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Resumen

Este estudio describe un método para construir agregados basado en el autoensamblaje de células madre mesenquimales humanas e identifica las características morfológicas e histológicas para el tratamiento regenerativo de los defectos óseos craneales.

Resumen

Las células madre mesenquimales (MSC), caracterizadas por su capacidad de autorrenovación y su potencial de diferenciación multilinaje, pueden derivarse de diversas fuentes y están emergiendo como candidatas prometedoras para la medicina regenerativa, especialmente para la regeneración de los dientes, huesos, cartílagos y piel. El enfoque autoensamblado de la agregación de MSC, que construye grupos de células que imitan la condensación mesenquimal en desarrollo, permite la entrega de células madre de alta densidad junto con interacciones célula-célula preservadas y la matriz extracelular (ECM) como nicho de microambiente. Se ha demostrado que este método permite un injerto celular y una supervivencia eficientes, promoviendo así la aplicación optimizada de MSCs exógenas en la ingeniería de tejidos y salvaguardando la regeneración clínica de los órganos. Este artículo proporciona un protocolo detallado para la construcción y caracterización de agregados autoensamblados basados en células madre mesenquimales de cordón umbilical (UCMSCs), así como un ejemplo de la aplicación regenerativa del hueso craneal. La implementación de este procedimiento ayudará a guiar el establecimiento de una estrategia eficiente de trasplante de MSC para la ingeniería de tejidos y la medicina regenerativa.

Introducción

La condensación de células madre mesenquimales (MSC) es una etapa esencial para asegurar el crecimiento y desarrollo normal del cuerpo en la organogénesis temprana 1,2, especialmente en la formación de hueso, cartílago, dientes y piel 1,3,4. En las últimas décadas, las terapias de ingeniería de tejidos que utilizan MSCs postnatales cultivadas combinadas con andamios biodegradables han realizado importantes avances en la regeneración osteogénica5 y cartilaginosa6. Sin embargo, el uso de andamios puede tener algunas desventajas, como el rechazo inmunológico, así como una baja afinidad y plasticidad celular7. En este sentido, hemos investigado la factibilidad de aplicar un método de cultivo de células esferoides para proporcionar agregados autoensamblados sin andamios que imitan el fenómeno de condensación en desarrollo, que contienen solo MSCs y la matriz extracelular depositada (ECM)8. La formación de agregados aumenta la plasticidad aplicativa para adaptarse a la forma del defecto y evita la implantación del andamio y la digestión por parte de las enzimas proteolíticas para cosechar MSC para el trasplante9.

Los agregados de MSC se han utilizado ampliamente para la regeneración del hueso, la pulpa dental, el periodonto y la piel10, entre otros tejidos y órganos. Se pueden seleccionar muchos tipos diferentes de MSC como candidatas para las células de semilla, incluidas, entre otras, las MSC de la médula ósea (BMMSC), las MSC del cordón umbilical (UCMSC), las células estromales derivadas del tejido adiposo (ADSC) y las MSC dentales (por ejemplo, células madre mesenquimales de la pulpa dental [DPSC], células madre mesenquimales de los dientes deciduos [SHED]11 y células madre mesenquimales periodontales [PDLSC])12. En la última década se han desarrollado muchas tecnologías para grupos de células tridimensionales, incluida la agregación asistida y autoensamblada. Sin embargo, los enfoques de agregación asistida suelen ser débiles en la producción de MEC y en la formación de agregados homogéneos y apretados, por lo que no son adecuados para imitar las condiciones fisiológicas 13,14,15. Además, algunos métodos de agregación asistida requieren interacciones célula-material para formar estructuras estables 16,17,18,19, mientras que este método de agregación autoensamblado está generalmente disponible para una amplia gama de MSCs. En particular, en nuestros recientes ensayos clínicos, los agregados de MSC se han utilizado con éxito para regenerar el complejo pulpa-dentina y el periodonto después de la implantación en dientes incisivos humanos lesionados. que han logrado la regeneración tisular de novo con estructura y función fisiológica20,21.

Este artículo proporciona un procedimiento exhaustivo para la construcción y caracterización de agregados de MSC, así como para el trasplante in vivo . Este enfoque atraerá la atención de los investigadores cuando pretendan reparar defectos en tejidos, como los dientes, el hueso, el cartílago y la piel, basándose en aplicaciones de células madre. Este método es simple, conveniente y está completamente compuesto por células y ECM sin andamios adicionales, que pueden cultivarse durante mucho tiempo para obtener agregados densos y estables22. Mientras tanto, los agregados cultivados de esta manera son ricos en ECM, que imita el nicho de desarrollo de estas células de alta densidad y, por lo tanto, promueve la regeneración de los tejidos23. El proceso de construcción se puede dividir en dos etapas: preparación y cultivo de células, y formación y cosecha de agregados celulares autoensamblados. La caracterización de los agregados incluye la identificación morfológica mediante un microscopio óptico invertido y un microscopio electrónico de barrido (SEM), y el análisis histológico mediante hematoxilina y eosina (HE) y tinción de Masson. Los agregados formados se demostraron para la implantación regenerativa para reparar el defecto óseo craneal. La implementación de este procedimiento ayudará a guiar el establecimiento de una estrategia eficiente de trasplante de MSC para la ingeniería de tejidos y la medicina regenerativa.

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Protocolo

NOTA: Todos los procedimientos con animales fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales de la Cuarta Universidad Médica Militar y se realizaron de acuerdo con la Guía de los Institutos Nacionales de Salud para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio. Para el presente estudio se utilizaron UCMSC humanas criopreservadas que se obtuvieron de una fuente comercial (ver Tabla de Materiales). El uso de células humanas fue aprobado por el Comité de Ética de la Cuarta Universidad Médica Militar. Se tomaron como ejemplo las UCMSC para describir el procedimiento. Se tomó como ejemplo el defecto craneal para mostrar la necesidad de reparación para describir el procedimiento de implantación. Todos los experimentos se repitieron tres veces.

1. Construcción de áridos UCMSC

  1. Preparación y cultura de las UCMSC
    1. Agregue 10 mL de solución salina tamponada con fosfato (PBS) precalentada en un nuevo tubo centrífugo de 15 mL en un gabinete de bioseguridad estéril.
    2. Retire el tubo de congelación que contiene las UCMSC congeladas de nitrógeno líquido y colóquelo rápidamente en un baño de agua a 37 °C. Agite el tubo suavemente para facilitar la descongelación rápida y completa de las células.
      PRECAUCIÓN: Todo el procedimiento debe terminarse dentro de 1 minuto, ya que el dimetilsulfóxido (DMSO) en la solución de congelación puede causar citotoxicidad.
    3. Suspenda ligeramente las células en el tubo de congelación y transfiera todo el contenido al tubo de centrífuga que contiene 10 mL de PBS (paso 1.1.1). Centrifugar la muestra a 100 × g durante 5 min. Deseche el sobrenadante y lave las células con 10 mL de PBS.
    4. Centrifugar la muestra a 100 × g durante 5 min. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender suavemente las células con medio esencial alfa mínimo completo (α-MEM) que contenga 10% de suero fetal bovino (FBS), 1% de penicilina-estreptomicina y 584 mg/L de glutamina.
    5. Siembre las células resuspendidas en placas de cultivo de 10 cm (a menudo una o dos placas para un tubo, dependiendo de la cantidad total de células después de la centrifugación, a una densidad de 5 × 106 células por placa). Agregue medio α-MEM completo en los platos hasta un volumen total de 10 mL.
    6. Agite suavemente los platos para distribuir las células. Incubar las placas a 37 °C con 5% de CO2 en una cámara humidificada. Después de la incubación durante la noche, deseche el medio sobrenadante y agregue 5 mL de PBS 1-2x para eliminar las células no adherentes. Agregue 10 mL de medio α-MEM completo y fresco. Cambie el medio de cultivo cada 2 días.
    7. Para el paso de células, cuando las células alcancen el 80%-90% de confluencia, deseche el sobrenadante y lave las células con 5 mL de PBS para eliminar bien el medio. Incubar las células en 2 mL de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) al 0,25% de tripsina-1 mM a 37 °C durante 2 min.
    8. Cuando las células se vuelven redondas con uniones intercelulares rotas bajo un microscopio, separe las células de las placas sin interrumpir demasiado la estructura celular. Neutralice la tripsina añadiendo 4 mL de medio α-MEM completo.
    9. Recoja las células de las placas de forma repetida y suave pipeteando en un tubo de centrífuga nuevo de 15 ml. Centrifugar la muestra a 100 × g durante 5 min. Deseche el sobrenadante, vuelva a suspender las células con medio α-MEM completo y siembre en placas de cultivo frescas o placas de pocillos. Cambie el medio de cultivo cada 2 días.
      NOTA: De acuerdo con el tamaño del área del defecto, un defecto de 25 mm3 requiere el uso de un pocillo de células en placa de 6 pocillos cultivadas para formar agregados.
  2. Formación y cosecha de áridos
    1. Prepare los medios inductores de agregados celulares agregando 50 μg/mL de vitamina C en α-MEM con 10% de FBS, 1% de penicilina-estreptomicina y 584 mg/L de glutamina.
      PRECAUCIÓN: Se debe evitar la exposición directa a la luz cuando se usa vitamina C, ya que la vitamina C se oxida cuando se expone a la luz y se vuelve ineficaz.
    2. Cuando las células del paso 1.1.12 alcancen una confluencia del 95% (Figura suplementaria S1), cambie el medio a un medio inductor de agregados celulares; Cambie los medios inductores de agregados de células frescas cada 2 días.
    3. Después de 7-10 días de inducción (la duración del tiempo de inducción depende de los tipos de células madre y, a menudo, es de ~ 7 días para el borde de las UCMSC), busque agregados con forma bajo el microscopio, con bordes gruesos separados del fondo del plato.
    4. Deseche los medios de cultivo y lave suavemente las células 2 veces con PBS. Empuje suavemente los agregados desde el borde hasta el centro con pequeñas pinzas estériles, doblando los agregados.
    5. En algunas ocasiones, las UCMSC pueden curvarse espontáneamente hacia el centro para formar una condensación sólida. Esta estructura es equivalente al agregado obtenido en el paso 1.2.4.

2. Identificación morfológica de los agregados

  1. Observación general y microscópica
    1. Observe que los agregados son densos e integrados y no se dañan fácilmente por fuerzas mecánicas, como tirones durante el desprendimiento y el trasplante.
    2. Bajo un microscopio, busque una estructura similar a una membrana de cierto grosor con un patrón tejido.
  2. Tinción de células vivas/muertas
    1. Siembre las células en una placa de 6 pocillos a una densidad de 1 × 106 celdas por pocillo.
    2. Prepare 2 μM de calceína AM y 4 μM de solución de trabajo EthD-1 y use PBS.
    3. Añadir tritón al 0,3% a las células durante 5 min, lavar con PBS tres veces para inducir la muerte de las células, como control de la tinción.
    4. Lave las células, los agregados y las células que inducen la muerte con PBS dos veces.
    5. Agregue 100 μL de PBS y 100 μL de solución de tinción preparada en el paso 2.2.2 a cada pocillo.
    6. Incubar la muestra durante 30 min en RT. Lave la muestra con PBS dos veces.
    7. Añadir 200 μL de 10 μg/mL de Hoechst a cada pocillo e incubar la muestra durante 5 min en RT. Mezclar la muestra con PBS dos veces.
    8. Observar bajo un microscopio de fluorescencia.
  3. Observación SEM
    1. Sembrar e inducir en célula los agregados obtenidos en el paso 1.2.4 o 1.2.5. Lave las celdas con PBS después de que se formen los agregados en el paso 1.2.4. o 1.2.5.
    2. Fije las células con glutaraldehído durante al menos 4 h.
    3. Lave las muestras con PBS, luego deshidrate a través de una concentración de gradiente de etanol de 30%, 50%, 70%, 80%, 90% a 100%, cada una durante 5 min. Tratar 2 veces con etanol anhidro.
    4. Sumerja los agregados en 3 mL de hexametildisilazano durante 30 min. Aspire todo el líquido y seque bien las muestras de forma natural.
      PRECAUCIÓN: Todo el proceso debe llevarse a cabo en una campana extractora porque el hexametildisilazano es volátil y altamente tóxico.
    5. Pegue las muestras secas en la mesa de muestras con cinta de carbón de doble cara y cubra la superficie con metal. Almacene la muestra a temperatura ambiente (RT) durante varios días.
    6. Observar bajo un SEM.
      1. Vuelva a colocar la muestra dentro de la máquina. Ajuste el voltaje de la máquina a 5 k y la distancia focal a ~ 12 mm. Ajuste la barra de enfoque hasta que aparezca una imagen nítida.
      2. Capture las imágenes con un aumento bajo. Ajuste la ampliación y vuelva a enfocar para obtener una imagen de mayor ampliación.
        PRECAUCIÓN: La superficie de los agregados no se puede tocar antes de la observación para evitar la destrucción de la morfología de la superficie.

3. Análisis histológico de agregados

  1. Fijación y seccionamiento de muestras
    1. Fijar los áridos obtenidos en el paso 1.2.4 o 1.2.5 con un 4% de paraformaldehído a 4 °C durante al menos 24 h. Después de la fijación, lavar con PBS y colocar la muestra en casetes de inclusión durante la noche para enjuagar con agua corriente.
    2. Deshidratar las muestras utilizando máquinas automáticas de deshidratación a través de etanol de gradiente, xileno y parafina, siguiendo las instrucciones del fabricante. Todo el proceso es el siguiente: etanol al 85% durante 2 h en RT, etanol al 95% durante 2 h en RT, etanol al 95% durante 2 h en RT, etanol al 100% durante 2 h en RT, etanol al 100% durante 1,5 h en RT, xileno durante 45 min en RT, xileno durante 45 min en RT, parafina durante 30 min en RT, parafina durante 1,5 h a RT, y finalmente parafina durante 2 h a 60 °C.
    3. Incruste las muestras con parafina. Prepare secciones de aproximadamente 5 μm de grosor, adhiéralas a portaobjetos catiónicos y seque los portaobjetos durante 2 h a 45 °C.
    4. Desparafinar secuencialmente a través de xileno durante 15 minutos, dos veces, y etanol al 100%, 90%, 80% y 70% (cada uno durante 5 minutos).
    5. Enjuague lentamente los portaobjetos 3 veces con agua corriente durante 5 minutos.
  2. Tinción HE
    1. Teñir con hematoxilina durante 3-5 min, enjuagar con agua y eliminar cuidadosamente el exceso de líquido alrededor del tejido.
    2. Fraccionar con etanol que contenga ácido clorhídrico al 1% durante 3-5 s y enjuagar con agua corriente, durante lo cual el color se vuelve un poco más claro y azul. Retire el exceso de agua alrededor del tejido.
    3. Teñir con eosina durante 1 minuto, enjuagar con agua corriente y eliminar el exceso de líquido alrededor del tejido.
    4. Deshidratar con etanol al 70%, 80%, 90% y 100% durante 10 s cada uno, xileno durante 15 min, dos veces, y secar naturalmente en la campana extractora antes de sellar la lámina.
    5. Añade gotas de resina neutra y sella los portaobjetos con cubreobjetos. Observar bajo un microscopio óptico.
  3. Tinción tricrómica de Masson
    1. Teñir con hematoxilina de hierro de Weigert durante 5 minutos, enjuagar con agua y secar.
    2. Fraccionar con etanol que contenga ácido clorhídrico al 1% durante 3-5 s y enjuagar con agua corriente, durante lo cual el color se vuelve un poco más claro y azul. Seque la superficie con un paño.
    3. Teñir con la solución de magenta ácido rojo Lixin durante 5-10 minutos y enjuagar rápidamente con agua destilada.
    4. Tratar con una solución acuosa de ácido fosfomolíbdico durante 3-5 min.
    5. Volver a teñir directamente con solución de azul de anilina durante 5 minutos sin lavar con agua.
    6. Tratar con ácido acético glacial al 1% durante 1 min.
    7. Deshidratar con etanol al 70%, 80%, 90% y 100% durante 10 s cada uno, xileno durante 15 min, dos veces, y secar naturalmente en la campana extractora antes de sellar la lámina.
    8. Añade gotas de resina neutra y sella los portaobjetos con cubreobjetos. Observar bajo un microscopio óptico.

