Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

כאן אנו מציגים שיטה לא גנטית ליצירת ספרואידים אוטולוגיים אנושיים בכבד באמצעות תאים חד-גרעיניים שבודדו מדם היקפי במצב יציב.

Abstract

תאי כבד אנושיים יכולים ליצור מבנה תלת ממדי (3D) המסוגל לגדול בתרבית במשך כמה שבועות, תוך שמירה על יכולתם התפקודית. בשל טבעם להתקבץ בתרבית צלחות בעלות תכונות דבק נמוכות או ללא תכונות דבק, הם יוצרים צברים של תאי כבד מרובים הנקראים ספרואידים של כבד אנושי. היווצרותם של ספרואידים תלת-ממדיים בכבד מסתמכת על הנטייה הטבעית של תאי הכבד להצטבר בהיעדר מצע דביק. למבנים תלת-ממדיים אלה יש תגובות פיזיולוגיות טובות יותר מאשר לתאים, הקרובים יותר לסביבה in vivo . לשימוש בתרביות הפטוציטים תלת-ממדיות יש יתרונות רבים בהשוואה לתרביות דו-ממדיות (2D) קלאסיות, כולל מיקרו-סביבה רלוונטית יותר מבחינה ביולוגית, מורפולוגיה אדריכלית המרכיבה מחדש איברים טבעיים, כמו גם חיזוי טוב יותר לגבי מצב המחלה ותגובות דמויות in vivo לתרופות. מקורות שונים יכולים לשמש ליצירת ספרואידים, כמו רקמת כבד ראשונית או קווי תאים אימורטליים. ניתן להנדס את רקמת הכבד התלת-ממדית גם באמצעות תאי גזע עובריים אנושיים (hESCs) או תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (hiPSCs) כדי להפיק הפטוציטים. השגנו ספרואידים אנושיים בכבד באמצעות תאי גזע פלוריפוטנטיים שמקורם בדם (BD-PSCs) המופקים מדם היקפי ללא מניפולציה על ידי הפעלת חלבון הקשור לקרום אנושי הקשור ל- GPI ומובחן להפטוציטים אנושיים. תאי כבד אנושיים שמקורם ב-BD-PSCs וספרואידים של כבד אנושי נותחו במיקרוסקופ אור ואימונופנוטיפ באמצעות סמני כבד אנושיים.

Introduction

בשנים האחרונות מערכות תרבית ספרואידים תלת-ממדיות (3D) הפכו לכלי חשוב לחקר תחומים שונים של חקר סרטן, גילוי תרופות וטוקסיקולוגיה. תרביות כאלה מעוררות עניין רב משום שהן מגשרות על הפער בין חד-שכבות דו-ממדיות (2D) של תרביות תאים לבין איברים מורכבים1.

בהיעדר משטח דביק, בהשוואה לתרבית תאים דו-ממדית, היווצרות הספרואידים מבוססת על הזיקה הטבעית של תאים אלה להתקבץ בצורה תלת-ממדית. תאים אלה מתארגנים לקבוצות המורכבות מסוג אחד או יותר של תאים בוגרים. ללא חומרים זרים, תאים אלה מתקשרים זה עם זה כמו במיקרו-סביבה המקורית שלהם. התאים בתרבית תלת-ממדית קרובים הרבה יותר ובעלי אוריינטציה נכונה זה כלפי זה, עם ייצור מטריצה חוץ-תאית גבוה יותר מאשר תרביות דו-ממדיות, ומהווים סביבה טבעית קרובה 2.

מודלים של בעלי חיים שימשו במשך זמן רב לחקר ביולוגיה אנושית ומחלות3. בהקשר זה, ישנם הבדלים מהותיים בין בני אדם לבעלי חיים, מה שהופך מודלים אלה לא לגמרי מתאים למחקרים אקסטרפולטיביים. ספרואידים ואורגנואידים בתרבית תלת-ממדית מהווים כלי מבטיח לחקר ארכיטקטורה דמוית רקמה, אינטראקציה והצלבה בין סוגי תאים שונים המתרחשים in vivo ויכולים לתרום להפחתה או אפילו להחלפה של מודלים של בעלי חיים. הם מעניינים במיוחד לחקר הפתוגנזה של מחלות כבד, כמו גם פלטפורמות סינון תרופות4.

תרבית ספרואידים תלת-ממדית היא בעלת חשיבות מיוחדת לחקר הסרטן מכיוון שהיא יכולה לחסל את חוסר הרציפות בין התאים לסביבתם על ידי הפחתת הצורך בטריפסיניזציה או בטיפול בקולגנאז הדרוש להכנת חד-שכבות תאי הגידול לתרביות דו-ממדיות. ספרואידים סרטניים מאפשרים לחקור כיצד תאים נורמליים לעומת תאים ממאירים מקבלים ומגיבים לאותות מסביבתם5 והם חלק חשוב בלימודי ביולוגיה של גידולים.

בהשוואה לחד-שכבתיות, תרביות תלת-ממדיות המורכבות מסוגי תאים שונים דומות לרקמות הגידול בתכונותיהן המבניות והתפקודיות ולכן מתאימות לחקר גרורות ופלישה של תאי גידול. זו הסיבה שמודלים ספרואידים כאלה תורמים להאצת חקר הסרטן6.

ספרואידים גם עוזרים לפתח את הטכנולוגיה ליצירת אורגנואידים אנושיים מכיוון שביולוגיה של רקמות ואיברים מאתגרת מאוד למחקר, במיוחד בבני אדם. התקדמות בתרבית תאי גזע מאפשרת לפתח תרביות תלת ממדיות כמו אורגנואידים המורכבים מתאי גזע ואבות רקמות, כמו גם סוגים שונים של תאים בוגרים (רקמות) מאיבר עם כמה מאפיינים פונקציונליים כמו איבר אמיתי שניתן להשתמש בו כדי למדל התפתחות איברים, מחלות, אבל הם גם יכולים להיחשב שימושיים ברפואה רגנרטיבית7.

הפטוציטים אנושיים ראשוניים משמשים בדרך כלל לחקר ביולוגיה חוץ גופית של הפטוציטים אנושיים, תפקוד כבד ורעילות הנגרמת על ידי תרופות. לתרביות של הפטוציטים אנושיים יש שני חסרונות עיקריים, ראשית, הזמינות המוגבלת של רקמה ראשונית כמו הפטוציטים אנושיים, ושנית, הנטייה של הפטוציטים להתמיין במהירות בתרבית דו-ממדית ובכך לאבד את פונקציית הפטוציטים הספציפית שלהם8. תרביות כבד תלת-ממדיות הן טובות יותר בהקשר זה, ולאחרונה נוצרו מתאי גזע עובריים אנושיים ממוינים (hESCs) או מתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (hiPSCs)9. ספרואידים תלת-ממדיים מהונדסים ביולוגית בכבד מעניינים במיוחד בחקר התפתחות, רעילות, מחלות גנטיות וזיהומיות של הכבד, כמו גם בגילוי תרופות לטיפול במחלות כבד10. לבסוף, יש להם גם פוטנציאל לשימוש קליני, בידיעה שלמחלות כבד חריפות יש שיעור תמותה של כמעט 80%, כבד ביו-מלאכותי ו / או ספרואידים בכבד יכולים להציל חולים אלה על ידי מתן תפקוד כבד חלקי עד שניתן למצוא תורם מתאים11.

קבענו פרוטוקול ליצירת ספרואידים אנושיים בכבד באמצעות תאי גזע פלוריפוטנטיים שמקורם בדם (BD-PSCs) להכנת ספרואידים בגדלים שונים המכילים 4000 עד 1 x 106 תאים וניתחנו אותם באמצעות מיקרוסקופ אור ואימונופלואורסנציה. בדקנו גם את היכולת של תפקוד ספציפי לכבד, והערכנו את הביטוי של אנזימי ציטוכרום P450 3A4 (CYP3A4) ו-2E1 (CYP2E1) השייכים למשפחת הציטוכרום P450 שיש להם תפקידים חשובים במטבוליזם של תאים ותרופות באמצעות תהליך של ניקוי רעלים12.

Protocol

התקבל אישור אתי (ACA CELL Biotech GmbH/25b-5482.2-64-1) לביצוע ניסויים אלה והסכמה מדעת נחתמה על ידי כל התורמים לפני שאיבת הדם בהתאם להנחיות המוסדיות.

1. הכנת תאים חד-גרעיניים (MNCs) מדם היקפי אנושי (PB)

  1. לחלץ 30 מ"ל דם מתורמים בריאים בעזרת צוות רפואי מיומן על פי הפרוטוקול הסטנדרטי.
  2. בודד PBMNCs באמצעות מדיה שיפוע צפיפות על פי הפרוטוקול שפורסם על ידי Becker-Kojić et al.13. בודדו, על ידי פיפטינג, את שכבת הביניים בין פלזמה ומדיה הדרגתית צפיפות והשתמשו במי מלח חיץ פוספט סטריליים (PBS) כדי לשטוף את התאים המבודדים.
  3. השתמש בתא ספירה וספור את מספר התאים בשיטות סטנדרטיות.

2. דיפרנציאציה של MNCs עם הפעלה עם גליקופרוטאין מעוגן GPI אנושי

  1. מניחים 6 x 106 תאים חד-גרעיניים באלבומין בסרום PBS / 1% בקר (BSA) בצינור פוליסטירן (15 מ"ל) ודגורים עם הנוגדן הספציפי למשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס על פי Becker-Kojić et al.13.
  2. צנטריפוגו את התאים ב 300 x גרם בטמפרטורת החדר ולהחליף PBS / BSA עם מדיום Dulbecco של Iscove בתוספת 10% סרום בקר עוברי (FBS).
  3. לגדל את התאים בצינורות פוליסטירן 15 מ"ל באינקובטור 5% CO2 ב 37 ° C במשך 8-10 ימים כמתואר Becker-Kojić et al.13. ביום 5 (D5), הוסף 1-2 מ"ל של מדיום Iscove בתוספת 10% FBS לכל צינור 15 מ"ל.

3. מיון של תאים חדשים שנוצרו dedifferentiated

  1. תרחיף תאים בתרבית צנטריפוגה בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות ב 300 x גרם ושואף עם פיפטה סטרילית את supernatant שנוצר על פי Becker-Kojić et al.13.
  2. גלולת השהיה המתקבלת על ידי צנטריפוגה ב-90 מיקרוליטר של חיץ PBS קר (PBS pH 7.2, 0.5% BSA ו-2 mM EDTA) ומוסיפים 10 μL של CD45 חרוזים מגנטיים חיוביים בגודל ננומטרי ודגרים על קרח למשך 15 דקות.
  3. שטפו את מתלה התא עם 2 מ"ל של חיץ PBS, צנטריפוגו אותו ב 300 x גרם במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר והוסיפו 500 μL של חיץ PBS לתאים והשהו מחדש ביסודיות.
  4. פיפטה 500 μL של חיץ PBS מקורר מראש לתוך העמוד כדי לשטוף ולמקם אותו בשדה המגנטי באמצעות מעמד מגנטי.
  5. שטפו את התאים שהונחו על העמודה, פעמיים עם 500 μL של חיץ PBS ואספו זרימה המכילה תאים שליליים CD45 בתווך של Iscove בתוספת 10% FBS.
  6. השתמש בתא ספירה כדי לקבוע את מספר התאים שתוכנתו מחדש.

4. הכנת כיסויי זכוכית לדור הפטוציטים האנושיים

  1. יש להפריד את כיסויי הזכוכית (14 מ"מ) ולדגור עליהם בחומר ניקוי לא יוני למשך 10 דקות. שטפו את כיסויי הזכוכית במים נטולי יונים, עד שלא יישארו בועות, ודגרו עליהם ב-1M HCl למשך 30 דקות (מעובד מ-Marchenko et al.14).
  2. יש לשטוף את כיסויי הזכוכית במים נטולי יונים, לפחות 3 פעמים ולייבש אותם למשך הלילה בטמפרטורת החדר. זכוכית מיובשת Autoclave מכסה במיכל מתאים.

5. ציפוי לוחות תרבית תאים עם biolaminin עבור התמיינות כבד 2D של BD-PSCs

  1. הניחו את כיסויי הזכוכית האוטומטיים עם זוג פינצטות סטריליות ב-4 צלחות באר והדליקו את אורות ה-UV למשך 30 דקות כדי להבטיח תנאים סטריליים.
  2. הפשירו אליציטוטים של ביולמינין והוסיפו 120 μL של 5 מיקרוגרם / מ"ל ביולמינין לכל החלקת כיסוי זכוכית. השאירו את כיסויי הזכוכית המצופים למשך הלילה בטמפרטורה של 4°C.
  3. הסר את עודף של biolaminin ולהוסיף 200 μL של מדיום התמיינות hepatocyte כמתואר להלן.

6. הכנת מדיה הבחנה hepatocyte

  1. ייצור 500 מ"ל של תחליפי סרום נוקאאוט הפטובלסטים (KSR)/דימתיל סולפוקסיד (DMSO) בינוני המורכב מ-76.4% נוקאאוט DMEM (KO-DMEM), 20% KSR, 0.5% L-גלוטמין, 1% חומצות אמינו לא חיוניות (NEAA), 0.1% β-מרקפטואתנול, 1% DMSO ו-1% פניצילין-סטרפטומיצין (Pen/Strep).
  2. הכינו 500 מ"ל של מדיום הבשלת הפטוציטים המכיל 1% L-גלוטמין, 10 מיקרומטר הידרוקורטיזון 21-המיסוקצינאט נתרן מלח (HCC) ו-1% עט/סטרפ.
  3. Aliquot בינוני מהמלאי ולהוסיף גורם גדילה הפטוציטים טרי (HGF) ו oncostatin M (OSM) בריכוזים סופיים של 10 ng / mL ו / או 20 ng / mL עבור כל שינוי בינוני.
    הערה: Oncostatin M הוא ציטוקין השייך לקבוצת הציטוקינים interleukin 6, חשוב להמטופויזיס כמו גם להתפתחות הכבד.

7. גידול תאי כבד ממוינים מ- BD-PSCs

  1. שים 3 x 105 תאי BD-PSCS לתוך כל באר של צלחת 4 באר מצופה biolaminin.
  2. מניחים את לוחות 4 בארות באינקובטור ב 37 ° C ו 5% CO2. תרבית את התאים במשך 5 ימים בתווך הפטובלסטים KSR/DMSO התומך בהתמיינות אנדודרמלית ושנה את המדיום כל יומיים.
  3. עברו למדיום הבשלת הפטוציטים ביום 5 ותרבו את התאים למשך 7-10 ימים נוספים באינקובטור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2. שנה את המדיום כל 48 שעות.

8.3D התמיינות כבדית ספרואידית

  1. ספירת תאים באמצעות תא ספירה.
  2. צנטריפוגה BD-dedifferentiated תא השעיה ב 300 x גרם במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. הסר supernatant והשהה מחדש תאים ללא התמיינות BD בתווך KSR/DMSO ב- 2 x 106 תאים/מ"ל.
  3. העבירו את התאים דרך מסננת תאים של 40 מיקרומטר כדי להבטיח תרחיף חד-תאי ולהסיר פסולת נוספת.
  4. ספרו תאים באמצעות תא ספירה והכינו נפח מספיק לכל צפיפות זריעה של תא על מנת לחלק את הנפח הנדרש לכל באר. הכינו שיפוע עם זריעה עליונה של 1 x 106 תאים לצפיפות זריעה נמוכה של 4000 תאים.
  5. יש להוציא 100 μL של KSR/DMSO בינוני ב-96 לוחות חיבור נמוכים היטב ולהוסיף 100 μL של דילול זריעת תאים.
  6. מניחים צלחת חיבור נמוכה באינקובטור ב 37 ° C ו 5% CO2 ו תרבית אותם במשך 5 ימים.
  7. שנה 50% מהתווך מימים 3-4 לאחר הזריעה כאשר הספרואידים קומפקטיים מספיק.
  8. ביום 5, לשנות את המדיום כדי hepatocyte התבגרות המדיום ואת תרבית התאים במשך 7-10 ימים נוספים להבשלה נוספת. החליפו את המדיום כל יומיים.

9. ניתוח אימונופלואורסנציה של תרביות תאי כבד דו-ממדיות שנוצרו לאחרונה

  1. תרבית את התאים בשיטת ההתמיינות שתוארה לעיל במשך 4, 8, 15 ו-24 ימים ותוציא מדיה.
  2. לדגור על תאים עם קיבוע שחומם מראש המורכב מ-4% פרפורמלדהיד ב-PBS למשך 10 דקות. השליכו את הקיבוע ושטפו את התאים 2x עם PBS למשך 5 דקות כל אחד. הוסף מיד תמיסת טריטון X-100 0.1% וחדיר את התאים למשך 5 דקות. יש לשטוף פעמיים עם PBS.
  3. הוסף תמיסת חסימה העשויה PBS ו- 5% BSA והנח על צלחת נדנדה למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר.
  4. דילול נוגדנים ראשוניים במאגר דילול 1% BSA/PBS כדלקמן: אלבומין (ALB) 1:50, חלבון עוברי אלפא-1 (AFP) 1:250, ציטוקרטין 18 (CK18) 1:50, פקטור גרעיני הפטוציטים 4 אלפא (HNF4α) 1:1000 וטרנסתירטין (TTR) 1:50. השתמש 50 μL של דילול נוגדנים לכל באר.
  5. לדגור על התאים במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר. לאחר מכן השליכו את תמיסת הנוגדנים, שטפו את התאים במשך 5 דקות וחזרו על שלב השטיפה 3x.
  6. הכינו את הנוגדנים המשניים הבאים במאגר דילול: ארנב נגד עוף IgG (אדום טקסס) 1:1000, עיזים נגד עכבר IgG (488) 1:1000, ועז נגד ארנב (488) 1:500. השתמש 50 μL של דילול נוגדנים לכל באר לדגור את התאים במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
  7. שטפו את התאים 3x עם PBS במשך 5 דקות כל אחד והרכיבו את הכיסויים עם מדיית הרכבה המכילה DAPI לניתוח מיקרוסקופי.

10. צביעה חיה של ספרואידים חדשים שנוצרו בכבד

  1. יש להשליך בזהירות את אמצעי התרבית מבלי לגעת בכדורים, להוסיף PBS טרי עם תמיסת 0.1% טריטון X-100, ולדגור במשך 5 דקות כדי לחדור לתאים.
  2. שטפו את הספרואידים עם המדיום על ידי פיפטינג איטי במשך 5 דקות, חזרו על הפעולה 2x.
  3. לדגור על הספרואידים עם הנוגדנים העיקריים ALB (1:50), AFP (1:250), CK18 (1:50), CYP2E1 (1:200) ו-CYP3A4 (1:200) שהוכנו ב-PBS עם 1% BSA למשך שעה אחת באינקובטור CO2 של 5% ב-37°C. השתמש 50 μL של דילול נוגדנים לכל באר.
  4. בזהירות להסיר את תמיסת נוגדנים עודף לשטוף את spheroids עם בינוני 3x.
  5. הכינו את הנוגדנים המשניים המתאימים IgG נגד עכבר (Cy3), IgG נגד עכבר עיזים (488), וארנב נגד עוף IgG (אדום טקסס) בדילול של 1:1000 ו-1:500 נגד ארנב עיזים (488) ב-PBS ב-1% BSA. השתמש 50 μL של דילול נוגדנים לכל באר לדגור במשך 20 דקות באינקובטור ב 37 ° C ו 5% CO2.
  6. בזהירות לשטוף 3x עם בינוני ולהשאיר את הצלחת במשך 30 דקות באינקובטור ב 37 ° C ו 5% CO2 לפני ביצוע מיקרוסקופ פלואורסצנטי.

11. בדיקת ספרואידים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי

  1. הפעל את מקור האור הפלואורסצנטי 10 דקות לפני השימוש, הפעל את המחשב ופתח את תוכנת ההדמיה.
  2. השתמש במטרה עם הגדלה 4x, לחץ על כפתור 4x בסרגל הכלים כדי לבחור את סרגל קנה המידה הנכון, ולאחר מכן הנח את צלחת 96 באר על הצלחת במרכז הבמה.
  3. הפעל את מקור תאורת ה- LED, השתמש במסנן brightfield ומקם את הצלחת לבאר המעניינת באמצעות ידית הכוונון של שלב ציר x-y.
  4. שנה לנתיב תאורת המצלמה, לחץ על הלחצן Live in תוכנת הדמיה כדי להמחיש את התמונה על המסך, ולוודא שהספרואיד ממורכז באמצעות ידיות ציר ה-x ולהתמקד באמצעות ידית המיקוד הגס/עדין.
    הערה: צורת הספרואידים נשארת קבועה לאחר מריחת כתמים חיים.
  5. בחרו בשיטת Brightfield Observation בסרגל הכלים, העבירו את הגדרות החשיפה למצב אוטומטי ולחצו על הלחצן Snapshot בלוח הבקרה של המצלמה כדי לצלם תמונה. לאחר מכן שמור את התמונה כקובץ .vsi באמצעות השם המתאים בתיקיה המעניינת.
  6. הנח את לוח סיכוך תאורת הסביבה כדי לכבות את אור ה- LED, שנה למסנן עבור עירור B, בחר שיטת תצפית 488 בסרגל הכלים, פתח תריס, צלם תמונה על ידי לחיצה על לחצן תצלום בזק, סגור תריס ולאחר מכן שמור קובץ כמתואר לעיל.
  7. חזור על כך עם מסנן לעירור G באמצעות שיטת התצפית המתאימה (אדום טקסס או CY3). לאחר מכן חזור על כל ההליך עבור כל באר של עניין.
  8. להחזיר את הצלחת לאינקובטור 5% CO2 ב 37 ° C ולתרבת אותו כמתואר לעיל.

תוצאות

הבחנו בהצלחה BD-PSCs אנושיים לתאי אב אנדודרם / כבד והפטוציטים על ידי יישום פרוטוקול דו-שלבי. שינויים מורפולוגיים במהלך תהליך התמיינות הכבד מוצגים באיור 1. BD-PSCs מתמיינים להפטוציטים שעוברים שלושה שלבים שונים. השלב הראשון מייצג את ההתמיינות לתאים אנדודרמליים L4, השני, התמיינות לת?...

Discussion

הכבד הוא איבר מרכזי בגוף האדם עם פונקציות ביולוגיות חיוניות רבות, כגון ניקוי רעלים של מטבוליטים. בשל אי ספיקת כבד חמורה כמו שחמת הכבד ו / או דלקת כבד ויראלית, ישנם כמעט 2 מיליון מקרי מוות בשנה ברחבי העולם. השתלות כבד מדורגות במקום השני בהשתלות איברים מוצקים ברחבי העולם, אך רק כ-10% מהצורך הנוכח...

Disclosures

המחברת המקבילה מצהירה כי היא בעלת פטנט הקשור לחלבון מקושר GPI אנושי חדש. היא ייסדה ועובדת עם ACA CELL Biotech GmbH. המחברים האחרים מצהירים שאין ניגודי עניינים.

Acknowledgements

המחברים אסירי תודה במיוחד על הסיוע הטכני שניתן על ידי אוקסנה וג'ון גרינאקר. עבודה זו נתמכה על ידי ACA CELL Biotech GmbH היידלברג, גרמניה.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Albumin antibodySigma-AldrichSAB3500217produced in chicken
Albumin Fraction VCarl Roth GmbH+Co. KGT8444.4
Alpha-1 FetoproteinProteintech Germany GmbH14550-1-APrabbit polyclonal IgG
Biolaminin 111 LNBioLamina LN111-02human recombinant
CD45 MicroBeadsMiltenyi130-045-801nano-sized magnetic beads
Cell StrainerpluriSelect43-10040-40
CellSens Olympusimaging software
Centrifuge tubes 50 mL Greiner Bio-One210270
CEROplate 96 wellOLS OMNI Life Science2800-109-96
CKX53 Olympus
Commercially available detergentProcter & Gamblenonionic detergent
CYP2E1-specific antibodyProteintech Germany GmbH19937-1-APrabbit polyclonal antibody IgG
CYP3A4 Proteintech Germany GmbH67110-1-lgmouse monoclonal antibody IgG1
Cytokeratin 18DakoCytomationM7010mouse monoclonal antibody IgG1
DMSOSigma-AldrichD8418-50ML
DPBSThermo Fisher Scientific14040091
FBSMerck MilliporeS0115/1030BDiscontinued. Available under: TMS-013-B
Glass cover slips 14 mmR. Langenbrinck01-0014/1
GlutaMax 100x GibcoThermo Fisher Scientific35050038L-glutamine
Glutaraldehyde 25%Sigma-AldrichG588.2-50ML
Goat anti-mouse IgG Cy3Antibodies onlineABIN1673767polyclonal
Goat anti-mouse IgG DyLight 488Antibodies onlineABIN1889284polyclonal
Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 488Life TechnologiesA-11008
HClSigma-Aldrich30721-1LGL
HepatoZYME-SFM Thermo Fisher Scientific17705021hepatocyte maturation medium
HGFThermo Fisher ScientificPHG0324human recombinant
HNF4α antibodySigma-AldrichZRB1457-25ULclone 4C19 ZooMAb Rbmono
Hydrocortisone 21-hemisuccinate (sodium salt)BiomolCay18226-100
Knock out Serum Replacement - Multi Species GibcoFisher ScientificA3181501KSR
KnockOut DMEM/F-12Thermo Fisher Scientific12660012Discontinued. Available under Catalog No. 10-828-010
MACS BufferMiltenyi130-091-221
MACS MultiStandMiltenyi130-042-303magnetic stand
MEM NEAA 100x GibcoThermo Fisher Scientific11140035
MercaptoethanolThermo Fisher Scientific3135001050mM
MiniMACS columnsMiltenyi130-042-201
Nunclon MultidishesSigma-AldrichD67894 well plates
Oncostatin MThermo Fisher ScientificPHC5015human recombinant
ParaformaldehydeSigma-Aldrich158127
PBS sterileCarl Roth GmbH+Co. KG9143.2
Penicillin/StreptomycinBiochrom GmbHA221310000 U/ml
PS 15ml tubes sterileGreiner Bio-One188171
Rabbit anti-chicken IgG Texas redAntibodies onlineABIN637943
Roti Cell Iscoves MDMCarl Roth GmbH+Co. KG9033.1
Roti Mount FluorCare DAPICarl Roth GmbH+Co. KGHP20.1
Roti Sep 1077 humanCarl Roth GmbH+Co. KG0642.2
Transthyretin antibody Sigma-AldrichSAB3500378produced in chicken
Triton X-100Thermo Fisher ScientificHFH101%

