Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

نقدم هنا طريقة غير وراثية لتوليد كرويات كبدية ذاتية بشرية باستخدام خلايا أحادية النواة معزولة من الدم المحيطي المستقر.

Abstract

يمكن أن تشكل خلايا الكبد البشرية بنية ثلاثية الأبعاد (3D) قادرة على النمو في الثقافة لعدة أسابيع ، والحفاظ على قدرتها الوظيفية. نظرا لطبيعتها في التجمع في أطباق الاستزراع ذات الخصائص اللاصقة المنخفضة أو المعدومة ، فإنها تشكل تجمعات من خلايا الكبد المتعددة التي تسمى كرويات الكبد البشري. يعتمد تكوين كرويات الكبد 3D على الميل الطبيعي للخلايا الكبدية للتجمع في غياب ركيزة لاصقة. هذه الهياكل 3D تمتلك استجابات فسيولوجية أفضل من الخلايا ، والتي هي أقرب إلى بيئة في الجسم الحي . استخدام ثقافات خلايا الكبد 3D له مزايا عديدة عند مقارنته بالثقافات الكلاسيكية ثنائية الأبعاد (2D) ، بما في ذلك بيئة دقيقة أكثر صلة بيولوجيا ، ومورفولوجيا معمارية تعيد تجميع الأعضاء الطبيعية بالإضافة إلى تنبؤ أفضل فيما يتعلق بحالة المرض وفي استجابات شبيهة بالجسم الحي للأدوية. يمكن استخدام مصادر مختلفة لتوليد كرويات ، مثل أنسجة الكبد الأولية أو خطوط الخلايا الخالدة. يمكن أيضا هندسة أنسجة الكبد 3D باستخدام الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (hESCs) أو الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات (hiPSCs) لاشتقاق خلايا الكبد. لقد حصلنا على كرويات الكبد البشري باستخدام الخلايا الجذعية متعددة القدرات المشتقة من الدم (BD-PSCs) المتولدة من الدم المحيطي غير المعالج عن طريق تنشيط البروتين المرتبط بغشاء الإنسان المرتبط ب GPI والمتمايز إلى خلايا الكبد البشرية. تم تحليل خلايا الكبد البشرية المشتقة من BD-PSCs وكرويات الكبد البشري عن طريق الفحص المجهري الضوئي والتنميط المناعي باستخدام علامات خلايا الكبد البشرية.

Introduction

في السنوات الأخيرة ، أصبحت أنظمة الاستزراع الكروي ثلاثية الأبعاد (3D) أداة مهمة لدراسة مختلف مجالات أبحاث السرطان واكتشاف الأدوية وعلم السموم. تثير هذه الثقافات اهتماما كبيرا لأنها تسد الفجوة بين أحاديات زراعة الخلايا ثنائية الأبعاد (2D) والأعضاء المعقدة1.

في حالة عدم وجود سطح لاصق ، مقارنة بثقافة الخلايا 2D ، يعتمد تكوين الكائنات الكروية على التقارب الطبيعي لهذه الخلايا للتجمع في شكل 3D. تنظم هذه الخلايا نفسها في مجموعات تتكون من نوع واحد أو أكثر من الخلايا الناضجة. خالية من المواد الغريبة ، تتفاعل هذه الخلايا مع بعضها البعض كما هو الحال في بيئتها المكروية الأصلية. الخلايا في ثقافة 3D أقرب بكثير ولها اتجاه مناسب تجاه بعضها البعض ، مع إنتاج مصفوفة خارج الخلية أعلى من الثقافات ثنائية الأبعاد ، وتشكل بيئة قريبة من البيئة الطبيعية 2.

تم استخدام النماذج الحيوانية لفترة طويلة لدراسة البيولوجيا البشرية والأمراض3. في هذا الصدد ، هناك اختلافات جوهرية بين البشر والحيوانات ، مما يجعل هذه النماذج غير مناسبة تماما للدراسات الاستقراءية. تمثل كرويات الثقافة ثلاثية الأبعاد والكائنات العضوية أداة واعدة لدراسة البنية الشبيهة بالأنسجة والتفاعل والحديث المتبادل بين أنواع الخلايا المختلفة التي تحدث في الجسم الحي ويمكن أن تساهم في تقليل أو حتى استبدال النماذج الحيوانية. فهي ذات أهمية خاصة لدراسة التسبب في أمراض الكبد وكذلك منصات فحص المخدرات4.

تعتبر ثقافة كروية 3D ذات أهمية خاصة لأبحاث السرطان لأنها يمكن أن تقضي على الانقطاع بين الخلايا وبيئتها عن طريق تقليل الحاجة إلى علاج التربسين أو كولاجيناز اللازم لإعداد أحاديات الخلايا السرطانية لثقافات 2D. تمكن الأجسام الكروية للورم من دراسة كيفية تلقي الخلايا الطبيعية مقابل الخلايا الخبيثة للإشارات من محيطهاوالاستجابة لها 5 وهي جزء مهم من دراسات بيولوجيا الورم.

بالمقارنة مع monolayer ، تشبه ثقافات 3D التي تتكون من أنواع مختلفة من الخلايا أنسجة الورم في خصائصها الهيكلية والوظيفية ، وبالتالي فهي مناسبة لدراسة ورم خبيث وغزو الخلايا السرطانية. هذا هو السبب في أن هذه النماذج الكروية تساهم في تسريع أبحاث السرطان6.

تساعد الكائنات الكروية أيضا في تطوير التكنولوجيا اللازمة لإنشاء عضويات بشرية لأن بيولوجيا الأنسجة والأعضاء صعبة للغاية للدراسة ، خاصة في البشر. التقدم في زراعة الخلايا الجذعية يجعل من الممكن تطوير ثقافات 3D مثل المواد العضوية التي تتكون من الخلايا الجذعية وأسلاف الأنسجة وكذلك أنواع مختلفة من الخلايا الناضجة (الأنسجة) من عضو مع بعض الخصائص الوظيفية مثل العضو الحقيقي الذي يمكن استخدامه لنمذجة تطور الأعضاء والأمراض ، ولكن يمكن اعتبارها أيضا مفيدة في الطب التجديدي7.

عادة ما تستخدم خلايا الكبد البشرية الأولية لدراسة البيولوجيا المختبرية لخلايا الكبد البشرية ، ووظائف الكبد ، والسمية التي يسببها الدواء. ثقافات خلايا الكبد البشرية لها عيبان رئيسيان ، أولا ، التوافر المحدود للأنسجة الأولية مثل خلايا الكبد البشرية ، وثانيا ، ميل خلايا الكبد إلى عدم التمايز بسرعة في ثقافة 2D وبالتالي فقدان وظيفة خلايا الكبد المحددة8. الثقافات الكبدية 3D متفوقة في هذا الصدد وقد تم تصنيعها مؤخرا من الخلايا الجذعية الجنينية البشرية المتمايزة (hESCs) أو الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات (hiPSCs) 9. تعتبر كرويات 3D الكبدية المهندسة بيولوجيا ذات أهمية خاصة لدراسة التطور والسمية والأمراض الوراثية والمعدية للكبد ، وكذلك في اكتشاف الأدوية لعلاج أمراض الكبد10. أخيرا ، لديهم أيضا إمكانية استخدامها سريريا ، مع العلم أن أمراض الكبد الحادة لها معدل وفيات يقارب 80٪ ، والكبد الاصطناعي الحيوي و / أو كرويات الكبد يمكن أن تنقذ هؤلاء المرضى من خلال توفير وظائف الكبد الجزئية حتى يمكن العثور على متبرع مناسب11.

لقد أنشأنا بروتوكولا لتوليد كرويات كبدية بشرية باستخدام الخلايا الجذعية متعددة القدرات المشتقة من الدم (BD-PSCs) لإعداد كرويات مختلفة الحجم تحتوي على 4000 إلى 1 × 106 خلايا وتحليلها عن طريق الفحص المجهري الضوئي والتألق المناعي. اختبرنا أيضا قدرة الوظيفة الخاصة بخلايا الكبد ، وتقييم تعبير إنزيمات السيتوكروم P450 3A4 (CYP3A4) و 2E1 (CYP2E1) التي تنتمي إلى عائلة السيتوكروم P450 التي لها أدوار مهمة في التمثيل الغذائي الخلوي والدواء من خلال عملية إزالة السموم12.

Protocol

تم الحصول على الموافقة الأخلاقية (ACA CELL Biotech GmbH / 25b-5482.2-64-1) لإجراء هذه التجارب وتم توقيع الموافقة المستنيرة من قبل جميع المتبرعين قبل استخراج الدم وفقا للإرشادات المؤسسية.

1. تحضير الخلايا أحادية النواة (MNCs) من الدم المحيطي البشري (PB)

  1. استخراج 30 مل من الدم من المتبرعين الأصحاء بمساعدة الطاقم الطبي المدربين وفقا للبروتوكول القياسي.
  2. عزل PBMNCs باستخدام وسائط تدرج الكثافة وفقا للبروتوكول الذي نشره Becker-Kojić et al.13. عزل طبقة الطور البيني بين البلازما ووسائط تدرج الكثافة عن طريق السحب واستخدام محلول ملحي عازل للفوسفات معقم (PBS) لغسل الخلايا المعزولة.
  3. استخدم غرفة العد واحسب عدد الخلايا باستخدام الطرق القياسية.

2. إلغاء تمايز الشركات متعددة الجنسيات عند التنشيط باستخدام البروتين السكري البشري المرتبط ب GPI

  1. ضع 6 × 106 خلايا أحادية النواة في PBS / 1٪ ألبومين مصل البقر (BSA) في أنبوب بوليسترين (15 مل) واحتضانها مع الجسم المضاد المحدد لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية وفقا لبيكر كوجيتش وآخرون 13.
  2. قم بطرد الخلايا عند 300 × جم في درجة حرارة الغرفة واستبدل PBS / BSA بوسط Dulbecco المعدل من Iscove المكمل بمصل بقري جنيني بنسبة 10٪ (FBS).
  3. تنمو الخلايا في أنابيب البوليسترين 15 مل في حاضنة CO2 5٪ عند 37 درجة مئوية لمدة 8-10 أيام كما هو موضح في Becker-Kojić et al.13. في اليوم الخامس (D5) ، أضف 1-2 مل من وسط Iscove المكمل ب 10٪ FBS لكل أنبوب سعة 15 مل.

3. فرز الخلايا غير المتمايزة التي تم إنشاؤها حديثا

  1. معلق خلية مستزرع بالطرد المركزي في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق عند 300 × جم ونضح باستخدام ماصة معقمة المادة الطافية الناتجة وفقا لبيكر كوجيتش وآخرون 13.
  2. إعادة تعليق الحبيبات التي تم الحصول عليها عن طريق الطرد المركزي في 90 ميكرولتر من المخزن المؤقت PBS البارد (PBS pH 7.2 و 0.5٪ BSA و 2 mM EDTA) وإضافة 10 ميكرولتر من الخرز المغناطيسي الموجب بحجم النانو CD45 واحتضانها على الجليد لمدة 15 دقيقة.
  3. اغسل تعليق الخلية ب 2 مل من المخزن المؤقت PBS ، وطرده مركزيا عند 300 × جم لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة وأضف 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت PBS إلى الخلايا وأعد تعليقه جيدا.
  4. ماصة 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت PBS المبرد مسبقا في العمود لغسله ووضعه في المجال المغناطيسي باستخدام حامل مغناطيسي.
  5. اغسل الخلايا الموضوعة على العمود ، مرتين باستخدام 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت PBS واجمع التدفق الذي يحتوي على الخلايا السالبة CD45 في وسط Iscove المكمل ب 10٪ FBS.
  6. استخدم غرفة العد لتحديد عدد الخلايا المعاد برمجتها.

4. إعداد أغطية زجاجية لتوليد خلايا الكبد البشرية

  1. افصل أغطية زجاجية (14 مم) واحتضنها في منظف غير أيوني لمدة 10 دقائق. اغسل أغطية الزجاج في ماء منزوع الأيونات حتى لا تبقى فقاعات واحتضانها في 1M HCl لمدة 30 دقيقة (مقتبس من Marchenko et al.14).
  2. اغسل أغطية الزجاج بالماء منزوع الأيونات 3x على الأقل وجففها طوال الليل في درجة حرارة الغرفة. أغطية الزجاج المجفف الأوتوكلاف في حاوية مناسبة.

