Sferoidi epatici umani da sangue periferico per studi sulle malattie del fegato

Riepilogo

Qui presentiamo un metodo non genetico per generare sferoidi epatici autologhi umani usando cellule mononucleate isolate dal sangue periferico allo stato stazionario.

Abstract

Le cellule epatiche umane possono formare una struttura tridimensionale (3D) in grado di crescere in coltura per alcune settimane, preservando la loro capacità funzionale. A causa della loro natura di raggrupparsi nei piatti di coltura con caratteristiche adesive basse o assenti, formano aggregati di più cellule epatiche che sono chiamate sferoidi epatici umani. La formazione di sferoidi epatici 3D si basa sulla naturale tendenza delle cellule epatiche ad aggregarsi in assenza di un substrato adesivo. Queste strutture 3D possiedono risposte fisiologiche migliori rispetto alle cellule, che sono più vicine a un ambiente in vivo . L'utilizzo di colture di epatociti 3D presenta numerosi vantaggi rispetto alle classiche colture bidimensionali (2D), tra cui un microambiente biologicamente più rilevante, una morfologia architettonica che riassembla gli organi naturali e una migliore previsione dello stato della malattia e delle risposte simili in vivo ai farmaci. Varie fonti possono essere utilizzate per generare sferoidi, come tessuto epatico primario o linee cellulari immortalizzate. Il tessuto epatico 3D può anche essere ingegnerizzato utilizzando cellule staminali embrionali umane (hESC) o cellule staminali pluripotenti indotte (hiPSC) per derivare gli epatociti. Abbiamo ottenuto sferoidi epatici umani utilizzando cellule staminali pluripotenti derivate dal sangue (BD-PSC) generate da sangue periferico non manipolato mediante attivazione di proteine GPI legate alla membrana umana e differenziate in epatociti umani. Le cellule epatiche umane derivate da BD-PSCs e gli sferoidi epatici umani sono stati analizzati mediante microscopia ottica e immunofenotipizzazione utilizzando marcatori di epatociti umani.

Introduzione

Negli ultimi anni i sistemi di coltura sferoidale tridimensionale (3D) sono diventati uno strumento importante per studiare varie aree della ricerca sul cancro, della scoperta di farmaci e della tossicologia. Tali colture suscitano grande interesse perché colmano il divario tra monostrati di colture cellulari bidimensionali (2D) e organi complessi¹.

In assenza di una superficie adesiva, rispetto alla coltura cellulare 2D, la formazione di sferoidi si basa sulla naturale affinità di queste cellule a raggrupparsi in forma 3D. Queste cellule si organizzano in gruppi costituiti da uno o più tipi di cellule mature. Prive di materiali estranei, queste cellule interagiscono tra loro come nel loro microambiente originale. Le cellule nella coltura 3D sono molto più vicine e hanno un corretto orientamento l'una verso l'altra, con una maggiore produzione di matrice extracellulare rispetto alle colture 2D, e costituiscono un ambiente vicino al naturale ².

I modelli animali sono stati utilizzati per lungo tempo per studiare la biologia umana e le malattie³. A questo proposito, ci sono differenze intrinseche tra esseri umani e animali, il che rende questi modelli non del tutto adatti per studi estrapolativi. Gli sferoidi e gli organoidi di coltura 3D rappresentano uno strumento promettente per studiare l'architettura simile ai tessuti, l'interazione e la diafonia tra diversi tipi di cellule che si verificano in vivo e possono contribuire a ridurre o addirittura sostituire i modelli animali. Sono di particolare interesse per lo studio della patogenesi delle malattie del fegato e delle piattaforme di screening dei farmaci⁴.

La coltura sferoidale 3D è di particolare importanza per la ricerca sul cancro in quanto può eliminare la discontinuità tra le cellule e il loro ambiente riducendo la necessità di tripsinizzazione o trattamento con collagenasi necessario per preparare i monostrati delle cellule tumorali per colture 2D. Gli sferoidi tumorali consentono lo studio di come le cellule normali rispetto a quelle maligne ricevono e rispondono ai segnali provenienti dall'ambiente circostante⁵ e sono una parte importante degli studi di biologia tumorale.

Rispetto al monostrato, le colture 3D costituite da vari tipi di cellule assomigliano ai tessuti tumorali nelle loro proprietà strutturali e funzionali e quindi sono adatte per studiare le metastasi e l'invasione delle cellule tumorali. Ecco perché tali modelli sferoidi stanno contribuendo ad accelerare la ricerca sul cancro⁶.

Gli sferoidi stanno anche aiutando a sviluppare la tecnologia per creare organoidi umani perché la biologia dei tessuti e degli organi è molto difficile da studiare, in particolare negli esseri umani. I progressi nella coltura di cellule staminali consentono di sviluppare colture 3D come organoidi costituiti da cellule staminali e progenitori tissutali, nonché diversi tipi di cellule mature (tissutali) da un organo con alcune caratteristiche funzionali come un organo reale che può essere utilizzato per modellare lo sviluppo di organi, malattie, ma possono anche essere considerati utili nella medicina rigenerativa⁷.

Gli epatociti umani primari sono solitamente utilizzati per studiare la biologia in vitro degli epatociti umani, la funzionalità epatica e la tossicità indotta da farmaci. Le colture di epatociti umani presentano due principali inconvenienti, in primo luogo, la limitata disponibilità di tessuto primario come gli epatociti umani e, in secondo luogo, la tendenza degli epatociti a dedifferenziarsi rapidamente nella coltura 2D, perdendo così la loro funzione specifica degli epatociti⁸. Le colture epatiche 3D sono superiori in questo senso e sono state recentemente prodotte da cellule staminali embrionali umane differenziate (hESC) o cellule staminali pluripotenti indotte (hiPSCs)⁹. Gli sferoidi 3D epatici bioingegnerizzati sono di particolare interesse per lo studio dello sviluppo, della tossicità, delle malattie genetiche e infettive del fegato, nonché nella scoperta di farmaci per il trattamento delle malattie del fegato¹⁰. Infine, hanno anche il potenziale per essere utilizzati clinicamente, sapendo che le malattie epatiche acute hanno un tasso di mortalità di quasi l'80%, il fegato bio-artificiale e / o gli sferoidi epatici potrebbero potenzialmente salvare questi pazienti fornendo una funzionalità epatica parziale fino a quando non si trova un donatore adatto¹¹.

Abbiamo stabilito un protocollo per la generazione di sferoidi epatici umani utilizzando cellule staminali pluripotenti derivate dal sangue (BD-PSCs) per preparare sferoidi di dimensioni diverse contenenti da 4000 a 1 x 10⁶ cellule e analizzarli mediante microscopia ottica e immunofluorescenza. Abbiamo anche testato la capacità della funzione specifica degli epatociti, valutando l'espressione degli enzimi del citocromo P450 3A4 (CYP3A4) e 2E1 (CYP2E1) che appartengono alla famiglia del citocromo P450 che hanno ruoli importanti nel metabolismo cellulare e dei farmaci attraverso il processo di disintossicazione¹².

Protocollo

È stata ottenuta l'approvazione etica (ACA CELL Biotech GmbH/25b-5482.2-64-1) per l'esecuzione di questi esperimenti e il consenso informato è stato firmato da tutti i donatori prima dell'estrazione del sangue in conformità con le linee guida istituzionali.

1. Preparazione di cellule mononucleate (MNC) dal sangue periferico umano (PB)

1. Estrarre 30 ml di sangue da donatori sani con l'aiuto di personale medico addestrato secondo il protocollo standard.
2. Isolare i PBMNC utilizzando mezzi a gradiente di densità secondo il protocollo pubblicato da Becker-Kojić et ^al.13. Isolare mediante pipettaggio lo strato di interfase tra plasma e mezzi a gradiente di densità e utilizzare tampone fosfato sterile soluzione salina (PBS) per lavare le cellule isolate.
3. Utilizzare una camera di conteggio e contare il numero di celle utilizzando metodi standard.

2. Dedifferenziazione delle multinazionali dopo attivazione con glicoproteina umana ancorata al GPI

1. Porre 6 x 10⁶ cellule mononucleate in PBS/1% albumina sierica bovina (BSA) in una provetta di polistirene (15 ml) e incubare con l'anticorpo specifico per 30 minuti a 37 °C secondo Becker-Kojić et ^al.13.
2. Centrifugare le cellule a 300 x g a temperatura ambiente e sostituire PBS/BSA con il mezzo di Dulbecco modificato di Iscove integrato con siero bovino fetale (FBS) al 10%.
3. Far crescere le cellule in tubi di polistirene da 15 ml in un incubatore al 5% di CO₂ a 37 °C per 8-10 giorni come descritto in Becker-Kojić et ^al.13. Il giorno 5 (D5), aggiungere 1-2 ml di terreno di Iscove integrato con FBS al 10% a ciascun tubo da 15 ml.

3. Ordinamento delle cellule dedifferenziate di nuova generazione

1. Centrifugare la sospensione cellulare in coltura a temperatura ambiente per 10 minuti a 300 x g e aspirare con una pipetta sterile il surnatante risultante secondo Becker-Kojić et ^al.13.
2. Risospendere il pellet ottenuto per centrifugazione in 90 μL di tampone PBS freddo (PBS pH 7,2, 0,5% BSA e 2 mM EDTA) e aggiungere 10 μL di sfere magnetiche nanometriche CD45 positive e incubare su ghiaccio per 15 minuti.
3. Lavare la sospensione cellulare con 2 mL di tampone PBS, centrifugarla a 300 x g per 10 minuti a temperatura ambiente e aggiungere 500 μL di tampone PBS alle cellule e risospendere accuratamente.
4. Pipettare 500 μL di tampone PBS pre-raffreddato nella colonna per lavarlo e posizionarlo nel campo magnetico utilizzando un supporto magnetico.
5. Lavare le cellule posizionate sulla colonna, due volte con 500 μL di tampone PBS e raccogliere il flusso attraverso contenente cellule CD45 negative nel mezzo di Iscove integrato con il 10% di FBS.
6. Utilizzare una camera di conteggio per determinare il numero di celle riprogrammate.

4. Preparazione di vetrini per la generazione di epatociti umani

1. Separare i vetrini (14 mm) e incubarli in detergente non ionico per 10 minuti. Lavare i coperchi di vetro in acqua deionizzata fino a quando non rimangono bolle e incubarli in 1M HCl per 30 minuti (adattato da Marchenko et ^al.14).
2. Lavare i vetrini con acqua deionizzata almeno 3 volte e asciugarli per una notte a temperatura ambiente. Vetrini essiccati in autoclave in un contenitore adatto.

5. Rivestimento di piastre di coltura cellulare con biolaminina per la differenziazione epatica 2D di BD-PSCs

1. Posizionare i vetrini in vetro autoclavato con un paio di pinzette sterili in 4 piastre a pozzetto e accendere le luci UV per 30 minuti per garantire condizioni sterili.
2. Scongelare aliquote di biolaminina e aggiungere 120 μL di 5 μg/mL di biolaminina ad ogni vetrino. Lasciare i vetrini rivestiti per una notte a 4 °C.
3. Rimuovere l'eccesso di biolaminina e aggiungere 200 μL di terreno di differenziazione degli epatociti come descritto di seguito.

6. Preparazione dei mezzi di differenziazione degli epatociti

1. Produrre 500 ml di mezzo di sostituzione sierica knockout epatoblasta (KSR)/dimetil solfossido (DMSO) costituito da 76,4% knockout DMEM (KO-DMEM), 20% KSR, 0,5% L-glutammina, 1% aminoacidi non essenziali (NEAA), 0,1% β-mercaptoetanolo, 1% DMSO e 1% penicillina-streptomicina (Pen / Strep).
2. Preparare 500 ml di terreno di maturazione degli epatociti contenente 1% L-glutammina, 10 μM di idrocortisone 21-emisuccinato sale sodico (HCC) e 1% Pen/Strep.
3. Aliquot dal materiale madre e aggiungere il fattore di crescita fresco degli epatociti (HGF) e l'oncostatina M (OSM) alle concentrazioni finali di 10 ng/ml e/o 20 ng/ml per ogni variazione del terreno.
   NOTA: L'oncostatina M è una citochina appartenente al gruppo delle citochine dell'interleuchina 6, importante per l'ematopoiesi e per lo sviluppo del fegato.

7. Coltura di cellule epatiche differenziate da BD-PSCs

1. Inserire 3 x 10⁵ cellule BD-PSCS in ciascun pozzetto di una piastra a 4 pozzetti rivestita di biolaminina.
2. Posizionare le piastre a 4 pozzetti nell'incubatore a 37 °C e 5% di CO₂. Coltura delle cellule per 5 giorni in mezzo di epatoblasto KSR / DMSO che supporta la differenziazione endodermica e cambia il terreno ogni due giorni.
3. Passare al terreno di maturazione degli epatociti il giorno 5 e coltivare le cellule per altri 7-10 giorni nell'incubatore a 37 °C e al 5% di CO₂. Cambia il mezzo ogni 48 ore.

8.3D differenziazione epatica sferoide

1. Contare le celle utilizzando una camera di conteggio.
2. Centrifugare la sospensione cellulare dedifferenziata BD a 300 x g per 10 minuti a temperatura ambiente. Rimuovere le cellule surnatanti e risospendere BD-dedifferenziate in mezzo KSR/DMSO a 2 x 10⁶ cellule/ml.
3. Far passare le cellule attraverso un filtro cellulare da 40 μm per garantire una sospensione a cella singola e rimuovere eventuali detriti aggiuntivi.
4. Contare le celle utilizzando una camera di conteggio e preparare un volume sufficiente per ogni densità di semina cellulare al fine di erogare il volume richiesto per pozzetto. Preparare un gradiente con semina superiore di 1 x 10⁶ celle a una bassa densità di semina di 4000 celle.
5. Erogare 100 μL di terreno KSR/DMSO in 96 piastre di fissaggio ben basse e aggiungere 100 μL di diluizione della semina cellulare.
6. Posizionare la piastra di fissaggio bassa nell'incubatore a 37 °C e al 5% di CO₂ e coltivarla per 5 giorni.
7. Cambiare il 50% del terreno dai giorni 3-4 dopo la semina quando gli sferoidi sono sufficientemente compatti.
8. Il giorno 5, cambiare il terreno di maturazione in mezzo di maturazione degli epatociti e coltivare le cellule per altri 7-10 giorni per un'ulteriore maturazione. Cambia il mezzo ogni due giorni.

9. Analisi di immunofluorescenza di colture di cellule epatiche 2D di nuova generazione

1. Coltivare le cellule secondo il metodo di differenziazione sopra descritto per 4, 8, 15 e 24 giorni e rimuovere i terreni.
2. Incubare le cellule con fissativo preriscaldato costituito da paraformaldeide al 4% in PBS per 10 minuti. Scartare il fissativo e lavare le celle 2x con PBS per 5 minuti ciascuna. Aggiungere immediatamente la soluzione di tritone X-100 allo 0,1% e permeabilizzare le cellule per 5 minuti. Lavare 2x con PBS.
3. Aggiungere la soluzione di blocco a base di PBS e BSA al 5% e posizionare sulla piastra del bilanciere per 1 ora a temperatura ambiente.
4. Diluire gli anticorpi primari nel tampone di diluizione 1% BSA/PBS come segue: albumina (ALB) 1:50, alfa-1 fetoproteina (AFP) 1:250, citocheratina 18 (CK18) 1:50, fattore nucleare degli epatociti 4 alfa (HNF4α) 1:1000 e transtiretina (TTR) 1:50. Utilizzare 50 μL di diluizione anticorpale per pozzetto.
5. Incubare le cellule per 1 ora a temperatura ambiente. Quindi scartare la soluzione anticorpale, lavare le cellule per 5 minuti e ripetere il passaggio di lavaggio 3x.
6. Preparare i seguenti anticorpi secondari nel tampone di diluizione: coniglio anti-pollo IgG (Texas rosso) 1:1000, capra anti-topo IgG (488) 1:1000 e capra anti-coniglio (488) 1:500. Utilizzare 50 μL di diluizione anticorpale per pozzetto e incubare le cellule per 30 minuti a temperatura ambiente.
7. Lavare le celle 3 volte con PBS per 5 minuti ciascuna e montare i vetrini con supporti di montaggio contenenti DAPI per l'analisi microscopica.

10. Colorazione viva di sferoidi epatici di nuova formazione

1. Scartare con attenzione i terreni di coltura senza toccare gli sferoidi, aggiungere PBS appena fatto con soluzione di tritone X-100 allo 0,1% e incubare per 5 minuti per permeabilizzare le cellule.
2. Lavare gli sferoidi con il mezzo pipettando lentamente per 5 minuti, ripetere 2x.
3. Incubare gli sferoidi con gli anticorpi primari ALB (1:50), AFP (1:250), CK18 (1:50), CYP2E1 (1:200) e CYP3A4 (1:200) preparati in PBS con 1% BSA per 1 ora in incubatore al 5% di CO₂ a 37 °C. Utilizzare 50 μL di diluizione anticorpale per pozzetto.
4. Rimuovere con cura la soluzione anticorpale in eccesso e lavare gli sferoidi con mezzo 3x.
5. Preparare i corrispondenti anticorpi secondari IgG anti-topo di capra (Cy3), IgG anti-topo di capra (488) e IgG anti-pollo di coniglio (rosso Texas) ad una diluizione di 1:1000 e 1:500 per capra anti-coniglio (488) in PBS in BSA all'1%. Utilizzare 50 μL di diluizione anticorpale per pozzetto e incubare per 20 minuti nell'incubatore a 37 °C e 5% di CO₂.
6. Lavare accuratamente 3 volte con terreno e lasciare la piastra per 30 minuti nell'incubatore a 37 °C e 5% CO₂ prima di eseguire la microscopia a fluorescenza.

11. Esame degli sferoidi mediante microscopio a fluorescenza

1. Accendere la sorgente luminosa a fluorescenza 10 minuti prima dell'uso, accendere il computer e aprire il software di imaging.
2. Utilizzare un obiettivo con ingrandimento 4x, fare clic sul pulsante 4x nella barra degli strumenti per selezionare la barra della scala corretta, quindi posizionare la piastra a 96 pozzetti sulla piastra centrale del palco.
3. Accendere la sorgente luminosa a LED, utilizzare il filtro a campo luminoso e posizionare la piastra sul pozzetto di interesse utilizzando la manopola di regolazione dello stadio dell'asse x-y.
4. Passare al percorso della luce della fotocamera, fare clic sul pulsante Live nel software di imaging per visualizzare l'immagine sullo schermo e assicurarsi che lo sferoide sia centrato utilizzando le manopole dell'asse x-y e la messa a fuoco utilizzando la manopola di messa a fuoco grossolana/fine.
   NOTA: La forma degli sferoidi rimane costante dopo l'applicazione della colorazione viva.
5. Scegli il metodo di osservazione Brightfield nella barra degli strumenti, imposta le impostazioni di esposizione su automatico e fai clic sul pulsante Istantanea nel pannello di controllo della fotocamera per scattare una foto. Quindi salvare l'immagine come file .vsi utilizzando il nome appropriato nella cartella di interesse.
6. Posizionare la piastra di schermatura della luce ambientale per spegnere la luce LED, passare al filtro per l'eccitazione B, scegliere il metodo di osservazione 488 nella barra degli strumenti, aprire l'otturatore, scattare una foto facendo clic sul pulsante Istantanea, chiudere l'otturatore, quindi salvare il file come descritto sopra.
7. Ripetere questa operazione con un filtro per l'eccitazione G utilizzando il metodo di osservazione appropriato (rosso Texas o CY3). Quindi ripetere l'intera procedura per ogni pozzo di interesse.
8. Riportare la piastra nell'incubatore al 5% di CO₂ a 37 °C e coltivarla come descritto sopra.

Risultati

Abbiamo differenziato con successo le BD-PSC umane in cellule progenitrici endodermiche/epatiche ed epatociti applicando un protocollo in due fasi. I cambiamenti morfologici durante il processo di differenziazione epatica sono mostrati nella Figura 1. Le BD-PSC si differenziano in epatociti che attraversano tre diverse fasi. Il primo stadio rappresenta la differenziazione in cellule endodermiche L4, il secondo, la differenziazione in cellule progenitrici epatiche (epatoblasto) L8, che mostra...

Discussione

Il fegato è un organo importante nel corpo umano con molte funzioni biologiche essenziali, come la disintossicazione dei metaboliti. A causa di gravi insufficienza epatica come la cirrosi e / o l'epatite virale, ci sono quasi 2 milioni di morti all'anno in tutto il mondo. I trapianti di fegato sono al secondo posto nei trapianti di organi solidi in tutto il mondo, ma solo circa il 10% del fabbisogno attuale è soddisfatto²².

Gli epatociti umani primari (PHH) sono spess...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Albumin antibody	Sigma-Aldrich	SAB3500217	produced in chicken
Albumin Fraction V	Carl Roth GmbH+Co. KG	T8444.4
Alpha-1 Fetoprotein	Proteintech Germany GmbH	14550-1-AP	rabbit polyclonal IgG
Biolaminin 111 LN	BioLamina	LN111-02	human recombinant
CD45 MicroBeads	Miltenyi	130-045-801	nano-sized magnetic beads
Cell Strainer	pluriSelect	43-10040-40
CellSens	Olympus		imaging software
Centrifuge tubes 50 mL	Greiner Bio-One	210270
CEROplate 96 well	OLS OMNI Life Science	2800-109-96
CKX53	Olympus
Commercially available detergent	Procter & Gamble		nonionic detergent
CYP2E1-specific antibody	Proteintech Germany GmbH	19937-1-AP	rabbit polyclonal antibody IgG
CYP3A4	Proteintech Germany GmbH	67110-1-lg	mouse monoclonal antibody IgG1
Cytokeratin 18	DakoCytomation	M7010	mouse monoclonal antibody IgG1
DMSO	Sigma-Aldrich	D8418-50ML
DPBS	Thermo Fisher Scientific	14040091
FBS	Merck Millipore	S0115/1030B	Discontinued. Available under: TMS-013-B
Glass cover slips 14 mm	R. Langenbrinck	01-0014/1
GlutaMax 100x Gibco	Thermo Fisher Scientific	35050038	L-glutamine
Glutaraldehyde 25%	Sigma-Aldrich	G588.2-50ML
Goat anti-mouse IgG Cy3	Antibodies online	ABIN1673767	polyclonal
Goat anti-mouse IgG DyLight 488	Antibodies online	ABIN1889284	polyclonal
Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 488	Life Technologies	A-11008
HCl	Sigma-Aldrich	30721-1LGL
HepatoZYME-SFM	Thermo Fisher Scientific	17705021	hepatocyte maturation medium
HGF	Thermo Fisher Scientific	PHG0324	human recombinant
HNF4α antibody	Sigma-Aldrich	ZRB1457-25UL	clone 4C19 ZooMAb Rbmono
Hydrocortisone 21-hemisuccinate (sodium salt)	Biomol	Cay18226-100
Knock out Serum Replacement - Multi Species Gibco	Fisher Scientific	A3181501	KSR
KnockOut DMEM/F-12	Thermo Fisher Scientific	12660012	Discontinued. Available under Catalog No. 10-828-010
MACS Buffer	Miltenyi	130-091-221
MACS MultiStand	Miltenyi	130-042-303	magnetic stand
MEM NEAA 100x Gibco	Thermo Fisher Scientific	11140035
Mercaptoethanol	Thermo Fisher Scientific	31350010	50mM
MiniMACS columns	Miltenyi	130-042-201
Nunclon Multidishes	Sigma-Aldrich	D6789	4 well plates
Oncostatin M	Thermo Fisher Scientific	PHC5015	human recombinant
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	158127
PBS sterile	Carl Roth GmbH+Co. KG	9143.2
Penicillin/Streptomycin	Biochrom GmbH	A2213	10000 U/ml
PS 15ml tubes sterile	Greiner Bio-One	188171
Rabbit anti-chicken IgG Texas red	Antibodies online	ABIN637943
Roti Cell Iscoves MDM	Carl Roth GmbH+Co. KG	9033.1
Roti Mount FluorCare DAPI	Carl Roth GmbH+Co. KG	HP20.1
Roti Sep 1077 human	Carl Roth GmbH+Co. KG	0642.2
Transthyretin antibody	Sigma-Aldrich	SAB3500378	produced in chicken
Triton X-100	Thermo Fisher Scientific	HFH10	1%