבונן תחת SEM.
  1. החלף את הדגימה בתוך המכונה. כוונן את המכונהtage ל-5 k, ואת אורך המוקד ל-~12 מ"מ. כוונן את סרגל המיקוד עד להופעת תמונה ברורה.
  2. צלם את התמונות בהגדלה נמוכה. התאם את ההגדלה והמיקוד מחדש כדי לקבל תמונה בהגדלה גבוהה יותר.
    זהירות: לא ניתן לגעת במשטח האגרגטים לפני התצפית כדי למנוע הרס של מורפולוגיה פני השטח.

3. ניתוח היסטולוגי של אגרגטים

קיבוע וחתך של דוגמאות
1. תקן את האגרגטים שהתקבלו בשלב 1.2.4 או 1.2.5 עם 4% פרפורמלדהיד ב-4 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות לפחות. לאחר הקיבוע יש לשטוף עם PBS ולהניח את הדגימה לקלטות הטמעה למשך הלילה לשטיפה במים זורמים.
2. ייבשו את הדגימות באמצעות מכונות התייבשות אוטומטיות באמצעות אתנול שיפוע, קסילן ופרפין, בהתאם להוראות היצרן. התהליך כולו הוא כדלקמן: 85% אתנול למשך שעתיים ב-RT, 95% אתנול למשך שעתיים ב-RT, 95% אתנול למשך שעתיים ב-RT, 100% אתנול למשך שעתיים ב-RT, 100% אתנול למשך 1.5 שעות ב-RT, קסילן למשך 45 דקות ב-RT, קסילן למשך 45 דקות ב-RT, פרפין למשך 30 דקות ב-RT, פרפין למשך שעה וחצי ב-RT, ולבסוף פרפין למשך שעתיים ב-60 מעלות צלזיוס.
3. הטמיעו את הדגימות בפרפין. הכינו חלקים בעובי של כ-5 מיקרומטר, הדביקו אותם לשקופיות קטיוניות וייבשו את השקופיות למשך שעתיים בטמפרטורה של 45 מעלות צלזיוס.
4. מסירים שעווה ברצף דרך קסילן למשך 15 דקות, פעמיים ו-100%, 90%, 80% ו-70% אתנול (כל אחד למשך 5 דקות).
5. שטפו לאט את המגלשות 3 פעמים במים זורמים למשך 5 דקות.
הוא מכתים
1. מכתימים בהמטוקסילין למשך 3-5 דקות, שוטפים במים ומסירים בזהירות עודפי נוזלים סביב הרקמה.
2. יש לחלק עם אתנול המכיל 1% חומצה הידרוכלורית למשך 3-5 שניות ולשטוף במים זורמים, במהלכם הצבע הופך מעט בהיר וכחול. הסר עודפי מים סביב הרקמה.
3. מכתימים באאוזין למשך דקה, שוטפים במים זורמים ומסירים עודפי נוזלים סביב הרקמה.
4. יש לייבש עם 70%, 80%, 90% ו-100% אתנול למשך 10 שניות כל אחד, קסילן למשך 15 דקות, פעמיים, ולייבש באופן טבעי במכסה המנוע לפני איטום הסדין.
5. הוסף טיפות שרף ניטרליות ואטום את השקופיות עם כיסויים. התבוננו במיקרוסקופ אור.
צביעת הטריכרום של מאסון
1. מכתימים עם המטוקסילין ברזל של Weigert למשך 5 דקות, שוטפים במים ומנגבים יבשים.
2. יש לחלק עם אתנול המכיל 1% חומצה הידרוכלורית למשך 3-5 שניות ולשטוף במים זורמים, במהלכם הצבע הופך מעט בהיר וכחול. נגב את המשטח יבש.
3. מכתימים בתמיסת מג'נטה חומצית אדומה של Lixin למשך 5-10 דקות ושוטפים במהירות במים מזוקקים.
4. טפל בתמיסה מימית של חומצה פוספומוליבדית למשך 3-5 דקות.
5. יש לצבוע מחדש ישירות בתמיסה כחולה אנילין למשך 5 דקות ללא שטיפה במים.
6. טפל בחומצה אצטית קרחונית 1% למשך דקה אחת.
7. יש לייבש עם 70%, 80%, 90% ו-100% אתנול למשך 10 שניות כל אחד, קסילן למשך 15 דקות, פעמיים, ולייבש באופן טבעי במכסה המנוע לפני איטום הסדין.
8. הוסף טיפות שרף ניטרליות ואטום את השקופיות עם כיסויים. התבוננו במיקרוסקופ אור.

4. השתלה

להרדים את העכבר העירום על ידי הזרקה תוך צפקית של 50 מ"ג/ק"ג נתרן פנטוברביטל.
הערה: ודא שהעכברים מורדמים כראוי על סמך היעדר רפלקס קרנית ותגובת גפיים כאשר כרית כף הרגל נצבטת. יש למרוח משחת עיניים למניעת יובש.
גזרו חתך רוחבי (~3-4 ס"מ) בעור מאחורי אוזני העכבר העירום בעזרת מספריים קטנים וסטריליים לאחר חיטוי ביודופור.
משוך את העור קדימה כדי לחשוף את הגולגולת. צייר קלות את שולי אזור הפגם המתוכנן בעזרת להב 11# והסר את שבר העצם. אזור הפגם הוא שטח עגול בקוטר של כ -4 מ"מ. השתמש במי מלח כדי לשטוף את הפצע ולספק המוסטזיס מתאים.
טבלו את האגרגטים שהתקבלו בשלב 1.2.5 או 1.2.6 בגזה סטרילית כדי לספוג לחות פני השטח לפני ההשתלה. מניחים את האגרגטים באזור ולוחצים מעט כדי למלא את הפגם.
החלף את העור לאחר המשיכה כדי לוודא שהשתל מקובע. סגור את החתך עם 1/2, 4 × 10 תפרים זוויתיים ו-4-0 תפרים.
לאחר הניתוח, הניחו את בעלי החיים על שמיכת החימום עד שהם פעילים ולאחר מכן החזירו אותם לכלוב.
הערה: אסור להשאיר את בעלי החיים ללא השגחה עד שהם חוזרים להכרה מספקת כדי לשמור על שכיבה על החזה. בעלי החיים שעברו ניתוח אינם מוחזרים לחברת בעלי חיים אחרים עד להחלמתם המלאה.

תוצאות

ניתן לבנות בהצלחה אגרגטים מ-UCMSCs בהתאם לזרימת העבודה הניסויית (איור 1). יש להעריך את איכות האגרגטים לפני השימוש, באמצעות תצפית מורפולוגית וניתוח היסטולוגי. המבנה הלמלרי שנוצר צריך להיות שלם וצפוף, כאשר התאים שזורים זה בזה ליצירת תבנית ארוגה על ידי תצפ?...

Discussion

עם ההתקדמות של ביוטכנולוגיה של הנדסת רקמות, אסטרטגיות לבניית מבנה מושתל עם פלסטיות גבוהה ומכיל תאים ששורדים לטווח ארוך שיכולים להשיג התחדשות אופטימלית היו המוקד של מדענים רבים. ישנן מגוון שיטות השתלה עדכניות של MSCs, כגון שיטות תאים בלבד, פיגומים המשלימים עם ציטוקינים

Disclosures

למחברים אין ניגודי אינטרסים לחשוף.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מהקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (81930025, 82100969 ו-82071075) ותוכנית המחקר והפיתוח הלאומית של סין (2022YFA1104400 ו-2021YFA1100600). אנו אסירי תודה על הסיוע של המרכז הלאומי להדגמת הוראה ניסויית לרפואה בסיסית (AMFU).

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% Trypsin-EDTA (1x)	Sigma	T4049	Cell passage
Automatic Dehydration Machine	LEICA	ASP200s	Dehydrate aggregate
Centrifuge	Eppendorf	5418R	Centrifugation
Centrifuge tube	Thermo Nunc	339650	Centrifugation
Culture dish	Thermo	150466	Culture of UCMSCs
Ethanol	SCR	10009218	Dehydrate aggregate
Fatal bovine serum	Sijiqing	11011-8611	Culture of UCMSCs
Forcep	JZ	JD1080	Harvest aggregate
Glutaraldehyde	Proandy	10217-1	Fixation of aggregate
Hematoxylin and Eosin Staining Kit	beyotime	C0105S	HE staining
Hexamethyldisilazane	SCR	80068416	Dry aggregate surface
Hoechst33342	Sigma	14533	Cell nuclei stain
L-glutamine	Sigma	G5792	Culture of UCMSCs
Live/dead Viability/Cytotoxicity Kit	Invitrogen	L3224	Live/dead cell stain
Masson's Staining Kit	ZHC	CD069	Masson Staining
Minimum Essential Medium Alpha basic (1x)	Gibco	C12571500BT	Culture of UCMSCs
Paraffin	Leica	39601006	Tissue embedding
Paraformaldehyde	Saint-Bio	D16013	Fixation of aggregate
PBS (1x)	Meilunbio	MA0015	Resuspend and purify UCMSCs
Penicillin/Streptomycin	Procell Life Science	PB180120	Culture of UCMSCs
Pentobarbital sodium	Sigma	P3761	Animal anesthesia
Polysporin	Pfizer		Prevent eye dry
Scanning Electron Microscope	Hitachi	s-4800	SEM observation
Scissor	JZ	Y00030	Animal surgical incision
Six-well plate	Thermo	140675	Culture of UCMSCs
Stitch	Jinhuan	F603	Close wounds
Suture	Xy	4-0	Close wounds
Thermostatic equipment	Grant	v-0001-0005	Water bath
UCMSCs	Bai'ao	UKK220201	Commercially UCMSCs
Vitamin C	Diyibio	DY40138-25g	Aggregate inducing
Xylene	SCR	10023418	Dehydrate aggregate

References

Hall, B. K., Miyake, T. Divide, accumulate, differentiate: cell condensation in skeletal development revisited. The International Journal of Developmental Biology. 39 (6), 881-893 (1995).
Hall, B. K., Miyake, T. All for one and one for all: condensations and the initiation of skeletal development. Bioessays. 22 (2), 138-147 (2000).
Salhotra, A., Shah, H. N., Levi, B., Longaker, M. T. Mechanisms of bone development and repair. Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 21 (11), 696-711 (2020).
Mammoto, T., et al. Mechanochemical control of mesenchymal condensation and embryonic tooth organ formation. Developmental Cell. 21 (4), 758-769 (2011).
Khanarian, N. T., Jiang, J., Wan, L. Q., Mow, V. C., Lu, H. H. A hydrogel-mineral composite scaffold for osteochondral interface tissue engineering. Tissue Engineering. Part A. 18 (5-6), 533-545 (2012).
Liu, M., et al. Injectable hydrogels for cartilage and bone tissue engineering. Bone Research. 5, 17014 (2017).
Ai, C., et al. Osteochondral tissue engineering: Perspectives for clinical application and preclinical development. Journal of Orthopaedic Translatation. 30, 93-102 (2021).
Huang, X., et al. Microenvironment influences odontogenic mesenchymal stem cells mediated dental pulp regeneration. Frontiers in Physiology. 12, 656588 (2021).
Li, M., Ma, J., Gao, Y., Yang, L. Cell sheet technology: a promising strategy in regenerative medicine. Cytotherapy. 21 (1), 3-16 (2019).
An, Y., et al. marrow mesenchymal stem cell aggregate: an optimal cell therapy for full-layer cutaneous wound vascularization and regeneration. Scientific Reports. 5, 17036 (2015).
Miura, M., et al. SHED: stem cells from human exfoliated deciduous teeth. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100 (10), 5807-5812 (2003).
Gronthos, S., et al. Stem cell properties of human dental pulp stem cells. Journal of Dental Research. 81 (8), 531-535 (2002).
Chen, H., et al. Regeneration of pulpo-dentinal-like complex by a group of unique multipotent CD24a(+) stem cells. Science Advances. 6 (15), (2020).
Yang, T., et al. hDPSC-laden GelMA microspheres fabricated using electrostatic microdroplet method for endodontic regeneration. Materials Science & Engineering. C: Materials for Biological Applications. 121, 111850 (2021).
Foty, R. A simple hanging drop cell culture protocol for generation of 3D spheroids. Journal of Visualized Experiments. (51), 2720 (2011).
Nakao, K., et al. The development of a bioengineered organ germ method. Nature Methods. 4 (3), 227-230 (2007).
Hasani-Sadrabadi, M. M., et al. An engineered cell-laden adhesive hydrogel promotes craniofacial bone tissue regeneration in rats. Science Translational Medicine. 12 (534), (2020).
Fan, L., et al. Gravitational sedimentation-based approach for ultra-simple and flexible cell patterning coculture on microfluidic device. Biofabrication. 12 (3), 035005 (2020).
Singh, R., et al. Cell specificity of magnetic cell seeding approach to hydrogel colonization. Journal of Biomedical Materials Research: Part A. 105 (11), 2948-2957 (2017).
Guo, H., et al. Odontogenesis-related developmental microenvironment facilitates deciduous dental pulp stem cell aggregates to revitalize an avulsed tooth. Biomaterials. 279, 121223 (2021).
Xuan, K., et al. Deciduous autologous tooth stem cells regenerate dental pulp after implantation into injured teeth. Science Translational Medicine. 10 (455), (2018).
Sui, B. D., et al. Stem cell-based bone regeneration in diseased microenvironments: Challenges and solutions. Biomaterials. 196, 18-30 (2019).
Shang, F., et al. Human umbilical cord MSCs as new cell sources for promoting periodontal regeneration in inflammatory periodontal defect. Theranostics. 7 (18), 4370-4382 (2017).
Arnold, A. M., Holt, B. D., Daneshmandi, L., Laurencin, C. T., Sydlik, S. A. Phosphate graphene as an intrinsically osteoinductive scaffold for stem cell-driven bone regeneration. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (11), 4855-4860 (2019).
Wu, M., et al. SHED aggregate exosomes shuttled miR-26a promote angiogenesis in pulp regeneration via TGF-beta/SMAD2/3 signalling. Cell Proliferation. 54 (7), e13074 (2021).
Li, Z., et al. Apoptotic vesicles activate autophagy in recipient cells to induce angiogenesis and dental pulp regeneration. Molecular Therapy. 30 (10), 3193-3208 (2022).
Vogel, V. Unraveling the mechanobiology of extracellular matrix. Annual Review of Physiology. 80, 353-387 (2018).
Huebsch, N., et al. Harnessing traction-mediated manipulation of the cell/matrix interface to control stem-cell fate. Nature Materials. 9 (6), 518-526 (2010).
Shuai, Y., et al. Melatonin treatment improves mesenchymal stem cells therapy by preserving stemness during long-term in vitro expansion. Theranostics. 6 (11), 1899-1917 (2016).
Sui, B. D., Zhu, B., Hu, C. H., Zhao, P., Jin, Y. Reconstruction of regenerative stem cell niche by cell aggregate engineering. Methods in Molecular Biology. 2002, 87-99 (2019).
Wei, F., et al. Vitamin C treatment promotes mesenchymal stem cell sheet formation and tissue regeneration by elevating telomerase activity. Journal of Cellular Physiology. 227 (9), 3216-3224 (2012).
de Clerck, Y. A., Jones, P. A. The effect of ascorbic acid on the nature and production of collagen and elastin by rat smooth-muscle cells. The Biochemical Journal. 186 (1), 217-225 (1980).
Fujisawa, K., et al. Evaluation of the effects of ascorbic acid on metabolism of human mesenchymal stem cells. Stem Cell Research & Therapy. 9 (1), 93 (2018).
Wang, T., et al. The histone demethylases Jhdm1a/1b enhance somatic cell reprogramming in a vitamin-C-dependent manner. Cell Stem Cell. 9 (6), 575-587 (2011).
Sun, J., et al. Osthole improves function of periodontitis periodontal ligament stem cells via epigenetic modification in cell sheets engineering. Scientific Reports. 7 (1), 5254 (2017).
Wang, Y. J., et al. Resveratrol enhances the functionality and improves the regeneration of mesenchymal stem cell aggregates. Experimental and Molecular. 50 (6), 1-15 (2018).
Shang, F., et al. The effect of licochalcone A on cell-aggregates ECM secretion and osteogenic differentiation during bone formation in metaphyseal defects in ovariectomized rats. Biomaterials. 35 (9), 2789-2797 (2014).
Dissanayaka, W. L., Zhu, L., Hargreaves, K. M., Jin, L., Zhang, C. Scaffold-free prevascularized microtissue spheroids for pulp regeneration. Journal of Dental Research. 93 (12), 1296-1303 (2014).
Dissanayaka, W. L., Zhu, L., Hargreaves, K. M., Jin, L., Zhang, C. In vitro analysis of scaffold-free prevascularized microtissue spheroids containing human dental pulp cells and endothelial cells. Journal of Endodontics. 41 (5), 663-670 (2015).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

MSC

This article has been published

Video Coming Soon

Keep me updated: