Humane Lebersphäroide aus peripherem Blut für Studien zu Lebererkrankungen

Zusammenfassung

Hier stellen wir eine nicht-genetische Methode zur Erzeugung humaner autologer Lebersphäroide unter Verwendung mononukleärer Zellen vor, die aus peripherem Blut im stationären Zustand isoliert wurden.

Zusammenfassung

Menschliche Leberzellen können eine dreidimensionale (3D) Struktur bilden, die in der Lage ist, einige Wochen lang in Kultur zu wachsen und ihre Funktionsfähigkeit zu erhalten. Aufgrund ihrer Beschaffenheit, sich in den Kulturschalen mit geringen oder keinen Hafteigenschaften zu sammeln, bilden sie Aggregate mehrerer Leberzellen, die als menschliche Lebersphäroide bezeichnet werden. Die Bildung von 3D-Lebersphäroiden beruht auf der natürlichen Tendenz von Leberzellen, in Abwesenheit eines adhäsiven Substrats zu aggregieren. Diese 3D-Strukturen besitzen bessere physiologische Reaktionen als Zellen, die näher an einer In-vivo-Umgebung liegen. Die Verwendung von 3D-Hepatozytenkulturen hat im Vergleich zu klassischen zweidimensionalen (2D) Kulturen zahlreiche Vorteile, darunter eine biologisch relevantere Mikroumgebung, eine architektonische Morphologie, die natürliche Organe wieder zusammensetzt, sowie eine bessere Vorhersage des Krankheitszustands und der In-vivo-ähnlichen Reaktionen auf Medikamente. Verschiedene Quellen können verwendet werden, um Sphäroide zu erzeugen, wie primäres Lebergewebe oder immortalisierte Zelllinien. Das 3D-Lebergewebe kann auch unter Verwendung von humanen embryonalen Stammzellen (hES-Zellen) oder induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPS-Zellen) zur Ableitung von Hepatozyten hergestellt werden. Wir haben humane Lebersphäroide unter Verwendung von aus Blut gewonnenen pluripotenten Stammzellen (BD-PSCs) gewonnen, die aus unmanipuliertem peripherem Blut durch Aktivierung von humanem membrangebundenem GPI-verknüpftem Protein erzeugt und zu menschlichen Hepatozyten differenziert wurden. Die von BD-PSCs abgeleiteten menschlichen Leberzellen und menschlichen Lebersphäroide wurden durch Lichtmikroskopie und Immunphänotypisierung unter Verwendung humaner Hepatozytenmarker analysiert.

Einleitung

In den letzten Jahren haben sich dreidimensionale (3D) Sphäroidkultursysteme zu einem wichtigen Werkzeug entwickelt, um verschiedene Bereiche der Krebsforschung, Wirkstoffforschung und Toxikologie zu untersuchen. Solche Kulturen stoßen auf großes Interesse, da sie die Lücke zwischen zweidimensionalen (2D) Zellkultur-Monoschichten und komplexen Organen schließen¹.

In Ermangelung einer adhäsiven Oberfläche beruht die Bildung von Sphäroiden im Vergleich zur 2D-Zellkultur auf der natürlichen Affinität dieser Zellen zu Clustern in 3D-Form. Diese Zellen organisieren sich in Gruppen, die aus einer oder mehreren Arten reifer Zellen bestehen. Frei von Fremdstoffen interagieren diese Zellen miteinander wie in ihrer ursprünglichen Mikroumgebung. Die Zellen in der 3D-Kultur sind viel näher beieinander und haben eine richtige Ausrichtung zueinander, mit einer höheren extrazellulären Matrixproduktion als 2D-Kulturen, und bilden eine nahe an der natürlichen Umgebung ².

Tiermodelle werden seit langem verwendet, um die menschliche Biologie und Krankheiten zu untersuchen³. In dieser Hinsicht gibt es intrinsische Unterschiede zwischen Mensch und Tier, was diese Modelle für extrapolative Studien nicht vollständig geeignet macht. 3D-Kultursphäroide und -Organoide stellen ein vielversprechendes Werkzeug dar, um gewebeähnliche Architektur, Interaktion und Wechselwirkung zwischen verschiedenen Zelltypen zu untersuchen, die in vivo auftreten, und können dazu beitragen, Tiermodelle zu reduzieren oder sogar zu ersetzen. Sie sind von besonderem Interesse für die Untersuchung der Pathogenese von Lebererkrankungen sowie für Wirkstoff-Screening-Plattformen⁴.

Die 3D-Sphäroidkultur ist für die Krebsforschung von besonderer Bedeutung, da sie die Diskontinuität zwischen den Zellen und ihrer Umgebung beseitigen kann, indem sie den Bedarf an Trypsinisierung oder Kollagenasebehandlung reduziert, der für die Vorbereitung der Tumorzellmonoschichten für 2D-Kulturen erforderlich ist. Tumorsphäroide ermöglichen die Untersuchung, wie normale und bösartige Zellen Signale aus ihrer Umgebung empfangen und darauf reagieren⁵ und sind ein wichtiger Bestandteil tumorbiologischer Studien.

Im Vergleich zur Monoschicht ähneln 3D-Kulturen, die aus verschiedenen Zelltypen bestehen, in ihren strukturellen und funktionellen Eigenschaften Tumorgeweben und eignen sich daher für die Untersuchung von Metastasen und Invasionen von Tumorzellen. Deshalb tragen solche Sphäroidmodelle dazu bei, die Krebsforschung zu beschleunigen⁶.

Sphäroide tragen auch dazu bei, die Technologie zur Herstellung menschlicher Organoide zu entwickeln, da die Gewebe- und Organbiologie insbesondere beim Menschen sehr schwierig zu untersuchen ist. Fortschritte in der Stammzellkultur ermöglichen die Entwicklung von 3D-Kulturen wie Organoiden, die aus Stammzellen und Gewebevorläufern bestehen, sowie verschiedene Arten von reifen (Gewebe-)Zellen aus einem Organ mit einigen funktionellen Eigenschaften wie einem echten Organ, das zur Modellierung der Organentwicklung und von Krankheiten verwendet werden kann, aber auch in der regenerativen Medizin als nützlich angesehen werden^{kann 7}.

Primäre menschliche Hepatozyten werden normalerweise für die Untersuchung der In-vitro-Biologie menschlicher Hepatozyten, der Leberfunktion und der arzneimittelinduzierten Toxizität verwendet. Kulturen menschlicher Hepatozyten haben zwei Hauptnachteile, erstens die begrenzte Verfügbarkeit von primärem Gewebe wie menschlichen Hepatozyten und zweitens die Tendenz von Hepatozyten, sich in 2D-Kulturen schnell zu dedifferenzieren, wodurch ihre spezifische Hepatozytenfunktion verloren^{geht 8}. 3D-Leberkulturen sind in dieser Hinsicht überlegen und wurden kürzlich aus differenzierten humanen embryonalen Stammzellen (hES-Zellen) oder induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPS-Zellen) ^hergestellt9. Biotechnologisch hergestellte hepatische 3D-Sphäroide sind von besonderem Interesse für die Untersuchung der Entwicklung, Toxizität, genetischen und infektiösen Erkrankungen der Leber sowie für die Wirkstoffforschung zur Behandlung von Lebererkrankungen¹⁰. Schließlich haben sie auch das Potenzial, klinisch eingesetzt zu werden, da sie wissen, dass akute Lebererkrankungen eine Sterblichkeitsrate von fast 80 % aufweisen, biokünstliche Leber- und/oder Lebersphäroide diese Patienten möglicherweise retten könnten, indem sie eine partielle Leberfunktion bereitstellen, bis ein geeigneter Spender gefunden werden kann¹¹.

Wir haben ein Protokoll für die Erzeugung von humanen hepatischen Sphäroiden unter Verwendung von pluripotenten Stammzellen aus Blut (BD-PSCs) zur Herstellung unterschiedlich großer Sphäroide mit 4000 bis 1 x 10⁶ Zellen erstellt und mittels Lichtmikroskopie und Immunfluoreszenz analysiert. Wir testeten auch die Fähigkeit der Hepatozyten-spezifischen Funktion und bewerteten die Expression von Cytochrom P450 3A4 (CYP3A4) und 2E1 (CYP2E1) Enzymen, die zur Cytochrom-P450-Familie gehören und eine wichtige Rolle im Zell- und Arzneimittelstoffwechsel während des Entgiftungsprozesses spielen¹².

Protokoll

Für die Durchführung dieser Experimente wurde die ethische Genehmigung (ACA CELL Biotech GmbH/25b-5482.2-64-1) eingeholt und die Einverständniserklärung aller Spender vor der Blutentnahme in Übereinstimmung mit den institutionellen Richtlinien unterzeichnet.

1. Herstellung mononukleärer Zellen (MNCs) aus menschlichem peripherem Blut (PB)

1. Extrahieren Sie 30 ml Blut von gesunden Spendern mit Hilfe von geschultem medizinischem Personal gemäß dem Standardprotokoll.
2. Isolieren Sie PBMNCs mit Dichtegradientenmedien gemäß dem von Becker-Kojić et ^al.13 veröffentlichten Protokoll. Isolieren Sie durch Pipettieren die Interphasenschicht zwischen Plasma- und Dichtegradientenmedien und verwenden Sie sterile Phosphatpuffer-Kochsalzlösung (PBS), um die isolierten Zellen zu waschen.
3. Verwenden Sie eine Zählkammer und zählen Sie die Anzahl der Zellen mit Standardmethoden.

2. Dedifferenzierung von MNCs nach Aktivierung mit humanem GPI-verankertem Glykoprotein

1. 6 x 10⁶ mononukleäre Zellen in PBS/1% Rinderserumalbumin (BSA) in ein Polystyrolröhrchen (15 ml) geben und mit dem spezifischen Antikörper 30 min bei 37 °C nach Becker-Kojić et ^al.13 inkubieren.
2. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 300 x g bei Raumtemperatur und ersetzen Sie PBS/BSA durch Iscoves modifiziertes Dulbecco-Medium, das mit 10% fötalem Rinderserum (FBS) ergänzt wird.
3. Züchten Sie die Zellen in 15-ml-Polystyrolröhrchen in einem 5%igen CO₂ -Inkubator bei 37 °C für 8-10 Tage, wie in Becker-Kojić et ^al.13 beschrieben. Geben Sie an Tag 5 (D5) 1-2 ml Iscove-Medium, ergänzt mit 10% FBS, in jedes 15-ml-Röhrchen.

3. Sortierung neu erzeugter dedifferenzierter Zellen

1. Zentrifugieren Sie die kultivierte Zellsuspension bei Raumtemperatur für 10 min bei 300 x g und aspirieren Sie mit einer sterilen Pipette den resultierenden Überstand nach Becker-Kojić et ^al.13.
2. Resuspendieren Sie das durch Zentrifugation in 90 μl kaltem PBS-Puffer (PBS pH 7,2, 0,5 % BSA und 2 mM EDTA) erhaltene Pellet und fügen Sie 10 μl CD45-positive Magnetkügelchen in Nanogröße hinzu und inkubieren Sie es 15 Minuten lang auf Eis.
3. Waschen Sie die Zellsuspension mit 2 ml PBS-Puffer, zentrifugieren Sie sie bei 300 x g für 10 min bei Raumtemperatur und geben Sie 500 μl PBS-Puffer in die Zellen und resuspendieren Sie sie gründlich.
4. Pipettieren Sie 500 μl vorgekühlten PBS-Puffer zum Waschen in die Säule und legen Sie ihn mit einem Magnetständer in das Magnetfeld.
5. Waschen Sie die auf der Säule platzierten Zellen zweimal mit 500 μl PBS-Puffer und sammeln Sie Durchflusszellen, die CD45-negative Zellen enthalten, in Iscoves Medium, das mit 10% FBS ergänzt wird.
6. Verwenden Sie eine Zählkammer, um die Anzahl der umprogrammierten Zellen zu bestimmen.

4. Herstellung von Glasdeckgläsern für die Erzeugung menschlicher Hepatozyten

1. Glasdeckgläser (14 mm) trennen und 10 min in nichtionischem Reinigungsmittel inkubieren. Waschen Sie Glasdeckgläser in deionisiertem Wasser, bis keine Blasen mehr vorhanden sind, und inkubieren Sie sie 30 Minuten lang in 1M HCl (nach Marchenko et ^al.14).
2. Waschen Sie Glasdeckgläser mindestens 3x mit deionisiertem Wasser und trocknen Sie sie über Nacht bei Raumtemperatur. Autoklavieren Sie getrocknete Glasdeckgläser in einem geeigneten Behälter.

5. Beschichtung von Zellkulturplatten mit Biolaminin zur 2D-hepatischen Differenzierung von BD-PSCs

1. Legen Sie autoklavierte Glasdeckgläser mit einer sterilen Pinzette in 4-Well-Platten und schalten Sie das UV-Licht 30 Minuten lang ein, um sterile Bedingungen zu gewährleisten.
2. Tauen Sie Aliquots von Biolaminin auf und geben Sie 120 μl 5 μg/ml Biolaminin in jedes Glasdeckglas. Lassen Sie die beschichteten Glasdeckgläser über Nacht bei 4 °C stehen.
3. Entfernen Sie den Überschuss an Biolaminin und fügen Sie 200 μl Hepatozyten-Differenzierungsmedium hinzu, wie unten beschrieben.

6. Herstellung von Hepatozyten-Differenzierungsmedien

1. Stellen Sie 500 ml Hepatoblast-Knockout-Serumersatz (KSR)/Dimethylsulfoxid (DMSO)-Medium her, bestehend aus 76,4 % Knockout-DMEM (KO-DMEM), 20 % KSR, 0,5 % L-Glutamin, 1 % nicht-essentiellen Aminosäuren (NEAA), 0,1 % β-Mercaptoethanol, 1 % DMSO und 1 % Penicillin-Streptomycin (Pen/Streptokokken).
2. Bereiten Sie 500 ml Hepatozyten-Reifungsmedium vor, das 1 % L-Glutamin, 10 μM Hydrocortison-21-Hemisuccinat-Natriumsalz (HCC) und 1 % Pen/Streptokokken enthält.
3. Aliquotes Medium aus dem Stamm und Zugabe von frischem Hepatozytenwachstumsfaktor (HGF) und Oncostatin M (OSM) in Endkonzentrationen von 10 ng/ml und/oder 20 ng/ml für jeden Mediumwechsel.
   HINWEIS: Oncostatin M ist ein Zytokin aus der Interleukin-6-Gruppe von Zytokinen, das sowohl für die Hämatopoese als auch für die Leberentwicklung wichtig ist.

7. Kultivierung von Leberzellen, die sich von BD-PSCs unterscheiden

1. Geben Sie 3 x 10⁵ BD-PSCS-Zellen in jede Vertiefung einer mit Biolaminin beschichteten 4-Well-Platte.
2. Stellen Sie die 4-Well-Platten bei 37 °C und 5 % CO₂ in den Inkubator. Kultivieren Sie die Zellen für 5 Tage in KSR/DMSO-Hepatoblast-Medium, das die endodermale Differenzierung unterstützt, und wechseln Sie das Medium jeden zweiten Tag.
3. Wechseln Sie am 5. Tag auf Hepatozyten-Reifungsmedium und kultivieren Sie die Zellen für weitere 7-10 Tage im Inkubator bei 37 °C und 5% CO₂ . Wechseln Sie das Medium alle 48 h.

8.3D sphäroide hepatische Differenzierung

1. Zählen Sie die Zellen mit einer Zählkammer.
2. BD-dedifferenzierte Zellsuspension bei 300 x g 10 min bei Raumtemperatur zentrifugieren. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie BD-dedifferenzierte Zellen in KSR/DMSO-Medium bei 2 x 10⁶ Zellen/ml.
3. Führen Sie die Zellen durch ein 40-μm-Zellsieb, um eine Einzelzellsuspension zu gewährleisten und zusätzliche Ablagerungen zu entfernen.
4. Zählen Sie die Zellen mit einer Zählkammer und bereiten Sie für jede Zellaussaatdichte ein ausreichendes Volumen vor, um das erforderliche Volumen pro Vertiefung abzugeben. Bereiten Sie einen Gradienten mit Top-Seeding von 1 x 10⁶ Zellen bis zu einer niedrigen Seeding-Dichte von 4000 Zellen vor.
5. Geben Sie 100 μl KSR/DMSO-Medium in 96 gut niedrige Aufsatzplatten ab und fügen Sie 100 μl Zellaussaatverdünnung hinzu.
6. Legen Sie die niedrige Aufsatzplatte bei 37 °C und 5% CO₂ in den Inkubator und kultivieren Sie sie 5 Tage lang.
7. Wechseln Sie 50% des Mediums von den Tagen 3-4 nach der Aussaat, wenn die Sphäroide ausreichend kompakt sind.
8. Ändern Sie am 5. Tag das Medium in das Reifungsmedium der Hepatozyten und kultivieren Sie die Zellen für weitere 7-10 Tage zur weiteren Reifung. Wechseln Sie das Medium jeden zweiten Tag.

9. Immunfluoreszenzanalyse von neu erzeugten 2D-Leberzellkulturen

1. Kultivieren Sie die Zellen nach der oben beschriebenen Differenzierungsmethode für 4, 8, 15 und 24 Tage und entfernen Sie Medien.
2. Inkubieren Sie die Zellen mit einem vorgewärmten Fixiermittel, das aus 4% Paraformaldehyd in PBS besteht, für 10 Minuten. Entsorgen Sie das Fixiermittel und waschen Sie die Zellen 2x mit PBS für jeweils 5 Minuten. Fügen Sie sofort 0,1% Triton X-100-Lösung hinzu und permeabilisieren Sie die Zellen für 5 Minuten. 2x mit PBS waschen.
3. Blockierende Lösung aus PBS und 5% BSA zugeben und 1 h bei Raumtemperatur auf die Kippplatte legen.
4. Verdünnen Sie primäre Antikörper in Verdünnungspuffer 1% BSA/PBS wie folgt: Albumin (ALB) 1:50, Alpha-1-Fetoprotein (AFP) 1:250, Zytokeratin 18 (CK18) 1:50, Hepatozytenkernfaktor 4 alpha (HNF4α) 1:1000 und Transthyretin (TTR) 1:50. Verwenden Sie 50 μl Antikörperverdünnung pro Vertiefung.
5. Inkubieren Sie die Zellen 1 h bei Raumtemperatur. Entsorgen Sie dann die Antikörperlösung, waschen Sie die Zellen 5 Minuten lang und wiederholen Sie den Waschschritt 3x.
6. Bereiten Sie die folgenden sekundären Antikörper im Verdünnungspuffer vor: Kaninchen-Anti-Huhn-IgG (Texas-Rot) 1:1000, Ziegen-Anti-Maus-IgG (488) 1:1000 und Ziegen-Anti-Kaninchen (488) 1:500. Verwenden Sie 50 μl Antikörperverdünnung pro Vertiefung und inkubieren Sie die Zellen 30 Minuten lang bei Raumtemperatur.
7. Waschen Sie die Zellen 3x mit PBS für jeweils 5 min und montieren Sie die Deckgläser mit DAPI-haltigen Einpackmedien für die mikroskopische Analyse.

10. Lebendfärbung neu gebildeter Lebersphäroide

1. Entsorgen Sie die Nährmedien vorsichtig, ohne die Sphäroide zu berühren, fügen Sie frisch hergestelltes PBS mit 0,1% Triton X-100-Lösung hinzu und inkubieren Sie es 5 Minuten lang, um die Zellen zu permeabilisieren.
2. Waschen Sie die Sphäroide mit dem Medium durch langsames Pipettieren für 5 min, wiederholen Sie den Vorgang 2x.
3. Die Sphäroide werden mit den Primärantikörpern ALB (1:50), AFP (1:250), CK18 (1:50), CYP2E1 (1:200) und CYP3A4 (1:200) inkubiert, die in PBS mit 1% BSA für 1 h in einem 5% CO₂ -Inkubator bei 37 °C hergestellt wurden. Verwenden Sie 50 μl Antikörperverdünnung pro Vertiefung.
4. Entfernen Sie vorsichtig die überschüssige Antikörperlösung und waschen Sie die Sphäroide 3x mit medium.
5. Bereiten Sie die entsprechenden sekundären Antikörper Ziegen-Anti-Maus-IgG (Cy3), Ziegen-Anti-Maus-IgG (488) und Kaninchen-Anti-Huhn-IgG (Texas-Rot) in einer Verdünnung von 1:1000 und 1:500 für Ziegen-Anti-Kaninchen (488) in PBS in 1% BSA vor. Verwenden Sie 50 μl Antikörperverdünnung pro Vertiefung und inkubieren Sie sie 20 Minuten lang im Inkubator bei 37 °C und 5 % CO₂.
6. Waschen Sie die Platte vorsichtig 3x mit Medium und lassen Sie die Platte 30 Minuten im Inkubator bei 37 °C und 5% CO₂ , bevor Sie eine Fluoreszenzmikroskopie durchführen.

11. Untersuchung von Sphäroiden mit einem Fluoreszenzmikroskop

1. Schalten Sie die Fluoreszenzlichtquelle 10 Minuten vor Gebrauch ein, schalten Sie den Computer ein und öffnen Sie die Bildgebungssoftware.
2. Verwenden Sie ein Objektiv mit 4-facher Vergrößerung, klicken Sie auf die Schaltfläche 4x in der Symbolleiste, um die richtige Maßstabsleiste auszuwählen, und legen Sie dann die 96-Well-Platte auf die Tischmittelplatte.
3. Schalten Sie die LED-Lichtquelle ein, verwenden Sie den Hellfeldfilter und positionieren Sie die Platte mit dem Einstellknopf für die x-y-Achse an der gewünschten Vertiefung.
4. Wechseln Sie zum Lichtweg der Kamera, klicken Sie auf die Schaltfläche Live in der Bildbearbeitungssoftware, um das Bild auf dem Bildschirm zu visualisieren, und stellen Sie sicher, dass das Sphäroid mit den Knöpfen der X-Y-Achse zentriert und mit dem Grob-/Feinfokusknopf fokussiert ist.
   HINWEIS: Die Form der Sphäroide bleibt nach dem Auftragen der Lebendfärbung konstant.
5. Wählen Sie in der Symbolleiste die Hellfeld-Beobachtungsmethode , stellen Sie die Belichtungseinstellungen auf "Automatisch" und klicken Sie auf die Schaltfläche "Schnappschuss " in der Kamerasteuerung, um ein Bild aufzunehmen. Speichern Sie dann das Bild als VSI-Datei unter dem entsprechenden Namen im gewünschten Ordner.
6. Platzieren Sie die Umgebungslichtabschirmplatte, um das LED-Licht auszuschalten, wechseln Sie zum Filter für die B-Anregung, wählen Sie 488 Beobachtungsmethode in der Symbolleiste, öffnen Sie den Verschluss, nehmen Sie ein Bild auf, indem Sie auf die Schaltfläche Schnappschuss klicken, schließen Sie den Verschluss und speichern Sie die Datei wie oben beschrieben.
7. Wiederholen Sie dies mit einem Filter für die G-Anregung mit der entsprechenden Beobachtungsmethode (Texas Red oder CY3). Wiederholen Sie dann das gesamte Verfahren für jede interessante Bohrung.
8. Legen Sie die Platte bei 37 °C wieder in den 5 % CO₂ -Inkubator und kultivieren Sie sie wie oben beschrieben.

Ergebnisse

Wir haben humane BD-PSCs erfolgreich in Endoderm-/hepatische Vorläuferzellen und Hepatozyten differenziert, indem wir ein zweistufiges Protokoll angewendet haben. Morphologische Veränderungen während des hepatischen Differenzierungsprozesses sind in Abbildung 1 dargestellt. BD-PSCs differenzieren sich in Hepatozyten, die drei verschiedene Stadien durchlaufen. Die erste Stufe stellt die Differenzierung in endodermale Zellen L4 dar, die zweite die Differenzierung zu hepatischen Vorläuferze...

Diskussion

Die Leber ist ein wichtiges Organ im menschlichen Körper mit vielen wesentlichen biologischen Funktionen, wie z.B. der Entgiftung von Metaboliten. Aufgrund schwerer Leberversagen wie Leberzirrhose und/oder Virushepatitis gibt es weltweit fast 2 Millionen Todesfälle pro Jahr. Lebertransplantationen stehen weltweit an zweiter Stelle bei Transplantationen solider Organe, aber nur etwa 10% des derzeitigen Bedarfs werden gedeckt²².

Primäre humane Hepatozyten (PHH) werden ...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Albumin antibody	Sigma-Aldrich	SAB3500217	produced in chicken
Albumin Fraction V	Carl Roth GmbH+Co. KG	T8444.4
Alpha-1 Fetoprotein	Proteintech Germany GmbH	14550-1-AP	rabbit polyclonal IgG
Biolaminin 111 LN	BioLamina	LN111-02	human recombinant
CD45 MicroBeads	Miltenyi	130-045-801	nano-sized magnetic beads
Cell Strainer	pluriSelect	43-10040-40
CellSens	Olympus		imaging software
Centrifuge tubes 50 mL	Greiner Bio-One	210270
CEROplate 96 well	OLS OMNI Life Science	2800-109-96
CKX53	Olympus
Commercially available detergent	Procter & Gamble		nonionic detergent
CYP2E1-specific antibody	Proteintech Germany GmbH	19937-1-AP	rabbit polyclonal antibody IgG
CYP3A4	Proteintech Germany GmbH	67110-1-lg	mouse monoclonal antibody IgG1
Cytokeratin 18	DakoCytomation	M7010	mouse monoclonal antibody IgG1
DMSO	Sigma-Aldrich	D8418-50ML
DPBS	Thermo Fisher Scientific	14040091
FBS	Merck Millipore	S0115/1030B	Discontinued. Available under: TMS-013-B
Glass cover slips 14 mm	R. Langenbrinck	01-0014/1
GlutaMax 100x Gibco	Thermo Fisher Scientific	35050038	L-glutamine
Glutaraldehyde 25%	Sigma-Aldrich	G588.2-50ML
Goat anti-mouse IgG Cy3	Antibodies online	ABIN1673767	polyclonal
Goat anti-mouse IgG DyLight 488	Antibodies online	ABIN1889284	polyclonal
Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 488	Life Technologies	A-11008
HCl	Sigma-Aldrich	30721-1LGL
HepatoZYME-SFM	Thermo Fisher Scientific	17705021	hepatocyte maturation medium
HGF	Thermo Fisher Scientific	PHG0324	human recombinant
HNF4α antibody	Sigma-Aldrich	ZRB1457-25UL	clone 4C19 ZooMAb Rbmono
Hydrocortisone 21-hemisuccinate (sodium salt)	Biomol	Cay18226-100
Knock out Serum Replacement - Multi Species Gibco	Fisher Scientific	A3181501	KSR
KnockOut DMEM/F-12	Thermo Fisher Scientific	12660012	Discontinued. Available under Catalog No. 10-828-010
MACS Buffer	Miltenyi	130-091-221
MACS MultiStand	Miltenyi	130-042-303	magnetic stand
MEM NEAA 100x Gibco	Thermo Fisher Scientific	11140035
Mercaptoethanol	Thermo Fisher Scientific	31350010	50mM
MiniMACS columns	Miltenyi	130-042-201
Nunclon Multidishes	Sigma-Aldrich	D6789	4 well plates
Oncostatin M	Thermo Fisher Scientific	PHC5015	human recombinant
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	158127
PBS sterile	Carl Roth GmbH+Co. KG	9143.2
Penicillin/Streptomycin	Biochrom GmbH	A2213	10000 U/ml
PS 15ml tubes sterile	Greiner Bio-One	188171
Rabbit anti-chicken IgG Texas red	Antibodies online	ABIN637943
Roti Cell Iscoves MDM	Carl Roth GmbH+Co. KG	9033.1
Roti Mount FluorCare DAPI	Carl Roth GmbH+Co. KG	HP20.1
Roti Sep 1077 human	Carl Roth GmbH+Co. KG	0642.2
Transthyretin antibody	Sigma-Aldrich	SAB3500378	produced in chicken
Triton X-100	Thermo Fisher Scientific	HFH10	1%