Esferoides do fígado humano do sangue periférico para estudos de doença hepática

Resumo

Aqui apresentamos um método não genético para gerar esferoides hepáticos autólogos humanos usando células mononucleares isoladas do sangue periférico em estado estacionário.

Resumo

As células hepáticas humanas podem formar uma estrutura tridimensional (3D) capaz de crescer em cultura por algumas semanas, preservando sua capacidade funcional. Devido à sua natureza de se agrupar nos pratos de cultura com características adesivas baixas ou nenhumas, eles formam agregados de múltiplas células hepáticas que são chamadas de esferoides hepáticos humanos. A formação de esferoides hepáticos 3D depende da tendência natural das células hepáticas de se agregarem na ausência de um substrato adesivo. Essas estruturas 3D possuem melhores respostas fisiológicas do que as células, que estão mais próximas de um ambiente in vivo. O uso de culturas de hepatócitos 3D tem inúmeras vantagens quando comparado com culturas bidimensionais clássicas (2D), incluindo um microambiente mais biologicamente relevante, morfologia arquitetônica que remonta órgãos naturais, bem como uma melhor predição sobre o estado da doença e respostas in vivo a drogas. Várias fontes podem ser usadas para gerar esferoides, como tecido hepático primário ou linhas celulares imortalizadas. O tecido hepático 3D também pode ser modificado usando células-tronco embrionárias humanas (hESCs) ou células-tronco pluripotentes induzidas (hiPSCs) para derivar hepatócitos. Obtivemos esferoides hepáticos humanos usando células-tronco pluripotentes derivadas do sangue (BD-PSCs) geradas a partir de sangue periférico não manipulado pela ativação de proteínas ligadas à GPI ligadas à membrana humana e diferenciadas aos hepatócitos humanos. As células hepáticas humanas derivadas de BD-PSCs e os esferoides hepáticos humanos foram analisados por microscopia de luz e imunofenotipagem usando marcadores de hepatócitos humanos.

Introdução

Nos últimos anos, os sistemas de cultura esferoides tridimensionais (3D) tornaram-se uma ferramenta importante para estudar várias áreas de pesquisa sobre o câncer, descoberta de medicamentos e toxicologia. Tais culturas despertam grande interesse porque preenchem a lacuna entre as monocamadas de cultura celular bidimensional (2D) e os órgãos complexos¹.

Na ausência de uma superfície adesiva, em comparação com a cultura de células 2D, a formação de esferoides é baseada na afinidade natural dessas células para se agruparem na forma 3D. Essas células se organizam em grupos que consistem em um ou mais tipos de células m....

Protocolo

Obteve-se aprovação ética (ACA CELL Biotech GmbH/25b-5482.2-64-1) para a realização desses experimentos e o termo de consentimento livre e esclarecido foi assinado por todos os doadores antes da extração do sangue, em conformidade com as diretrizes institucionais.

1. Preparação de células mononucleares (MNCs) a partir do sangue periférico humano (PB)

1. Extraia 30 mL de sangue de doadores saudáveis com a ajuda de pessoal médico treinado de acordo com o protocolo padrão.
2. Isolar PBMNCs utilizando meios de gradiente de densidade de acordo com o protocolo publicado por Becker-Kojić et ^al.13

Resultados

Diferenciamos com sucesso as BD-PSCs humanas em células progenitoras endodérmicas/hepáticas e hepatócitos aplicando um protocolo de duas etapas. As alterações morfológicas durante o processo de diferenciação hepática são mostradas na Figura 1. Os BD-PSCs se diferenciam em hepatócitos que passam por três estágios diferentes. O primeiro estágio representa a diferenciação em células endodérmicas L4, o segundo, a diferenciação em células progenitoras hepáticas (hepatoblast.......

Discussão

O fígado é um órgão importante no corpo humano com muitas funções biológicas essenciais, como a desintoxicação de metabólitos. Devido a falhas hepáticas graves, como cirrose e / ou hepatite viral, há quase 2 milhões de mortes por ano em todo o mundo. Os transplantes hepáticos ocupam o segundo lugar em transplantes de órgãos sólidos em todo o mundo, mas apenas cerca de 10% da necessidade atual é atendida²².

Hepatócitos humanos primários (PHH) são fre.......

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Albumin antibody	Sigma-Aldrich	SAB3500217	produced in chicken
Albumin Fraction V	Carl Roth GmbH+Co. KG	T8444.4
Alpha-1 Fetoprotein	Proteintech Germany GmbH	14550-1-AP	rabbit polyclonal IgG
Biolaminin 111 LN	BioLamina	LN111-02	human recombinant
CD45 MicroBeads	Miltenyi	130-045-801	nano-sized magnetic beads
Cell Strainer	pluriSelect	43-10040-40
CellSens	Olympus		imaging software
Centrifuge tubes 50 mL	Greiner Bio-One	210270
CEROplate 96 well	OLS OMNI Life Science	2800-109-96
CKX53	Olympus
Commercially available detergent	Procter & Gamble		nonionic detergent
CYP2E1-specific antibody	Proteintech Germany GmbH	19937-1-AP	rabbit polyclonal antibody IgG
CYP3A4	Proteintech Germany GmbH	67110-1-lg	mouse monoclonal antibody IgG1
Cytokeratin 18	DakoCytomation	M7010	mouse monoclonal antibody IgG1
DMSO	Sigma-Aldrich	D8418-50ML
DPBS	Thermo Fisher Scientific	14040091
FBS	Merck Millipore	S0115/1030B	Discontinued. Available under: TMS-013-B
Glass cover slips 14 mm	R. Langenbrinck	01-0014/1
GlutaMax 100x Gibco	Thermo Fisher Scientific	35050038	L-glutamine
Glutaraldehyde 25%	Sigma-Aldrich	G588.2-50ML
Goat anti-mouse IgG Cy3	Antibodies online	ABIN1673767	polyclonal
Goat anti-mouse IgG DyLight 488	Antibodies online	ABIN1889284	polyclonal
Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 488	Life Technologies	A-11008
HCl	Sigma-Aldrich	30721-1LGL
HepatoZYME-SFM	Thermo Fisher Scientific	17705021	hepatocyte maturation medium
HGF	Thermo Fisher Scientific	PHG0324	human recombinant
HNF4α antibody	Sigma-Aldrich	ZRB1457-25UL	clone 4C19 ZooMAb Rbmono
Hydrocortisone 21-hemisuccinate (sodium salt)	Biomol	Cay18226-100
Knock out Serum Replacement - Multi Species Gibco	Fisher Scientific	A3181501	KSR
KnockOut DMEM/F-12	Thermo Fisher Scientific	12660012	Discontinued. Available under Catalog No. 10-828-010
MACS Buffer	Miltenyi	130-091-221
MACS MultiStand	Miltenyi	130-042-303	magnetic stand
MEM NEAA 100x Gibco	Thermo Fisher Scientific	11140035
Mercaptoethanol	Thermo Fisher Scientific	31350010	50mM
MiniMACS columns	Miltenyi	130-042-201
Nunclon Multidishes	Sigma-Aldrich	D6789	4 well plates
Oncostatin M	Thermo Fisher Scientific	PHC5015	human recombinant
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	158127
PBS sterile	Carl Roth GmbH+Co. KG	9143.2
Penicillin/Streptomycin	Biochrom GmbH	A2213	10000 U/ml
PS 15ml tubes sterile	Greiner Bio-One	188171
Rabbit anti-chicken IgG Texas red	Antibodies online	ABIN637943
Roti Cell Iscoves MDM	Carl Roth GmbH+Co. KG	9033.1
Roti Mount FluorCare DAPI	Carl Roth GmbH+Co. KG	HP20.1
Roti Sep 1077 human	Carl Roth GmbH+Co. KG	0642.2
Transthyretin antibody	Sigma-Aldrich	SAB3500378	produced in chicken
Triton X-100	Thermo Fisher Scientific	HFH10	1%