用于肝病研究的外周血人肝球

摘要

在这里，我们提出了一种使用从稳态外周血分离的单核细胞产生人类自体肝球的非遗传方法。

摘要

人肝细胞可以形成三维（3D）结构，能够在培养物中生长数周，保持其功能能力。由于它们在具有低粘附特性或无粘附特性的培养皿中聚集的性质，它们形成多个肝细胞的聚集体，称为人肝球体。3D肝球体的形成依赖于肝细胞在没有粘性基质的情况下聚集的自然趋势。这些3D结构比更接近 体内 环境的细胞具有更好的生理反应。与传统的二维（2D）培养物相比，使用3D肝细胞培养物具有许多优势，包括生物学相关性更高的微环境，重组天然器官的结构形态以及更好地预测疾病状态和 体内对药物的反应。各种来源可用于生成球状体，如原代肝组织或永生化细胞系。3D肝组织也可以通过使用人类胚胎干细胞（hESC）或诱导多能干细胞（hiPSC）来衍生肝细胞来设计。我们使用血液来源的多能干细胞（BD-PSC）获得了人肝球体，该干细胞通过激活人膜结合的GPI连接蛋白由未经操纵的外周血产生，并分化为人肝细胞。采用人肝细胞标志物进行光学显微镜和免疫分型分析BD-PSCs来源的人肝细胞和人肝球。

引言

近年来，三维（3D）球状体培养系统已成为研究癌症研究，药物发现和毒理学各个领域的重要工具。这种培养物引起了极大的兴趣，因为它们弥合了二维（2D）细胞培养单层和复杂器官之间的差距¹。

在没有粘合表面的情况下，与2D细胞培养物相比，球状体的形成基于这些细胞以3D形式聚集的天然亲和力。这些细胞将自己组织成由一种或多种成熟细胞组成的组。这些细胞没有异物，像在原始微环境中一样相互作用。3D培养中的细胞更近，彼此之间具有适当的方向，比2D培养物具有更高的细胞外基质产生，并构成接近自然的环境 ²。

动物模型长期以来一直用于研究人类生物学和疾病³.在这方面，人类和动物之间存在内在差异，这使得这些模型并不完全适合外推研究。3D培养球体和类器官代表了一种有前途的工具，用于研究 体内 发生的不同细胞类型之间的组织样结构，相互作用和串扰，并有助于减少甚至取代动物模型。它们对研究肝病的发病机制以及药物筛选平台特别感兴趣⁴.

3D球状体培养对于癌症研究尤为重要，因为它可以通过减少制备用于2D培养的肿瘤细胞单层所需的胰蛋白酶消化或胶原酶处理的需要来消除细胞与其环境之间的不连续性。肿瘤球状体能够研究正常细胞与恶性细胞如何接收和响应来自周围环境的信号⁵ ，并且是肿瘤生物学研究的重要组成部分。

与单层相比，由各种细胞类型组成的3D培养物在结构和功能特性上类似于肿瘤组织，因此适用于研究肿瘤细胞的转移和侵袭。这就是为什么这种球体模型有助于加速癌症研究⁶。

球状体也有助于开发制造人类类器官的技术，因为组织和器官生物学的研究非常具有挑战性，特别是在人类中。干细胞培养的进步使得开发3D培养成为可能，例如由干细胞和组织祖细胞组成的类器官，以及来自具有某些功能特征的器官的不同类型的成熟（组织）细胞，例如可用于模拟器官发育，疾病的真实器官，但它们也可以被认为在再生医学中有用⁷。

原代人肝细胞通常用于研究人肝细胞的 体外 生物学、肝功能和药物诱导的毒性。人肝细胞培养有两个主要缺点，首先，原代组织（如人肝细胞）的可用性有限，其次，肝细胞在2D培养中倾向于快速去分化，从而失去其特定的肝^{细胞功能8}。3D肝培养物在这方面具有优越性，最近由分化的人胚胎干细胞（hESC）或诱导多能干细胞（hiPSC）制成⁹。生物工程肝3D球体对研究肝脏的发展，毒性，遗传和传染病以及用于治疗肝脏疾病的药物发现特别感兴趣¹⁰。最后，它们也有潜力用于临床，知道急性肝病的死亡率接近80%，生物人工肝和/或肝球可以通过提供部分肝功能来拯救这些患者，直到找到合适的供体¹¹。

我们已经建立了一个使用血液来源的多能干细胞（BD-PSC）生成人肝球的方案，以制备含有4000至1 x 10⁶ 细胞的不同大小的球体，并通过光学显微镜和免疫荧光对其进行分析。我们还测试了肝细胞特异性功能的能力，评估了属于细胞色素P450家族的细胞色素P450 3A4（CYP3A4）和2E1（CYP2E1）酶的表达，这些酶通过解毒过程在细胞和药物代谢中起重要作用¹²。

研究方案

进行这些实验获得了伦理批准（ACA CELL Biotech GmbH/25b-5482.2-64-1），所有献血者在抽血前都签署了知情同意书，符合机构指南。

1. 从人外周血（PB）制备单核细胞（MNC）

1. 根据标准方案，在训练有素的医务人员的帮助下，从健康献血者中提取 30 mL 血液。
2. 根据Becker-Kojić等人发表的协议，使用密度梯度培养基分离PBMNC13。通过移液分离血浆和密度梯度培养基之间的界面层，并使用无菌磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗涤分离的细胞。
3. 使用计数室并使用标准方法计数细胞数。

2. MNC在用人GPI锚定糖蛋白激活时的去分化

1. 将6 x 10⁶ 个单核细胞置于聚苯乙烯管（15mL）中的PBS / 1%牛血清白蛋白（BSA）中，并根据Becker-Kojić等人在37°C下与特异性抗体孵育30分钟¹³。
2. 在室温下以300 x g 离心细胞，并用补充有10%胎牛血清（FBS）的Iscove改良Dulbecco培养基代替PBS / BSA。
3. 如Becker-Kojić等人¹³中所述，在37°C的5%CO₂培养箱中在15mL聚苯乙烯管中培养细胞8-10天。在第 5 天 （D5） 时，向每 15 mL 试管中加入 1-2 mL 补充有 10% FBS 的 Iscove 培养基。

3. 新生成的去分化细胞的分选

1. 根据Becker-Kojić等人，在室温下以300× g 离心培养的细胞悬液10分钟，并用无菌移液管吸出所得的上清液¹³。
2. 重悬通过离心获得的沉淀在 90 μL 冷 PBS 缓冲液（PBS pH 7.2、0.5% BSA 和 2 mM EDTA）中，并加入 10 μL CD45 阳性纳米磁珠并在冰上孵育 15 分钟。
3. 用 2 mL PBS 缓冲液洗涤细胞悬液，在室温下以 300 x g 离心 10 分钟，并向细胞中加入 500 μL PBS 缓冲液并彻底重悬。
4. 将 500 μL 预冷的 PBS 缓冲液移液到色谱柱中洗涤并使用磁性支架将其置于磁场中。
5. 用 500 μL PBS 缓冲液洗涤放置在色谱柱上的细胞两次，并在补充有 10% FBS 的 Iscove 培养基中收集含有 CD45 阴性细胞的流通细胞。
6. 使用计数室确定重新编程的细胞数量。

4.用于生成人肝细胞的玻璃盖玻片的制备

1. 分离玻璃盖玻片（14毫米）并将其在非离子洗涤剂中孵育10分钟。在去离子水中清洗玻璃盖玻片，直到没有气泡残留，并在1M HCl中孵育30分钟（改编自Marchenko等人¹⁴）。
2. 用去离子水清洗玻璃盖玻片至少3次，并在室温下干燥过夜。在合适的容器中高压灭菌干燥的玻璃盖玻片。

5. 用生物层粘连蛋白包被细胞培养板，用于BD-PSC的2D肝分化

1. 将高压灭菌的玻璃盖玻片与一对无菌镊子放在4孔板中，并打开紫外线灯30分钟以确保无菌条件。
2. 解冻等分试样的生物层粘连蛋白，并向每个玻璃盖玻片中加入 120 μL 5 μg/mL 生物层粘连蛋白。将涂层玻璃盖玻片在4°C下放置过夜。
3. 去除过量的生物层粘连蛋白并加入 200 μL 肝细胞分化培养基，如下所述。

6.肝细胞分化培养基的制备

1. 制成 500 mL 成肝细胞敲除血清替代 （KSR）/二甲基亚砜 （DMSO） 培养基，由 76.4% 敲除 DMEM （KO-DMEM）、20% KSR、0.5% L-谷氨酰胺、1% 非必需氨基酸 （NEAA）、0.1% β-巯基乙醇、1% DMSO 和 1% 青霉素-链霉素（笔/链球菌）组成。
2. 制备 500 mL 肝细胞成熟培养基，其中含有 1% L-谷氨酰胺、10 μM 氢化可的松 21-半琥珀酸钠盐 （HCC） 和 1% 笔/链球菌。
3. 从原液中分装培养基，并加入新鲜肝细胞生长因子 （HGF） 和昂科斯塔汀 M （OSM），终浓度为 10 ng/mL 和/或 20 ng/mL，每次培养基变化。
   注意:Oncostatin M是一种细胞因子，属于白细胞介素6组细胞因子，对造血和肝脏发育很重要。

7. 培养从BD-PSCs分化的肝细胞

1. 将3 x 10⁵ BD-PSCS细胞放入涂有生物层粘连蛋白的4孔板的每个孔中。
2. 将4孔板置于37°C和5%CO₂的培养箱中。在支持内胚层分化的KSR / DMSO成肝细胞培养基中培养细胞5天，并每隔一天更换一次培养基。
3. 在第5天切换到肝细胞成熟培养基，并在37°C和5%CO₂的培养箱中再培养细胞7-10天。每48小时更换一次培养基。

8.3D球状体肝分化

1. 使用计数室对细胞进行计数。
2. 在室温下以300× g 离心BD去分化细胞悬液10分钟。除去上清液并以 2 x 10⁶ 个细胞/mL 重悬于 KSR/DMSO 培养基中。
3. 将细胞通过40μm细胞过滤器，以确保单细胞悬液并去除任何其他碎片。
4. 使用计数室对细胞进行计数，并为每个细胞接种密度准备足够的体积，以便分配每个孔所需的体积。准备一个梯度，顶部接种1 x 10⁶ 个细胞至4000个细胞的低接种密度。
5. 将 100 μL KSR/DMSO 培养基分配到 96 个孔低的附着板中，并加入 100 μL 细胞接种稀释液。
6. 将低附着板置于37°C和5%CO₂ 的培养箱中，并培养5天。
7. 在接种后第3-4天，当球体足够致密时，更换50%的培养基。
8. 在第5天，将培养基更换为肝细胞成熟培养基，并将细胞再培养7-10天以进一步成熟。每隔一天更换一次培养基。

9. 新生成的2D肝细胞培养物的免疫荧光分析

1. 根据上述分化方法培养细胞4、8、15和24天并除去培养基。
2. 用PBS中由4%多聚甲醛组成的预热固定剂孵育细胞10分钟。丢弃固定剂，用PBS洗涤细胞2次，每次5分钟。立即加入0.1%Triton X-100溶液并使细胞透化5分钟。用PBS清洗2次。
3. 加入由PBS和5%BSA制成的封闭溶液，并在室温下置于摇臂板上1小时。
4. 在稀释缓冲液 1% BSA/PBS 中稀释一抗如下:白蛋白 （ALB） 1:50，α-1 胎蛋白 （AFP） 1:250，细胞角蛋白 18 （CK18） 1:50，肝细胞核因子 4 α （HNF4α） 1:1000 和甲状腺素转运蛋白 （TTR） 1:50。每孔使用 50 μL 抗体稀释液。
5. 将细胞在室温下孵育1小时。然后弃去抗体溶液，洗涤细胞5分钟，重复洗涤步骤3x。
6. 在稀释缓冲液中制备以下二抗:兔抗鸡IgG（德克萨斯红）1:1000，山羊抗小鼠IgG（488）1:1000和山羊抗兔（488）1:500。每孔使用50μL抗体稀释液，并在室温下孵育细胞30分钟。
7. 用PBS洗涤细胞3次，每次5分钟，并用含有DAPI的封片剂安装盖玻片进行显微镜分析。

10. 新形成的肝球体的活染色

1. 在不接触球体的情况下小心丢弃培养基，加入含有0.1%Triton X-100溶液的新鲜PBS，并孵育5分钟以透化细胞。
2. 用培养基缓慢移液5分钟洗涤球体，重复2次。
3. 将球状体与一抗ALB（1:50），AFP（1:250），CK18（1:50），CYP2E1（1:200）和CYP3A4（1:200）一起孵育在PBS中制备，1%BSA在37°C的5%CO₂ 培养箱中孵育1小时。 每孔使用 50 μL 抗体稀释液。
4. 小心地除去多余的抗体溶液，并用培养基3x洗涤球状体。
5. 在1%BSA中的PBS中以1:1000和1:500的稀释度制备相应的二抗山羊抗小鼠IgG（Cy3），山羊抗小鼠IgG（488）和兔抗鸡IgG（德克萨斯红）。每孔使用50μL抗体稀释液，并在培养箱中以37°C和5%CO₂孵育20分钟。
6. 在进行荧光显微镜检查之前，用培养基仔细洗涤3x，并将板在37°C和5%CO₂ 的培养箱中放置30分钟。

11. 使用荧光显微镜检查球体

1. 使用前10分钟打开荧光光源，打开电脑，打开成像软件。
2. 使用放大倍率为4倍的物镜，单击工具栏中的 按钮4x 以选择正确的比例尺，然后将96孔板放在载物台中心板上。
3. 打开LED光源，使用明场滤光片，并使用x-y轴载物台调节旋钮将板定位到感兴趣的孔中。
4. 切换到相机光路，单击按钮实时成像软件以在屏幕上可视化图像，并确保使用 x-y 轴旋钮对准球体，并使用粗/细对焦旋钮对焦。
   注意:应用活染色后，球体的形状保持不变。
5. 选择工具栏中的 明场观察 方法，将曝光设置设置为自动，然后单击相机控制面板中的 快照 按钮以拍照。然后使用感兴趣的文件夹中的相应名称将图片另存为 .vsi 文件。
6. 放置环境光屏蔽板关闭LED灯，更换为B激发滤光片，在工具栏中选择 488 观察方法，打开快门，点击 快照按钮拍照，关闭快门，然后如上所述保存文件。
7. 使用适当的观察方法（德克萨斯红或CY3）用G激发过滤器重复此操作。然后重复每个感兴趣的井的整个过程。
8. 将板返回到37°C的5%CO₂ 培养箱中并如上所述进行培养。

结果

我们通过应用两步方案成功地将人BD-PSC分化为内胚层/肝祖细胞和肝细胞。肝分化过程中的形态变化如图 1所示。BD-PSCs分化成肝细胞，经历三个不同的阶段。第一阶段代表分化为内胚层细胞L4，第二阶段分化为肝祖细胞（成肝细胞）L8，表现出典型的多边形形态，第三阶段代表成熟为肝细胞L15-L24。

进行免疫荧光分析以确认BD-PSC的肝脏分化，如图

讨论

肝脏是人体的主要器官，具有许多基本的生物学功能，例如代谢物的解毒。由于肝硬化和/或病毒性肝炎等严重肝功能衰竭，全世界每年有近200万人死亡。肝移植在全球实体器官移植中排名第二，但目前的需求仅得到满足约10%²²。

原代人肝细胞（PHH）通常用于研究肝毒性。这些细胞可以在培养物中维持短时间，保留其特定功能。此外，来自单个供体的细胞数?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Albumin antibody	Sigma-Aldrich	SAB3500217	produced in chicken
Albumin Fraction V	Carl Roth GmbH+Co. KG	T8444.4
Alpha-1 Fetoprotein	Proteintech Germany GmbH	14550-1-AP	rabbit polyclonal IgG
Biolaminin 111 LN	BioLamina	LN111-02	human recombinant
CD45 MicroBeads	Miltenyi	130-045-801	nano-sized magnetic beads
Cell Strainer	pluriSelect	43-10040-40
CellSens	Olympus		imaging software
Centrifuge tubes 50 mL	Greiner Bio-One	210270
CEROplate 96 well	OLS OMNI Life Science	2800-109-96
CKX53	Olympus
Commercially available detergent	Procter & Gamble		nonionic detergent
CYP2E1-specific antibody	Proteintech Germany GmbH	19937-1-AP	rabbit polyclonal antibody IgG
CYP3A4	Proteintech Germany GmbH	67110-1-lg	mouse monoclonal antibody IgG1
Cytokeratin 18	DakoCytomation	M7010	mouse monoclonal antibody IgG1
DMSO	Sigma-Aldrich	D8418-50ML
DPBS	Thermo Fisher Scientific	14040091
FBS	Merck Millipore	S0115/1030B	Discontinued. Available under: TMS-013-B
Glass cover slips 14 mm	R. Langenbrinck	01-0014/1
GlutaMax 100x Gibco	Thermo Fisher Scientific	35050038	L-glutamine
Glutaraldehyde 25%	Sigma-Aldrich	G588.2-50ML
Goat anti-mouse IgG Cy3	Antibodies online	ABIN1673767	polyclonal
Goat anti-mouse IgG DyLight 488	Antibodies online	ABIN1889284	polyclonal
Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 488	Life Technologies	A-11008
HCl	Sigma-Aldrich	30721-1LGL
HepatoZYME-SFM	Thermo Fisher Scientific	17705021	hepatocyte maturation medium
HGF	Thermo Fisher Scientific	PHG0324	human recombinant
HNF4α antibody	Sigma-Aldrich	ZRB1457-25UL	clone 4C19 ZooMAb Rbmono
Hydrocortisone 21-hemisuccinate (sodium salt)	Biomol	Cay18226-100
Knock out Serum Replacement - Multi Species Gibco	Fisher Scientific	A3181501	KSR
KnockOut DMEM/F-12	Thermo Fisher Scientific	12660012	Discontinued. Available under Catalog No. 10-828-010
MACS Buffer	Miltenyi	130-091-221
MACS MultiStand	Miltenyi	130-042-303	magnetic stand
MEM NEAA 100x Gibco	Thermo Fisher Scientific	11140035
Mercaptoethanol	Thermo Fisher Scientific	31350010	50mM
MiniMACS columns	Miltenyi	130-042-201
Nunclon Multidishes	Sigma-Aldrich	D6789	4 well plates
Oncostatin M	Thermo Fisher Scientific	PHC5015	human recombinant
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	158127
PBS sterile	Carl Roth GmbH+Co. KG	9143.2
Penicillin/Streptomycin	Biochrom GmbH	A2213	10000 U/ml
PS 15ml tubes sterile	Greiner Bio-One	188171
Rabbit anti-chicken IgG Texas red	Antibodies online	ABIN637943
Roti Cell Iscoves MDM	Carl Roth GmbH+Co. KG	9033.1
Roti Mount FluorCare DAPI	Carl Roth GmbH+Co. KG	HP20.1
Roti Sep 1077 human	Carl Roth GmbH+Co. KG	0642.2
Transthyretin antibody	Sigma-Aldrich	SAB3500378	produced in chicken
Triton X-100	Thermo Fisher Scientific	HFH10	1%