4. Implantación

  1. Anestesiar al ratón desnudo mediante una inyección intraperitoneal de 50 mg/kg de pentobarbital sódico.
    NOTA: Confirme que los ratones están correctamente anestesiados en función de la ausencia de reflejo corneal y reacción de las extremidades cuando se pellizca la almohadilla para los pies. Aplique ungüento para los ojos para prevenir la sequedad.
  2. Cortar una incisión transversal (~3-4 cm) en la piel detrás de las orejas del ratón desnudo con tijeras pequeñas estériles después de la desinfección con yodóforo.
  3. Tire de la piel hacia adelante para exponer el cráneo. Dibuje ligeramente los bordes del área del defecto planificada con una cuchilla 11# y retire el fragmento de hueso. El área del defecto es un área circular de aproximadamente 4 mm de diámetro. Use solución salina para enjuagar la herida y proporcionar una hemostasia adecuada.
  4. Sumerja los agregados obtenidos en el paso 1.2.5 o 1.2.6 con gasa estéril para absorber la humedad de la superficie antes de la implantación. Coloque los agregados en el área y presurice ligeramente para llenar el defecto.
  5. Reemplace la piel después de tirar para asegurarse de que el implante esté fijo. Cierre la incisión con 1/2, 4 × 10 puntos en ángulo y suturas 4-0.
  6. Después de la cirugía, coloque a los animales en la manta de recalentamiento hasta que estén activos y luego devuélvalos a la jaula.
    NOTA: Los animales no deben dejarse desatendidos hasta que recuperen la conciencia suficiente para mantener la decúbito esternal. Los animales que han sido sometidos a cirugía no son devueltos a la compañía de otros animales hasta que están completamente recuperados.

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Resultados

Los agregados se pueden construir con éxito a partir de UCMSC de acuerdo con el flujo de trabajo experimental (Figura 1). La calidad de los agregados debe evaluarse antes de su uso, mediante observación morfológica y análisis histológico. La estructura laminar formada debe ser completa y densa, con las células entrelazadas para formar un patrón tejido mediante observación microscópica (Figura 2A). El rizado de ...

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Discusión

Con los avances de la biotecnología de ingeniería de tejidos, las estrategias para construir una estructura implantable con alta plasticidad y que contenga células supervivientes a largo plazo que puedan lograr una regeneración óptima han sido el foco de muchos científicos. Existe una variedad de métodos actuales de implantación de MSCs, como los métodos solo celulares, andamios complementados con citocinas 6,24, o la co...

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Divulgaciones

Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.

Agradecimientos

Este trabajo contó con el apoyo de subvenciones de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (81930025, 82100969 y 82071075) y del Programa Nacional de Investigación y Desarrollo Clave de China (2022YFA1104400 y 2021YFA1100600). Agradecemos la asistencia del Centro Nacional de Demostración de Enseñanza Experimental para Medicina Básica (AMFU).

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Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
0.25% Trypsin-EDTA (1x)SigmaT4049Cell passage
Automatic Dehydration MachineLEICAASP200sDehydrate aggregate
CentrifugeEppendorf5418RCentrifugation
Centrifuge tubeThermo Nunc339650Centrifugation
Culture dishThermo150466Culture of UCMSCs
EthanolSCR10009218Dehydrate aggregate
Fatal bovine serumSijiqing11011-8611Culture of UCMSCs
ForcepJZJD1080Harvest aggregate
GlutaraldehydeProandy10217-1Fixation of aggregate
Hematoxylin and Eosin Staining KitbeyotimeC0105SHE staining
HexamethyldisilazaneSCR80068416Dry aggregate surface
Hoechst33342Sigma14533Cell nuclei stain
L-glutamineSigmaG5792Culture of UCMSCs
Live/dead Viability/Cytotoxicity Kit InvitrogenL3224Live/dead cell stain
Masson's Staining KitZHCCD069Masson Staining
Minimum Essential Medium Alpha basic (1x)GibcoC12571500BTCulture of UCMSCs
ParaffinLeica39601006Tissue embedding
ParaformaldehydeSaint-BioD16013Fixation of aggregate
PBS (1x)MeilunbioMA0015Resuspend and purify UCMSCs
Penicillin/StreptomycinProcell Life SciencePB180120Culture of UCMSCs
Pentobarbital sodiumSigmaP3761Animal anesthesia
PolysporinPfizerPrevent eye dry
Scanning Electron MicroscopeHitachis-4800SEM observation
ScissorJZY00030Animal surgical incision
Six-well plateThermo140675Culture of UCMSCs
StitchJinhuanF603Close wounds
SutureXy4-0Close wounds
Thermostatic equipmentGrantv-0001-0005Water bath
UCMSCsBai'ao UKK220201Commercially UCMSCs
Vitamin CDiyibioDY40138-25gAggregate inducing
XyleneSCR10023418Dehydrate aggregate

Referencias

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