5. طلاء لوحات زراعة الخلايا مع biolaminin للتمايز الكبدي 2D من BD-PSCs

  1. ضع أغطية زجاجية معقمة مع زوج معقم من الملقط في 4 ألواح بئر وقم بتشغيل مصابيح الأشعة فوق البنفسجية لمدة 30 دقيقة لضمان ظروف معقمة.
  2. قم بإذابة حصص البيولامينين وأضف 120 ميكرولتر من 5 ميكروغرام / مل بيولامينين إلى كل زلة غطاء زجاجي. اترك أغطية الزجاج المطلي طوال الليل عند 4 درجات مئوية.
  3. إزالة فائض البيولامينين وإضافة 200 ميكرولتر من وسط تمايز خلايا الكبد كما هو موضح أدناه.

6. إعداد وسائط تمايز خلايا الكبد

  1. اصنع 500 مل من وسط استبدال مصل خروج المغلوب في البلاستيدات الكبدية (KSR) / ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) يتكون من 76.4٪ ضربة قاضية DMEM (KO-DMEM) ، 20٪ KSR ، 0.5٪ L-glutamine ، 1٪ أحماض أمينية غير أساسية (NEAA) ، 0.1٪ β-mercaptoethanol ، 1٪ DMSO ، و 1٪ بنسلين - ستربتومايسين (قلم / بكتيريا العقدية).
  2. تحضير 500 مل من وسط نضج خلايا الكبد يحتوي على 1٪ L-glutamine ، 10 μM هيدروكورتيزون 21-هيميسوتشينات ملح الصوديوم (HCC) ، و 1٪ قلم / بكتيريا .
  3. وسط القسمة من المخزون وإضافة عامل نمو خلايا الكبد الطازجة (HGF) و oncostatin M (OSM) بتركيزات نهائية تبلغ 10 نانوغرام / مل و / أو 20 نانوغرام / مل لكل تغيير متوسط.
    ملاحظة: Oncostatin M هو سيتوكين ينتمي إلى مجموعة السيتوكينات interleukin 6 ، وهو مهم لتكوين الدم وكذلك لنمو الكبد.

7. زراعة الخلايا الكبدية المتمايزة عن BD-PSCs

  1. ضع 3 × 105 خلايا BD-PSCS في كل بئر من صفيحة 4 آبار مغلفة بالبولامينين.
  2. ضع ألواح 4 آبار في الحاضنة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2. استزرع الخلايا لمدة 5 أيام في وسط KSR / DMSO الكبدي الذي يدعم تمايز الأديم الباطن وتغيير الوسط كل يومين.
  3. قم بالتبديل إلى وسط نضوج خلايا الكبد في اليوم الخامس واستزرع الخلايا لمدة 7-10 أيام إضافية في الحاضنة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2. تغيير الوسيط كل 48 ساعة.

8.3D التمايز الكبدي الكروي

  1. عد الخلايا باستخدام غرفة العد.
  2. تعليق خلية غير متمايزة BD للطرد المركزي عند 300 × جم لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. إزالة الخلايا الطافية وإعادة تعليق الخلايا غير المتمايزة BD في وسط KSR / DMSO عند 2 × 106 خلايا / مل.
  3. مرر الخلايا من خلال مصفاة خلية 40 ميكرومتر لضمان تعليق خلية واحدة وإزالة أي حطام إضافي.
  4. عد الخلايا باستخدام غرفة العد وقم بإعداد حجم كاف لكل كثافة بذر خلية من أجل توزيع الحجم المطلوب لكل بئر. قم بإعداد تدرج مع البذر العلوي من 1 × 106 خلايا إلى كثافة بذر منخفضة تبلغ 4000 خلية.
  5. قم بتوزيع 100 ميكرولتر من وسط KSR / DMSO في 96 لوحة ربط منخفضة جيدا وأضف 100 ميكرولتر من تخفيف بذر الخلايا.
  6. ضع لوحة ربط منخفضة في الحاضنة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 واستزراعها لمدة 5 أيام.
  7. تغيير 50 ٪ من الوسط من أيام 3-4 بعد البذر عندما تكون الكرويات مضغوطة بما فيه الكفاية.
  8. في اليوم 5 ، قم بتغيير الوسط إلى وسط نضج خلايا الكبد واستزرع الخلايا لمدة 7-10 أيام إضافية لمزيد من النضج. تغيير الوسيط كل يومين.

9. تحليل التألق المناعي لثقافات خلايا الكبد 2D المولدة حديثا

  1. قم بزراعة الخلايا وفقا لطريقة التمايز الموضحة أعلاه لمدة 4 و 8 و 15 و 24 يوما وإزالة الوسائط.
  2. احتضان الخلايا مع مثبت قبل التسخين يتكون من 4 ٪ بارافورمالدهيد في برنامج تلفزيوني لمدة 10 دقائق. تخلص من المثبت واغسل الخلايا 2x باستخدام برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق لكل منها. أضف على الفور محلول 0.1٪ triton X-100 وتخلل الخلايا لمدة 5 دقائق. اغسل 2x مع برنامج تلفزيوني.
  3. أضف محلول حظر مصنوع من PBS و 5٪ BSA وضعه على لوحة متأرجحة لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
  4. تمييع الأجسام المضادة الأولية في المخزن المؤقت للتخفيف 1٪ BSA / PBS على النحو التالي: الألبومين (ALB) 1:50 ، ألفا -1 فيتوبروتين (AFP) 1: 250 ، السيتوكيراتين 18 (CK18) 1:50 ، العامل النووي لخلايا الكبد 4 ألفا (HNF4α) 1: 1000 وترانسثيريتين (TTR) 1:50. استخدم 50 ميكرولتر من تخفيف الأجسام المضادة لكل بئر.
  5. احتضان الخلايا لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة. ثم تخلص من محلول الأجسام المضادة ، واغسل الخلايا لمدة 5 دقائق ، وكرر خطوة الغسيل 3x.
  6. قم بإعداد الأجسام المضادة الثانوية التالية في محلول التخفيف: أرنب مضاد للدجاج IgG (أحمر تكساس) 1: 1000 ، الماعز المضاد للفأر IgG (488) 1: 1000 ، والماعز المضاد للأرانب (488) 1: 500. استخدم 50 ميكرولتر من تخفيف الأجسام المضادة لكل بئر واحتضان الخلايا لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  7. اغسل الخلايا 3x باستخدام PBS لمدة 5 دقائق لكل منها وقم بتركيب أغطية الغطاء بوسائط تثبيت تحتوي على DAPI للتحليل المجهري.

10. تلطيخ حي من كرويات الكبد المشكلة حديثا

  1. تخلص بعناية من وسائط الاستزراع مع عدم لمس الكائنات الكروية ، وأضف برنامج تلفزيوني طازج بمحلول 0.1٪ triton X-100 ، واحتضانه لمدة 5 دقائق لاختراق الخلايا.
  2. اغسل الكرويات بالوسط عن طريق سحب الخصمة ببطء لمدة 5 دقائق ، كرر 2x.
  3. احتضان الأجسام الكروية بالأجسام المضادة الأولية ALB (1:50) و AFP (1:250) و CK18 (1:50) و CYP2E1 (1:200) و CYP3A4 (1: 200) المحضرة في PBS مع 1٪ BSA لمدة ساعة واحدة في حاضنة CO2 بنسبة 5٪ عند 37 درجة مئوية. استخدم 50 ميكرولتر من تخفيف الأجسام المضادة لكل بئر.
  4. قم بإزالة محلول الأجسام المضادة الزائد بعناية وغسل الأجسام الكروية بمتوسط 3x.
  5. قم بإعداد الأجسام المضادة الثانوية المقابلة للماعز المضاد للفأر IgG (Cy3) ، والماعز المضاد للفأر IgG (488) ، والأرانب المضادة للدجاج IgG (تكساس الأحمر) بتخفيف 1: 1000 و 1: 500 للماعز المضاد للأرانب (488) في PBS في 1٪ BSA. استخدم 50 ميكرولتر من تخفيف الأجسام المضادة لكل بئر واحتضانها لمدة 20 دقيقة في الحاضنة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2.
  6. اغسل بعناية 3x بمتوسط واترك اللوحة لمدة 30 دقيقة في الحاضنة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 قبل إجراء الفحص المجهري الفلوري.

11. فحص الأجسام الكروية باستخدام المجهر الفلوري

  1. قم بتشغيل مصدر الضوء الفلوري قبل 10 دقائق من الاستخدام ، وقم بتشغيل الكمبيوتر وافتح برنامج التصوير.
  2. استخدم هدفا بتكبير 4x ، وانقر فوق الزر 4x في شريط الأدوات لتحديد شريط المقياس الصحيح ، ثم ضع لوحة 96 بئرا على لوحة مركز المسرح.
  3. قم بتشغيل مصدر ضوء LED ، واستخدم مرشح برايت فيلد ، وضع اللوحة في البئر محل الاهتمام باستخدام مقبض ضبط مرحلة المحور x-y.
  4. قم بالتغيير إلى مسار ضوء الكاميرا ، وانقر فوق الزر Live in Imaging Software لتصور الصورة على الشاشة ، وتأكد من توسيط الكرة الأرضية باستخدام مقابض المحور x-y والتركيز باستخدام مقبض التركيز الخشن / الدقيق.
    ملاحظة: يظل شكل الأجسام الكروية ثابتا بعد تطبيق التلوين الحي.
  5. اختر طريقة Brightfield Observation في شريط الأدوات ، واضبط إعدادات التعريض الضوئي على تلقائي ، وانقر فوق الزر لقطة في لوحة تحكم الكاميرا لالتقاط صورة. ثم احفظ الصورة كملف .vsi باستخدام الاسم المناسب في مجلد الاهتمام.
  6. ضع لوحة حماية الإضاءة المحيطة لإيقاف تشغيل ضوء LED ، وقم بالتغيير لتصفية الإثارة B ، واختر طريقة المراقبة 488 في شريط الأدوات ، وافتح الغالق ، والتقط صورة بالنقر فوق الزر لقطة ، وأغلق الغالق ، ثم احفظ الملف كما هو موضح أعلاه.
  7. كرر هذا باستخدام مرشح لإثارة G باستخدام طريقة المراقبة المناسبة (تكساس الأحمر أو CY3). ثم كرر الإجراء بأكمله لكل بئر من الاهتمام.
  8. أعد اللوحة إلى حاضنة CO2 بنسبة 5٪ عند 37 درجة مئوية واستزرعها كما هو موضح أعلاه.

النتائج

لقد نجحنا في تمييز BD-PSCs البشرية إلى خلايا سلف الأديم الباطن / الكبدي وخلايا الكبد من خلال تطبيق بروتوكول من خطوتين. يوضح الشكل 1 التغيرات المورفولوجية أثناء عملية التمايز الكبدي. تتمايز BD-PSCs إلى خلايا كبدية تمر بثلاث مراحل مختلفة. تمثل المرحلة الأولى التمايز إلى خلايا الأدي...

Discussion

الكبد هو عضو رئيسي في جسم الإنسان له العديد من الوظائف البيولوجية الأساسية ، مثل إزالة السموم من الأيضات. بسبب فشل الكبد الحاد مثل تليف الكبد و / أو التهاب الكبد الفيروسي ، هناك ما يقرب من 2 مليون حالة وفاة سنويا في جميع أنحاء العالم. تحتل عمليات زرع الكبد المرتبة الثانية في عمليات زرع الأعض?...

Disclosures

تعلن المؤلفة المقابلة أنها صاحبة براءة اختراع تتعلق بالبروتين المرتبط ب GPI البشري الجديد. شاركت في تأسيس وتعمل مع ACA CELL Biotech GmbH. يعلن المؤلفون الآخرون أنه لا يوجد تضارب في المصالح.

Acknowledgements

ويعرب أصحاب البلاغ عن امتنانهم الخاص للمساعدة التقنية التي قدمها أوكسانا وجون غريناكر. تم دعم هذا العمل من قبل ACA CELL Biotech GmbH هايدلبرغ ، ألمانيا.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Albumin antibodySigma-AldrichSAB3500217produced in chicken
Albumin Fraction VCarl Roth GmbH+Co. KGT8444.4
Alpha-1 FetoproteinProteintech Germany GmbH14550-1-APrabbit polyclonal IgG
Biolaminin 111 LNBioLamina LN111-02human recombinant
CD45 MicroBeadsMiltenyi130-045-801nano-sized magnetic beads
Cell StrainerpluriSelect43-10040-40
CellSens Olympusimaging software
Centrifuge tubes 50 mL Greiner Bio-One210270
CEROplate 96 wellOLS OMNI Life Science2800-109-96
CKX53 Olympus
Commercially available detergentProcter & Gamblenonionic detergent
CYP2E1-specific antibodyProteintech Germany GmbH19937-1-APrabbit polyclonal antibody IgG
CYP3A4 Proteintech Germany GmbH67110-1-lgmouse monoclonal antibody IgG1
Cytokeratin 18DakoCytomationM7010mouse monoclonal antibody IgG1
DMSOSigma-AldrichD8418-50ML
DPBSThermo Fisher Scientific14040091
FBSMerck MilliporeS0115/1030BDiscontinued. Available under: TMS-013-B
Glass cover slips 14 mmR. Langenbrinck01-0014/1
GlutaMax 100x GibcoThermo Fisher Scientific35050038L-glutamine
Glutaraldehyde 25%Sigma-AldrichG588.2-50ML
Goat anti-mouse IgG Cy3Antibodies onlineABIN1673767polyclonal
Goat anti-mouse IgG DyLight 488Antibodies onlineABIN1889284polyclonal
Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 488Life TechnologiesA-11008
HClSigma-Aldrich30721-1LGL
HepatoZYME-SFM Thermo Fisher Scientific17705021hepatocyte maturation medium
HGFThermo Fisher ScientificPHG0324human recombinant
HNF4α antibodySigma-AldrichZRB1457-25ULclone 4C19 ZooMAb Rbmono
Hydrocortisone 21-hemisuccinate (sodium salt)BiomolCay18226-100
Knock out Serum Replacement - Multi Species GibcoFisher ScientificA3181501KSR
KnockOut DMEM/F-12Thermo Fisher Scientific12660012Discontinued. Available under Catalog No. 10-828-010
MACS BufferMiltenyi130-091-221
MACS MultiStandMiltenyi130-042-303magnetic stand
MEM NEAA 100x GibcoThermo Fisher Scientific11140035
MercaptoethanolThermo Fisher Scientific3135001050mM
MiniMACS columnsMiltenyi130-042-201
Nunclon MultidishesSigma-AldrichD67894 well plates
Oncostatin MThermo Fisher ScientificPHC5015human recombinant
ParaformaldehydeSigma-Aldrich158127
PBS sterileCarl Roth GmbH+Co. KG9143.2
Penicillin/StreptomycinBiochrom GmbHA221310000 U/ml
PS 15ml tubes sterileGreiner Bio-One188171
Rabbit anti-chicken IgG Texas redAntibodies onlineABIN637943
Roti Cell Iscoves MDMCarl Roth GmbH+Co. KG9033.1
Roti Mount FluorCare DAPICarl Roth GmbH+Co. KGHP20.1
Roti Sep 1077 humanCarl Roth GmbH+Co. KG0642.2
Transthyretin antibody Sigma-AldrichSAB3500378produced in chicken
Triton X-100Thermo Fisher ScientificHFH101%

References

  1. Fennema, E., Rivron, N., Rouwkema, J., van Blitterswijk, C., de Boer, J. Spheroid culture as a tool for creating 3D complex tissues. Trends in Biotechnology. 31 (2), 108-115 (2013).
  2. Ryu, N. E., Lee, S. H., Park, H. Spheroid culture system methods and applications for mesenchymal stem cells. Cells. 8 (12), 1620 (2019).
  3. Nevzorova, Y. A., Boyer-Diaz, Z., Cubero, F. J., Gracia-Sancho, J. Animal models for liver disease - A practical approach for translational research. Journal of Hepatology. 73 (2), 423-440 (2020).
  4. Ingelman-Sundberg, M., Lauschke, V. M. 3D human liver spheroids for translational pharmacology and toxicology. Basic and Clinical Pharmacology and Toxicology. 130, 5-15 (2022).
  5. Nelson, C. M., Bissell, M. J. Of extracellular matrix, scaffolds, and signalling: tissue architecture regulates development, homeostasis, and cancer. Annual review of cell and developmental biology. 22, 287-309 (2006).
  6. Khanna, S., Chauhan, A., Bhatt, A. N., Dwarakanath, B. S. R. Multicellular tumor spheroids as in vitro models for studying tumor responses to anticancer therapies. Animal Biotechnology (Second Edition). , 251-268 (2020).
  7. Rossi, G., Manfrin, A., Lutolf, M. P. Progress and potential in organoid research. Nature Reviews Genetics. 19 (11), 671-687 (2018).
  8. Riede, J., Wollmann, B. M., Molden, E., Ingelman-Sundberg, M. Primary human hepatocyte spheroids as an in vitro tool for investigating drug compounds with low clearance. Drug metabolism and disposition: The Biological Fate of Chemicals. 49 (7), 501-508 (2021).
  9. Soto-Gutierrez, A., et al. Differentiating stem cells into liver. Biotechnology & Genetic Engineering Reviews. 25, 149-163 (2008).
  10. Hurrell, T., et al. Human liver spheroids as a model to study aetiology and treatment of hepatic fibrosis. Cells. 9 (4), 964 (2020).
  11. Chen, S., et al. Hepatic spheroids derived from human induced pluripotent stem cells in bio-artificial liver rescue porcine acute liver failure. Cell Research. 30 (1), 95-97 (2020).
  12. Zhao, M., et al. Cytochrome P450 enzymes and drug metabolism in humans. International Journal of Molecular Sciences. 22 (23), 12808 (2021).
  13. Becker-Kojić, Z. A., Schott, A. K., Zipančić, I., Hernández-Rabaza, V. GM-Free generation of blood-derived neuronal cells. Journal of Visualized Experiments. (168), e61634 (2021).
  14. Marchenko, S., Flanagan, L. Immunocytochemistry: Human neural stem cells. Journal of Visualized Experiments. (7), e267 (2007).
  15. Crandall, B. F. Alpha-fetoprotein: a review. Critical Reviews in Clinical Laboratory Sciences. 15 (2), 127-185 (1981).
  16. Magalhães, J., Eira, J., Liz, M. A. The role of transthyretin in cell biology: impact on human pathophysiology. Cellular and Molecular Life Sciences 2021. 78 (17-18), 6105-6117 (2021).
  17. Huck, I., Gunewardena, S., Espanol-Suner, R., Willenbring, H., Apte, U. Hepatocyte nuclear factor 4 alpha activation is essential for termination of liver regeneration in mice. Hepatology. 70 (2), 666-681 (2019).
  18. Korver, S., et al. The application of cytokeratin-18 as a biomarker for drug-induced liver injury. Archives of Toxicology. 95 (11), 3435-3448 (2021).
  19. Klyushova, L. S., Perepechaeva, M. L., Grishanova, A. Y. The role of CYP3A in health and disease. Biomedicines. 10 (11), 2686 (2022).
  20. Fujino, C., Sanoh, S., Katsura, T. Variation in expression of cytochrome P450 3A isoforms and toxicological effects: endo- and exogenous substances as regulatory factors and substrates. Biological & Pharmaceutical Bulletin. 44 (11), 1617-1634 (2021).
  21. Hutchinson, M. R., Menelaou, A., Foster, D. J., Coller, J. K., Somogyi, A. A. CYP2D6 and CYP3A4 involvement in the primary oxidative metabolism of hydrocodone by human liver microsomes. British Journal of Clinical Pharmacology. 57 (3), 287-297 (2004).
  22. Asrani, S. K., Devarbhavi, H., Eaton, J., Kamath, P. S. Burden of liver diseases in the world. Journal of Hepatology. 70 (1), 151-171 (2019).
  23. Kammerer, S. Three-dimensional liver culture systems to maintain primary hepatic properties for toxicological analysis in vitro. International Journal of Molecular Sciences. 22 (19), 10214 (2021).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

191

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved