Karaciğer Hastalığı Çalışmaları için Periferik Kandan İnsan Karaciğer Sferoidleri

Özet

Burada, kararlı durumdaki periferik kandan izole edilen mononükleer hücreleri kullanarak insan otolog karaciğer sferoidleri üretmek için genetik olmayan bir yöntem sunuyoruz.

Özet

İnsan karaciğer hücreleri, fonksiyonel kapasitelerini koruyarak birkaç hafta boyunca kültürde büyüyebilen üç boyutlu (3D) bir yapı oluşturabilir. Düşük yapışkan özelliklere sahip veya hiç yapışkan olmayan kültür yemeklerinde kümelenme doğaları nedeniyle, insan karaciğer sferoidleri olarak adlandırılan çoklu karaciğer hücrelerinin agregalarını oluştururlar. 3D karaciğer sferoidlerinin oluşumu, hepatik hücrelerin yapışkan bir substratın yokluğunda toplanma doğal eğilimine dayanır. Bu 3D yapılar, in vivo bir ortama daha yakın olan hücrelerden daha iyi fizyolojik tepkilere sahiptir. 3D hepatosit kültürlerinin kullanılması, klasik iki boyutlu (2D) kültürlerle karşılaştırıldığında, biyolojik olarak daha alakalı bir mikro çevre, doğal organları yeniden bir araya getiren mimari morfolojinin yanı sıra hastalık durumu ve ilaçlara in vivo benzeri yanıtlar hakkında daha iyi bir tahmin de dahil olmak üzere sayısız avantaja sahiptir. Birincil karaciğer dokusu veya ölümsüzleştirilmiş hücre hatları gibi sferoidler üretmek için çeşitli kaynaklar kullanılabilir. 3D karaciğer dokusu, hepatositleri türetmek için insan embriyonik kök hücreleri (hESC'ler) veya indüklenmiş pluripotent kök hücreler (hiPSC'ler) kullanılarak da tasarlanabilir. İnsan zarına bağlı GPI'ye bağlı proteinin aktivasyonu ile manipüle edilmemiş periferik kandan üretilen ve insan hepatositlerine farklılaşan kan kaynaklı pluripotent kök hücreler (BD-PSC'ler) kullanarak insan karaciğer sferoidleri elde ettik. BD-PSC'lerden türetilen insan karaciğer hücreleri ve insan karaciğer sferoidleri, insan hepatosit belirteçleri kullanılarak ışık mikroskobu ve immünofenotipleme ile analiz edildi.

Giriş

Son yıllarda üç boyutlu (3D) küresel kültür sistemleri, kanser araştırmalarının, ilaç keşfinin ve toksikolojinin çeşitli alanlarını incelemek için önemli bir araç haline gelmiştir. Bu tür kültürler büyük ilgi uyandırıyor çünkü iki boyutlu (2B) hücre kültürü monokatmanları ile karmaşık organlar arasındaki boşluğu dolduruyorlar¹.

Yapışkan bir yüzeyin yokluğunda, 2D hücre kültürüne kıyasla, sferoidlerin oluşumu, bu hücrelerin 3D formda kümelenmeye olan doğal afinitesine dayanır. Bu hücreler kendilerini bir veya daha fazla olgun hücre tipinden oluşan gruplar halinde düzenlerler. Yabancı maddeler içermeyen bu hücreler, orijinal mikro ortamlarında olduğu gibi birbirleriyle etkileşime girerler. 3B kültürdeki hücreler çok daha yakındır ve birbirlerine doğru doğru bir yönelime sahiptir, 2B kültürlerden daha yüksek hücre dışı matriks üretimi vardır ve doğal ortama yakın bir ortam oluştururlar ².

Hayvan modelleri, insan biyolojisini ve hastalıklarını incelemek için uzun zamandır kullanılmaktadır³. Bu bağlamda, insanlar ve hayvanlar arasında içsel farklılıklar vardır, bu da bu modelleri ekstrapolatif çalışmalar için tamamen uygun kılmaz. 3D kültür sferoidleri ve organoidleri, in vivo olarak ortaya çıkan ve hayvan modellerinin azaltılmasına veya hatta değiştirilmesine katkıda bulunabilecek farklı hücre tipleri arasındaki doku benzeri mimariyi, etkileşimi ve çapraz konuşmayı incelemek için umut verici bir araçtır. Karaciğer hastalıklarının patogenezini ve ilaç tarama platformlarını incelemek için özellikle ilgi çekicidirler⁴.

3D sferoid kültür, kanser araştırmaları için özellikle önemlidir, çünkü tümör hücresi monokatmanlarını 2D kültürlere hazırlamak için gereken tripsinizasyon veya kollajenaz tedavisine olan ihtiyacı azaltarak hücreler ve çevreleri arasındaki süreksizliği ortadan kaldırabilir. Tümör sferoidleri, normal ve malign hücrelerin çevrelerinden gelen sinyalleri nasıl aldıklarının ve bunlara nasıl tepki verdiklerinin incelenmesini sağlar⁵ ve tümör biyolojisi çalışmalarının önemli bir parçasıdır.

Tek katmanla karşılaştırıldığında, çeşitli hücre tiplerinden oluşan 3D kültürler, yapısal ve fonksiyonel özelliklerinde tümör dokularına benzemektedir ve bu nedenle metastazı ve tümör hücrelerinin invazyonunu incelemek için uygundur. Bu nedenle bu tür küresel modeller kanser araştırmalarının hızlandırılmasına katkıda^{bulunuyor 6}.

Sferoidler ayrıca insan organoidleri yaratma teknolojisinin geliştirilmesine yardımcı oluyor, çünkü doku ve organ biyolojisinin incelenmesi, özellikle insanlarda çok zor. Kök hücre kültüründeki ilerlemeler, kök hücrelerden ve doku progenitörlerinden oluşan organoidler gibi 3D kültürlerin yanı sıra, organ gelişimini, hastalıkları modellemek için kullanılabilecek gerçek bir organ gibi bazı fonksiyonel özelliklere sahip bir organdan farklı olgun (doku) hücre tiplerinin geliştirilmesini mümkün kılmaktadır, ancak rejeneratif tıpta da yararlı sayılabilir⁷.

Birincil insan hepatositleri genellikle insan hepatositlerinin, karaciğer fonksiyonunun ve ilaca bağlı toksisitenin in vitro biyolojisini incelemek için kullanılır. İnsan hepatositlerinin kültürlerinin iki ana dezavantajı vardır, birincisi, insan hepatositleri gibi birincil dokunun sınırlı mevcudiyeti ve ikincisi, hepatositlerin 2D kültürde hızla farklılaşma eğilimi ve böylece spesifik hepatosit fonksiyonlarını kaybetme eğilimi⁸. 3D hepatik kültürler bu konuda üstündür ve son zamanlarda farklılaşmış insan embriyonik kök hücrelerinden (hESC'ler) veya indüklenmiş pluripotent kök hücrelerden (hiPSC'ler)⁹ yapılmıştır. Biyomühendislik hepatik 3D sferoidler, karaciğerin gelişimini, toksisitesini, genetik ve bulaşıcı hastalıklarını incelemek ve ayrıca karaciğer hastalıklarının tedavisi için ilaç keşfinde özellikle ilgi çekicidir¹⁰. Son olarak, akut karaciğer hastalıklarının yaklaşık% 80'lik bir mortalite oranına sahip olduğunu bilerek, biyo-yapay karaciğer ve / veya hepatik sferoidlerin, uygun bir donör bulunana kadar kısmi karaciğer fonksiyonu sağlayarak bu hastaları potansiyel olarak kurtarabileceğini bilerek, klinik olarak kullanılma potansiyeline sahiptirler¹¹.

4000 ila 1 x 10⁶ hücre içeren farklı büyüklükteki sferoidleri hazırlamak için kan kaynaklı pluripotent kök hücreler (BD-PSC'ler) kullanarak insan hepatik sferoidlerinin üretimi için bir protokol oluşturduk ve bunları ışık mikroskobu ve immünofloresan yoluyla analiz ettik. Ayrıca, detoksifikasyon süreci boyunca hücresel ve ilaç metabolizmasında önemli rollere sahip sitokrom P450 ailesine ait sitokrom P450 3A4 (CYP3A4) ve 2E1 (CYP2E1) enzimlerinin ekspresyonunu değerlendirerek hepatosit-spesifik fonksiyonun kapasitesini test ettik¹².

Protokol

Bu deneylerin yapılması için etik onay (ACA CELL Biotech GmbH/25b-5482.2-64-1) alınmış ve kurumsal kılavuzlara uygun olarak kan alınmadan önce tüm donörler tarafından bilgilendirilmiş onam imzalanmıştır.

1. İnsan periferik kanından (PB) mononükleer hücrelerin (ÇUŞ'lar) hazırlanması

1. Standart protokole göre eğitimli tıbbi personelin yardımıyla sağlıklı donörlerden 30 mL kan alın.
2. PBMNC'leri yoğunluk gradyanı ortamını kullanarak Becker-Kojić ve ^ark.13 tarafından yayınlanan protokole göre izole edin. Pipetleme yoluyla, plazma ve yoğunluk gradyanı ortamı arasındaki fazlar arası tabakayı izole edin ve izole edilmiş hücreleri yıkamak için steril fosfat tampon salin (PBS) kullanın.
3. Bir sayım odası kullanın ve standart yöntemleri kullanarak hücre sayısını sayın.

2. İnsan GPI'sına bağlı glikoprotein ile aktivasyon üzerine ÇUŞ'ların farklılaşması

1. Bir polistiren tüpünde (15 mL) PBS / % 1 sığır serum albüminine (BSA) 6 x 10⁶ mononükleer hücre yerleştirin ve Becker-Kojić ve ^ark.13'e göre 37 ° C'de 30 dakika boyunca spesifik antikor ile inkübe edin.
2. Hücreleri oda sıcaklığında 300 x g'da santrifüj edin ve PBS / BSA'yı, Iscove'un% 10 fetal sığır serumu (FBS) ile desteklenmiş modifiye edilmiş Dulbecco ortamı ile değiştirin.
3. Becker-Kojić ve ark.13'te açıklandığı gibi, 15 mL polistiren tüplerdeki hücreleri, 37 ° C'de 37 ° C'de% 5'lik bir CO₂ inkübatöründe ^8-10 gün boyunca büyütün. 5. günde (D5), her 15 mL tüpe %10 FBS ile desteklenmiş 1-2 mL Iscove ortamı ekleyin.

3. Yeni oluşturulan farklılaşmış hücrelerin sıralanması

1. Oda sıcaklığında kültürlü hücre süspansiyonunu 300 x g'da 10 dakika boyunca santrifüj yapın ve Becker-Kojić ve ^ark.13'e göre elde edilen süpernatantı steril bir pipetle aspire edin.
2. 90 μL soğuk PBS tamponunda (PBS pH 7.2, % 0.5 BSA ve 2 mM EDTA) santrifüjleme ile elde edilen peleti yeniden askıya alın ve 10 μL CD45 pozitif nano boyutlu manyetik boncuk ekleyin ve 15 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin.
3. Hücre süspansiyonunu 2 mL PBS tamponu ile yıkayın, oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj edin ve hücrelere 500 μL PBS tamponu ekleyin ve iyice askıya alın.
4. Pipet 500 μL önceden soğutulmuş PBS tamponunu kolona yıkayıp manyetik bir stand kullanarak manyetik alana yerleştirin.
5. Kolon üzerine yerleştirilen hücreleri, 500 μL PBS tamponu ile iki kez yıkayın ve% 10 FBS ile desteklenmiş Iscove'un ortamında CD45 negatif hücreleri içeren akış toplayın.
6. Yeniden programlanmış hücrelerin sayısını belirlemek için bir sayım odası kullanın.

4. İnsan hepatositlerinin üretimi için cam kapakların hazırlanması

1. Cam kapakları ayırın (14 mm) ve 10 dakika boyunca iyonik olmayan deterjanda inkübe edin. Cam kapakları deiyonize suda kabarcık kalmayana kadar yıkayın ve 30 dakika boyunca 1M HCl'de inkübe edin (Marchenko ve ^ark.14'ten uyarlanmıştır).
2. Cam kapakları deiyonize suyla en az 3 kat yıkayın ve gece boyunca oda sıcaklığında kurutun. Otoklav kurutulmuş cam kapaklar uygun bir kapta kayar.

5. BD-PSC'lerin 2D hepatik farklılaşması için hücre kültürü plakalarının biyolaminin ile kaplanması

1. Steril bir çift cımbızla otoklavlanmış cam kapakları 4 kuyucuk plakasına yerleştirin ve steril koşullar sağlamak için UV ışıklarını 30 dakika boyunca açın.
2. Biyolaminin alikotlarını çözün ve her cam kapak kaymasına 120 μL 5 μg / mL biyolaminin ekleyin. Kaplamalı cam kapakları gece boyunca 4 °C'de bırakın.
3. Biyolaminin fazlalığını çıkarın ve aşağıda açıklandığı gibi 200 μL hepatosit farklılaşma ortamı ekleyin.

6. Hepatosit farklılaşma ortamının hazırlanması

1. % 76.4 nakavt DMEM (ko-dmem),% 20 KSR,% 0.5 L-glutamin,% 1 esansiyel olmayan amino asitler (NEAA),% 0.1 β-merkaptoetanol,% 1 DMSO ve% 1 penisilin-streptomisin (Pen / Strep) içeren 500 mL hepatoblast nakavt serum replasmanı (KSR) / dimetil sülfoksit (DMSO) ortamı yapın.
2. % 1 L-glutamin, 10 μM hidrokortizon 21-hemissüksinat sodyum tuzu (HCC) ve% 1 Pen / Strep içeren 500 mL hepatosit olgunlaşma ortamı hazırlayın.
3. Stoktan alınan alikot besiyeri ve her ortam değişimi için 10 ng / mL ve / veya 20 ng / mL'lik son konsantrasyonlarda taze hepatosit büyüme faktörü (HGF) ve onkostatin M (OSM) ekleyin.
   NOT: Onkostatin M, hematopoez ve karaciğer gelişimi için önemli olan interlökin 6 sitokin grubuna ait bir sitokindir.

7. BD-PSC'lerden farklılaşmış hepatik hücrelerin kültürlenmesi

1. 3 x 10⁵ BD-PSCS hücresini, biyolaminin ile kaplanmış 4 delikli bir plakanın her bir kuyucuğuna koyun.
2. 4 delikli plakaları inkübatöre 37 °C ve% 5 CO_2'ye yerleştirin. Endodermal farklılaşmayı destekleyen KSR / DMSO hepatoblast ortamında hücreleri 5 gün boyunca kültürleyin ve ortamı her iki günde bir değiştirin.
3. 5. günde hepatosit olgunlaşma ortamına geçin ve hücreleri inkübatörde 37 ° C ve% 5 CO_2'de 7-10 gün daha kültürleyin. Ortamı her 48 saatte bir değiştirin.

8.3D küresel hepatik farklılaşma

1. Bir sayım odası kullanarak hücreleri sayın.
2. Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj BD-farklılaştırılmış hücre süspansiyonu. Süpernatantı çıkarın ve BD-farklılaştırılmış hücreleri KSR / DMSO ortamında 2 x 10⁶ hücre / mL'de yeniden askıya alın.
3. Tek hücreli bir süspansiyon sağlamak ve ek kalıntıları gidermek için hücreleri 40 μm'lik bir hücre süzgecinden geçirin.
4. Bir sayım odası kullanarak hücreleri sayın ve kuyucuk başına gerekli hacmi dağıtmak için her hücre tohumlama yoğunluğu için yeterli bir hacim hazırlayın. 4000 hücrelik düşük bir tohumlama yoğunluğuna 1 x 10⁶ hücreli üst tohumlama ile bir gradyan hazırlayın.
5. 96 iyi düşük bağlantı plakasına 100 μL KSR / DMSO ortamı dağıtın ve 100 μL hücre tohumlama seyreltmesi ekleyin.
6. Düşük bağlantı plakasını inkübatöre 37 ° C ve% 5 CO_2'ye yerleştirin ve 5 gün boyunca kültürleyin.
7. Sferoidler yeterince kompakt olduğunda, tohumlamadan sonra ortamın% 50'sini 3-4 gün arasında değiştirin.
8. 5. günde, ortamı hepatosit olgunlaşma ortamına değiştirin ve daha fazla olgunlaşma için hücreleri 7-10 gün daha kültürleyin. Ortamı her iki günde bir değiştirin.

9. Yeni üretilen 2D karaciğer hücre kültürlerinin immünofloresan analizi

1. Hücreleri yukarıda açıklanan farklılaşma yöntemine göre 4, 8, 15 ve 24 gün boyunca kültürleyin ve ortamları çıkarın.
2. PBS'de 10 dakika boyunca% 4 paraformaldehit içeren önceden ısıtılmış fiksatif ile hücreleri inkübe edin. Fiksatifi atın ve hücreleri her biri 5 dakika boyunca PBS ile 2 kat yıkayın. Hemen% 0.1 triton X-100 çözeltisi ekleyin ve hücreleri 5 dakika geçirgenleştirin. PBS ile 2 kat yıkayın.
3. PBS ve% 5 BSA'dan yapılmış blokaj çözeltisi ekleyin ve oda sıcaklığında 1 saat boyunca rocker plakasına yerleştirin.
4. Seyreltme tamponundaki primer antikorları %1 BSA/PBS olarak aşağıdaki gibi seyreltin: albümin (ALB) 1:50, alfa-1 fetoprotein (AFP) 1:250, sitokeratin 18 (CK18) 1:50, hepatosit nükleer faktör 4 alfa (HNF4α) 1:1000 ve transtiretin (TTR) 1:50. Kuyucuk başına 50 μL antikor seyreltme kullanın.
5. Hücreleri oda sıcaklığında 1 saat boyunca inkübe edin. Daha sonra antikor çözeltisini atın, hücreleri 5 dakika yıkayın ve yıkama adımını 3x tekrarlayın.
6. Seyreltme tamponunda aşağıdaki ikincil antikorları hazırlayın: tavşan anti-tavuk IgG (Teksas kırmızısı) 1:1000, keçi anti-fare IgG (488) 1:1000 ve keçi anti-tavşan (488) 1:500. Kuyucuk başına 50 μL antikor seyreltmesi kullanın ve hücreleri oda sıcaklığında 30 dakika boyunca inkübe edin.
7. Hücreleri PBS ile her biri 5 dakika boyunca 3 kat yıkayın ve mikroskobik analiz için kapak kapaklarını DAPI içeren montaj ortamıyla monte edin.

10. Yeni oluşan karaciğer sferoidlerinin canlı boyanması

1. Sferoidlere dokunmadan kültür ortamını dikkatlice atın,% 0.1 triton X-100 çözeltisi ile taze yapılmış PBS ekleyin ve hücreleri geçirgenleştirmek için 5 dakika boyunca inkübe edin.
2. Sferoidleri 5 dakika boyunca yavaşça pipetleyerek ortamla yıkayın, 2x tekrarlayın.
3. Sferoidleri, PBS'de hazırlanan birincil antikorlar ALB (1:50), AFP (1:250), CK18 (1:50), CYP2E1 (1:200) ve CYP3A4 (1:200) ile 37 °C'de %5 CO₂ inkübatöründe 1 saat boyunca %1 BSA ile inkübe edin. Kuyucuk başına 50 μL antikor seyreltme kullanın.
4. Fazla antikor çözeltisini dikkatlice çıkarın ve sferoidleri orta 3x ile yıkayın.
5. PBS'de keçi anti-tavşan (488) için karşılık gelen ikincil antikorları keçi anti-fare IgG (Cy3), keçi anti-fare IgG (488) ve tavşan anti-tavuk IgG (Teksas kırmızısı)% 1 BSA'da PBS'de keçi anti-tavşan (488) için 1:1000 ve 1:500 seyreltmede hazırlayın. Kuyucuk başına 50 μL antikor seyreltme kullanın ve inkübatörde 37 °C ve% 5 CO_{2'de 20} dakika inkübe edin.
6. 3x'i orta dereceli olarak dikkatlice yıkayın ve floresan mikroskobu yapmadan önce plakayı inkübatörde 37 ° C'de ve% 5 CO_2'de 30 dakika bekletin.

11. Floresan mikroskobu kullanılarak sferoidlerin incelenmesi

1. Kullanmadan 10 dakika önce floresan ışık kaynağını açın, bilgisayarı açın ve görüntüleme yazılımını açın.
2. 4x büyütmeli bir hedef kullanın, doğru ölçek çubuğunun seçilmesi için araç çubuğundaki 4x düğmesine tıklayın, ardından 96 delikli plakayı sahne alanı orta plakasına yerleştirin.
3. LED ışık kaynağını açın, parlak alan filtresini kullanın ve x-y ekseni sahne alanı ayarlama düğmesini kullanarak plakayı ilgilendiğiniz kuyuya yerleştirin.
4. Kamera ışık yoluna geçin, ekrandaki görüntüyü görselleştirmek için Görüntüleme yazılımında yaşa düğmesine tıklayın ve x-y ekseni düğmeleri kullanılarak kürenin ortalandığından emin olun ve kaba/ince netleme düğmesini kullanarak netleyin.
   NOT: Sferoidlerin şekli, canlı boyama uygulandıktan sonra sabit kalır.
5. Araç çubuğunda Brightfield Gözlem yöntemini seçin, pozlama ayarlarını otomatik konuma getirin ve fotoğraf çekmek için fotoğraf makinesi kontrol panelindeki Anlık Görüntü düğmesini tıklatın. Ardından, ilgilendiğiniz klasördeki uygun adı kullanarak resmi .vsi dosyası olarak kaydedin.
6. LED ışığını kapatmak için ortam ışığı koruma plakasını yerleştirin, B-uyarımı filtresine geçin, araç çubuğunda 488 Gözlem yöntemini seçin, deklanşörü açın, Anlık Görüntü düğmesini tıklayarak fotoğraf çekin, deklanşörü kapatın, ardından dosyayı yukarıda açıklandığı gibi kaydedin.
7. Bunu, uygun gözlem yöntemini (Teksas kırmızısı veya CY3) kullanarak G-uyarma için bir filtre ile tekrarlayın. Ardından, her bir ilgi kuyusu için tüm prosedürü tekrarlayın.
8. Plakayı 37 °C'de% 5 CO₂ inkübatöre geri koyun ve yukarıda açıklandığı gibi kültürleyin.

Sonuçlar

İki aşamalı bir protokol uygulayarak insan BD-PSC'lerini endoderm/hepatik progenitör hücrelere ve hepatositlere başarıyla ayırdık. Hepatik farklılaşma sürecindeki morfolojik değişiklikler Şekil 1'de gösterilmiştir. BD-PSC'ler üç farklı aşamadan geçen hepatositlere farklılaşır. İlk aşama, tipik bir poligonal morfoloji sergileyen hepatik progenitör hücrelere (hepatoblast) L8'e farklılaşmayı ve üçüncüsü, hepatositler L15-L24'e olgunlaşmayı temsil eder.

...

Tartışmalar

Karaciğer, insan vücudunda, metabolitlerin detoksifikasyonu gibi birçok temel biyolojik fonksiyona sahip önemli bir organdır. Siroz ve / veya viral hepatit gibi ciddi karaciğer yetmezliği nedeniyle, dünya çapında yılda yaklaşık 2 milyon ölüm vardır. Karaciğer nakilleri tüm dünyada solid organ nakillerinde ikinci sırada yer almakla birlikte mevcut ihtiyacın sadece %10'u karşılanmaktadır²².

Birincil insan hepatositleri (PHH) genellikle karaciğer t...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Albumin antibody	Sigma-Aldrich	SAB3500217	produced in chicken
Albumin Fraction V	Carl Roth GmbH+Co. KG	T8444.4
Alpha-1 Fetoprotein	Proteintech Germany GmbH	14550-1-AP	rabbit polyclonal IgG
Biolaminin 111 LN	BioLamina	LN111-02	human recombinant
CD45 MicroBeads	Miltenyi	130-045-801	nano-sized magnetic beads
Cell Strainer	pluriSelect	43-10040-40
CellSens	Olympus		imaging software
Centrifuge tubes 50 mL	Greiner Bio-One	210270
CEROplate 96 well	OLS OMNI Life Science	2800-109-96
CKX53	Olympus
Commercially available detergent	Procter & Gamble		nonionic detergent
CYP2E1-specific antibody	Proteintech Germany GmbH	19937-1-AP	rabbit polyclonal antibody IgG
CYP3A4	Proteintech Germany GmbH	67110-1-lg	mouse monoclonal antibody IgG1
Cytokeratin 18	DakoCytomation	M7010	mouse monoclonal antibody IgG1
DMSO	Sigma-Aldrich	D8418-50ML
DPBS	Thermo Fisher Scientific	14040091
FBS	Merck Millipore	S0115/1030B	Discontinued. Available under: TMS-013-B
Glass cover slips 14 mm	R. Langenbrinck	01-0014/1
GlutaMax 100x Gibco	Thermo Fisher Scientific	35050038	L-glutamine
Glutaraldehyde 25%	Sigma-Aldrich	G588.2-50ML
Goat anti-mouse IgG Cy3	Antibodies online	ABIN1673767	polyclonal
Goat anti-mouse IgG DyLight 488	Antibodies online	ABIN1889284	polyclonal
Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 488	Life Technologies	A-11008
HCl	Sigma-Aldrich	30721-1LGL
HepatoZYME-SFM	Thermo Fisher Scientific	17705021	hepatocyte maturation medium
HGF	Thermo Fisher Scientific	PHG0324	human recombinant
HNF4α antibody	Sigma-Aldrich	ZRB1457-25UL	clone 4C19 ZooMAb Rbmono
Hydrocortisone 21-hemisuccinate (sodium salt)	Biomol	Cay18226-100
Knock out Serum Replacement - Multi Species Gibco	Fisher Scientific	A3181501	KSR
KnockOut DMEM/F-12	Thermo Fisher Scientific	12660012	Discontinued. Available under Catalog No. 10-828-010
MACS Buffer	Miltenyi	130-091-221
MACS MultiStand	Miltenyi	130-042-303	magnetic stand
MEM NEAA 100x Gibco	Thermo Fisher Scientific	11140035
Mercaptoethanol	Thermo Fisher Scientific	31350010	50mM
MiniMACS columns	Miltenyi	130-042-201
Nunclon Multidishes	Sigma-Aldrich	D6789	4 well plates
Oncostatin M	Thermo Fisher Scientific	PHC5015	human recombinant
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	158127
PBS sterile	Carl Roth GmbH+Co. KG	9143.2
Penicillin/Streptomycin	Biochrom GmbH	A2213	10000 U/ml
PS 15ml tubes sterile	Greiner Bio-One	188171
Rabbit anti-chicken IgG Texas red	Antibodies online	ABIN637943
Roti Cell Iscoves MDM	Carl Roth GmbH+Co. KG	9033.1
Roti Mount FluorCare DAPI	Carl Roth GmbH+Co. KG	HP20.1
Roti Sep 1077 human	Carl Roth GmbH+Co. KG	0642.2
Transthyretin antibody	Sigma-Aldrich	SAB3500378	produced in chicken
Triton X-100	Thermo Fisher Scientific	HFH10	1%