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肝疾患研究のための末梢血からのヒト肝スフェロイド
要約
ここでは、定常状態の末梢血から単核球を単離した単核球を用いてヒト自家肝スフェロイドを作製する非遺伝的方法を紹介します。
要約
ヒト肝細胞は、数週間培養中で増殖し、その機能的能力を維持することができる三次元(3D)構造を形成することができる。接着特性が低いかまったくない培養皿に集まる性質のため、ヒト肝スフェロイドと呼ばれる複数の肝細胞の凝集体を形成します。3D肝スフェロイドの形成は、接着性基質がない場合に肝細胞が凝集する自然な傾向に依存しています。これらの3D構造は、 in vivo 環境に近い細胞よりも優れた生理学的応答を示します。3D肝細胞培養を使用することは、より生物学的に関連性のある微小環境、天然器官を再構成する建築形態、疾患状態および薬物に対する in vivo様反応に関するより良い予測を含む、古典的な2次元(2D)培養と比較して多くの利点を有する。一次肝臓組織や不死化細胞株などのさまざまなソースを使用してスフェロイドを生成できます。3D肝臓組織は、ヒト胚性幹細胞(hESC)または人工多能性幹細胞(hiPSC)を使用して肝細胞を誘導することによって操作することもできます。ヒト膜結合GPI結合タンパク質の活性化により非改変末梢血から作製し、ヒト肝細胞に分化させた血液由来多能性幹細胞(BD-PSC)を用いてヒト肝スフェロイドを取得しています。BD-PSC由来のヒト肝細胞およびヒト肝スフェロイドを、光学顕微鏡およびヒト肝細胞マーカーを用いたイムノフェノタイピングによって分析した。
概要
近年、3次元(3D)スフェロイド培養システムは、癌研究、創薬、毒物学のさまざまな分野を研究するための重要なツールになっています。このような培養は、2次元(2D)細胞培養単層と複雑な器官の間のギャップを埋めるため、大きな関心を集めています1。
接着面がない場合、2D細胞培養と比較して、スフェロイドの形成は、3D形態のクラスターに対するこれらの細胞の自然な親和性に基づいています。これらの細胞は、1つ以上のタイプの成熟細胞からなるグループに組織化されます。異物がないので、これらの細胞は元の微小環境のように相互作用します。3D培養中の細胞は、2D培養よりも細胞外マトリックス産生が高く、互いにより近く、適切な配向性を有し、 自然環境に近い2を構成しています。
動物モデルは、人間の生物学と病気の研究に長い間使用されてきました3。この点で、人間と動物の間には本質的な違いがあるため、これらのモデルは外挿研究に完全には適していません。3D培養スフェロイドとオルガノイドは、 in vivo で発生する組織様の構造、相互作用、および異なる細胞タイプ間のクロストークを研究するための有望なツールであり、動物モデルの削減または置き換えにも貢献できます。それらは、肝疾患の病因および薬物スクリ....
プロトコル
これらの実験を実施するための倫理的承認が得られ(ACA CELL Biotech GmbH / 25b-5482.2-64-1)、施設のガイドラインに従って採血前にすべてのドナーがインフォームドコンセントに署名しました。
1.ヒト末梢血(PB)からの単核球(MNC)の調製
- 標準プロトコルに従って、訓練を受けた医療従事者の助けを借りて、健康なドナーから30 mLの血液を抽出します。
- Becker-Kojićらによって公開されたプロトコルに従って、密度勾配媒体を使用してPBMNCを単離します13。ピペッティングにより、血漿と密度勾配培地の間の間相層を単離し、滅菌リン酸緩衝生理食塩水(PBS)を使用して単離された細胞を洗浄します。
- 計数チャンバーを使用し、標準的な方法を使用してセル数をカウントします。
2. ヒトGPIアンカー糖タンパク質による活性化による多国籍企業の脱分化
- 6 x 106 単核球をPBS/1%ウシ血清アルブミン(BSA)中のポリスチレンチューブ(15 mL)に入れ、Becker-Kojićら13に従って、特異的抗体とともに37°Cで30....
結果
ヒトBD-PSCを2段階のプロトコルを適用することにより、内胚葉/肝前駆細胞および肝細胞への分化に成功しました。肝分化過程における形態学的変化を 図1に示す。BD-PSCは、3つの異なる段階を経る肝細胞に分化します。第1段階は、内胚葉細胞L4への分化を表し、第2段階は、肝前駆細胞(肝芽細胞)L8への分化は、典型的な多角形の形態を呈し、第3段階は、肝細胞L15-L24への成?.......
ディスカッション
肝臓は、代謝産物の解毒など、多くの重要な生物学的機能を備えた人体の主要な器官です。肝硬変やウイルス性肝炎などの重度の肝不全により、世界中で年間200万人近くが死亡しています。肝移植は世界の固形臓器移植で2番目にランクされていますが、現在のニーズの約10%しか満たされていません22。
初代ヒト肝細胞(PHH)は、肝毒性の研究によく使用さ.......
開示事項
対応する著者は、彼女が新規ヒトGPI結合タンパク質に関連する特許権者であることを宣言します。彼女はACA CELL Biotech GmbHを共同設立し、協力しています。他の著者は、利益相反はないと宣言しています。
謝辞
著者は、OksanaとJohn Greenacreによって提供された技術支援に特に感謝しています。この研究は、ドイツのハイデルベルクのACA CELL Biotech GmbHによってサポートされました。
....資料
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Albumin antibody | Sigma-Aldrich | SAB3500217 | produced in chicken |
| Albumin Fraction V | Carl Roth GmbH+Co. KG | T8444.4 | |
| Alpha-1 Fetoprotein | Proteintech Germany GmbH | 14550-1-AP | rabbit polyclonal IgG |
| Biolaminin 111 LN | BioLamina | LN111-02 | human recombinant |
| CD45 MicroBeads | Miltenyi | 130-045-801 | nano-sized magnetic beads |
| Cell Strainer | pluriSelect | 43-10040-40 | |
| CellSens | Olympus | imaging software | |
| Centrifuge tubes 50 mL | Greiner Bio-One | 210270 | |
| CEROplate 96 well | OLS OMNI Life Science | 2800-109-96 | |
| CKX53 | Olympus | ||
| Commercially available detergent | Procter & Gamble | nonionic detergent | |
| CYP2E1-specific antibody | Proteintech Germany GmbH | 19937-1-AP | rabbit polyclonal antibody IgG |
| CYP3A4 | Proteintech Germany GmbH | 67110-1-lg | mouse monoclonal antibody IgG1 |
| Cytokeratin 18 | DakoCytomation | M7010 | mouse monoclonal antibody IgG1 |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418-50ML | |
| DPBS | Thermo Fisher Scientific | 14040091 | |
| FBS | Merck Millipore | S0115/1030B | Discontinued. Available under: TMS-013-B |
| Glass cover slips 14 mm | R. Langenbrinck | 01-0014/1 | |
| GlutaMax 100x Gibco | Thermo Fisher Scientific | 35050038 | L-glutamine |
| Glutaraldehyde 25% | Sigma-Aldrich | G588.2-50ML | |
| Goat anti-mouse IgG Cy3 | Antibodies online | ABIN1673767 | polyclonal |
| Goat anti-mouse IgG DyLight 488 | Antibodies online | ABIN1889284 | polyclonal |
| Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 488 | Life Technologies | A-11008 | |
| HCl | Sigma-Aldrich | 30721-1LGL | |
| HepatoZYME-SFM | Thermo Fisher Scientific | 17705021 | hepatocyte maturation medium |
| HGF | Thermo Fisher Scientific | PHG0324 | human recombinant |
| HNF4α antibody | Sigma-Aldrich | ZRB1457-25UL | clone 4C19 ZooMAb Rbmono |
| Hydrocortisone 21-hemisuccinate (sodium salt) | Biomol | Cay18226-100 | |
| Knock out Serum Replacement - Multi Species Gibco | Fisher Scientific | A3181501 | KSR |
| KnockOut DMEM/F-12 | Thermo Fisher Scientific | 12660012 | Discontinued. Available under Catalog No. 10-828-010 |
| MACS Buffer | Miltenyi | 130-091-221 | |
| MACS MultiStand | Miltenyi | 130-042-303 | magnetic stand |
| MEM NEAA 100x Gibco | Thermo Fisher Scientific | 11140035 | |
| Mercaptoethanol | Thermo Fisher Scientific | 31350010 | 50mM |
| MiniMACS columns | Miltenyi | 130-042-201 | |
| Nunclon Multidishes | Sigma-Aldrich | D6789 | 4 well plates |
| Oncostatin M | Thermo Fisher Scientific | PHC5015 | human recombinant |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| PBS sterile | Carl Roth GmbH+Co. KG | 9143.2 | |
| Penicillin/Streptomycin | Biochrom GmbH | A2213 | 10000 U/ml |
| PS 15ml tubes sterile | Greiner Bio-One | 188171 | |
| Rabbit anti-chicken IgG Texas red | Antibodies online | ABIN637943 | |
| Roti Cell Iscoves MDM | Carl Roth GmbH+Co. KG | 9033.1 | |
| Roti Mount FluorCare DAPI | Carl Roth GmbH+Co. KG | HP20.1 | |
| Roti Sep 1077 human | Carl Roth GmbH+Co. KG | 0642.2 | |
| Transthyretin antibody | Sigma-Aldrich | SAB3500378 | produced in chicken |
| Triton X-100 | Thermo Fisher Scientific | HFH10 | 1% |
参考文献
- Fennema, E., Rivron, N., Rouwkema, J., van Blitterswijk, C., de Boer, J. Spheroid culture as a tool for creating 3D complex tissues. Trends in Biotechnology. 31 (2), 108-115 (2013).
- Ryu, N. E., Lee, S. H., Park, H. Sph....
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