References

  1. Fennema, E., Rivron, N., Rouwkema, J., van Blitterswijk, C., de Boer, J. Spheroid culture as a tool for creating 3D complex tissues. Trends in Biotechnology. 31 (2), 108-115 (2013).
  2. Ryu, N. E., Lee, S. H., Park, H. Spheroid culture system methods and applications for mesenchymal stem cells. Cells. 8 (12), 1620 (2019).
  3. Nevzorova, Y. A., Boyer-Diaz, Z., Cubero, F. J., Gracia-Sancho, J. Animal models for liver disease - A practical approach for translational research. Journal of Hepatology. 73 (2), 423-440 (2020).
  4. Ingelman-Sundberg, M., Lauschke, V. M. 3D human liver spheroids for translational pharmacology and toxicology. Basic and Clinical Pharmacology and Toxicology. 130, 5-15 (2022).
  5. Nelson, C. M., Bissell, M. J. Of extracellular matrix, scaffolds, and signalling: tissue architecture regulates development, homeostasis, and cancer. Annual review of cell and developmental biology. 22, 287-309 (2006).
  6. Khanna, S., Chauhan, A., Bhatt, A. N., Dwarakanath, B. S. R. Multicellular tumor spheroids as in vitro models for studying tumor responses to anticancer therapies. Animal Biotechnology (Second Edition). , 251-268 (2020).
  7. Rossi, G., Manfrin, A., Lutolf, M. P. Progress and potential in organoid research. Nature Reviews Genetics. 19 (11), 671-687 (2018).
  8. Riede, J., Wollmann, B. M., Molden, E., Ingelman-Sundberg, M. Primary human hepatocyte spheroids as an in vitro tool for investigating drug compounds with low clearance. Drug metabolism and disposition: The Biological Fate of Chemicals. 49 (7), 501-508 (2021).
  9. Soto-Gutierrez, A., et al. Differentiating stem cells into liver. Biotechnology & Genetic Engineering Reviews. 25, 149-163 (2008).
  10. Hurrell, T., et al. Human liver spheroids as a model to study aetiology and treatment of hepatic fibrosis. Cells. 9 (4), 964 (2020).
  11. Chen, S., et al. Hepatic spheroids derived from human induced pluripotent stem cells in bio-artificial liver rescue porcine acute liver failure. Cell Research. 30 (1), 95-97 (2020).
  12. Zhao, M., et al. Cytochrome P450 enzymes and drug metabolism in humans. International Journal of Molecular Sciences. 22 (23), 12808 (2021).
  13. Becker-Kojić, Z. A., Schott, A. K., Zipančić, I., Hernández-Rabaza, V. GM-Free generation of blood-derived neuronal cells. Journal of Visualized Experiments. (168), e61634 (2021).
  14. Marchenko, S., Flanagan, L. Immunocytochemistry: Human neural stem cells. Journal of Visualized Experiments. (7), e267 (2007).
  15. Crandall, B. F. Alpha-fetoprotein: a review. Critical Reviews in Clinical Laboratory Sciences. 15 (2), 127-185 (1981).
  16. Magalhães, J., Eira, J., Liz, M. A. The role of transthyretin in cell biology: impact on human pathophysiology. Cellular and Molecular Life Sciences 2021. 78 (17-18), 6105-6117 (2021).
  17. Huck, I., Gunewardena, S., Espanol-Suner, R., Willenbring, H., Apte, U. Hepatocyte nuclear factor 4 alpha activation is essential for termination of liver regeneration in mice. Hepatology. 70 (2), 666-681 (2019).
  18. Korver, S., et al. The application of cytokeratin-18 as a biomarker for drug-induced liver injury. Archives of Toxicology. 95 (11), 3435-3448 (2021).
  19. Klyushova, L. S., Perepechaeva, M. L., Grishanova, A. Y. The role of CYP3A in health and disease. Biomedicines. 10 (11), 2686 (2022).
  20. Fujino, C., Sanoh, S., Katsura, T. Variation in expression of cytochrome P450 3A isoforms and toxicological effects: endo- and exogenous substances as regulatory factors and substrates. Biological & Pharmaceutical Bulletin. 44 (11), 1617-1634 (2021).
  21. Hutchinson, M. R., Menelaou, A., Foster, D. J., Coller, J. K., Somogyi, A. A. CYP2D6 and CYP3A4 involvement in the primary oxidative metabolism of hydrocodone by human liver microsomes. British Journal of Clinical Pharmacology. 57 (3), 287-297 (2004).
  22. Asrani, S. K., Devarbhavi, H., Eaton, J., Kamath, P. S. Burden of liver diseases in the world. Journal of Hepatology. 70 (1), 151-171 (2019).
  23. Kammerer, S. Three-dimensional liver culture systems to maintain primary hepatic properties for toxicological analysis in vitro. International Journal of Molecular Sciences. 22 (19), 10214 (2021).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

191

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved