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要約

ここでは、定常状態の末梢血から単核球を単離した単核球を用いてヒト自家肝スフェロイドを作製する非遺伝的方法を紹介します。

要約

ヒト肝細胞は、数週間培養中で増殖し、その機能的能力を維持することができる三次元(3D)構造を形成することができる。接着特性が低いかまったくない培養皿に集まる性質のため、ヒト肝スフェロイドと呼ばれる複数の肝細胞の凝集体を形成します。3D肝スフェロイドの形成は、接着性基質がない場合に肝細胞が凝集する自然な傾向に依存しています。これらの3D構造は、 in vivo 環境に近い細胞よりも優れた生理学的応答を示します。3D肝細胞培養を使用することは、より生物学的に関連性のある微小環境、天然器官を再構成する建築形態、疾患状態および薬物に対する in vivo様反応に関するより良い予測を含む、古典的な2次元(2D)培養と比較して多くの利点を有する。一次肝臓組織や不死化細胞株などのさまざまなソースを使用してスフェロイドを生成できます。3D肝臓組織は、ヒト胚性幹細胞(hESC)または人工多能性幹細胞(hiPSC)を使用して肝細胞を誘導することによって操作することもできます。ヒト膜結合GPI結合タンパク質の活性化により非改変末梢血から作製し、ヒト肝細胞に分化させた血液由来多能性幹細胞(BD-PSC)を用いてヒト肝スフェロイドを取得しています。BD-PSC由来のヒト肝細胞およびヒト肝スフェロイドを、光学顕微鏡およびヒト肝細胞マーカーを用いたイムノフェノタイピングによって分析した。

概要

近年、3次元(3D)スフェロイド培養システムは、癌研究、創薬、毒物学のさまざまな分野を研究するための重要なツールになっています。このような培養は、2次元(2D)細胞培養単層と複雑な器官の間のギャップを埋めるため、大きな関心を集めています1。

接着面がない場合、2D細胞培養と比較して、スフェロイドの形成は、3D形態のクラスターに対するこれらの細胞の自然な親和性に基づいています。これらの細胞は、1つ以上のタイプの成熟細胞からなるグループに組織化されます。異物がないので、これらの細胞は元の微小環境のように相互作用します。3D培養中の細胞は、2D培養よりも細胞外マトリックス産生が高く、互いにより近く、適切な配向性を有し、 自然環境に近い2を構成しています。

動物モデルは、人間の生物学と病気の研究に長い間使用されてきました3。この点で、人間と動物の間には本質的な違いがあるため、これらのモデルは外挿研究に完全には適していません。3D培養スフェロイドとオルガノイドは、 in vivo で発生する組織様の構造、相互作用、および異なる細胞タイプ間のクロストークを研究するための有望なツールであり、動物モデルの削減または置き換えにも貢献できます。それらは、肝疾患の病因および薬物スクリーニングプラットフォームを研究するために特に興味深いものです4。

3Dスフェロイド培養は、2D培養用の腫瘍細胞単分子膜の調製に必要なトリプシン処理またはコラゲナーゼ処理の必要性を減らすことにより、細胞とその環境との間の不連続性を排除できるため、癌研究にとって特に重要です。腫瘍スフェロイドは、正常細胞と悪性細胞が周囲からのシグナルをどのように受信して応答するかの研究を可能にし5 、腫瘍生物学研究の重要な部分です。

単層と比較して、さまざまな細胞タイプからなる3D培養は、その構造的および機能的特性において腫瘍組織に類似しているため、腫瘍細胞の転移および浸潤の研究に適しています。そのため、このようなスフェロイドモデルは癌研究の加速に貢献しています6。

スフェロイドは、組織および臓器生物学、特にヒトにおいて研究が非常に難しいため、ヒトオルガノイドを作成する技術の開発にも役立っています。幹細胞培養の進歩により、幹細胞や組織前駆細胞からなるオルガノイドのような3次元培養や、臓器発生や疾患のモデル化に利用できる実際の臓器のような機能的特徴を持つ臓器からのさまざまな種類の成熟(組織)細胞の開発が可能になりますが、再生医療にも有用であると考えられます7。

初代ヒト肝細胞は通常、ヒト肝細胞、肝機能、および薬物誘発毒性の in vitro 生物学の研究に使用されます。ヒト肝細胞の培養には、ヒト肝細胞のような初代組織の限られた利用可能性、および第二に、肝細胞が2D培養で急速に脱分化し、それによって特定の肝細胞機能を失う傾向の2つの主な欠点があります8。3D肝培養はこの点で優れており、最近では分化したヒト胚性幹細胞(hESC)または人工多能性幹細胞(hiPSC)から作られています9。バイオエンジニアリングされた肝臓3Dスフェロイドは、肝臓の開発、毒性、遺伝性疾患、感染症の研究、ならびに肝疾患の治療のための創薬に特に関心があります10。最後に、急性肝疾患の死亡率は80%近くであり、生物人工肝臓および/または肝スフェロイドは、適切なドナーが見つかるまで部分的な肝機能を提供することにより、これらの患者を救う可能性があることを知って、臨床的に使用される可能性もあります11。

血液由来多能性幹細胞(BD-PSC)を用いてヒト肝スフェロイドを作製し、4000〜1×106 個の細胞を含む異なるサイズのスフェロイドを作製し、光学顕微鏡と免疫蛍光法で解析しました。また、肝細胞特異的な機能の能力をテストし、解毒の過程で細胞および薬物代謝に重要な役割を果たすシトクロムP450ファミリーに属するシトクロムP450 3A4(CYP3A4)および2E1(CYP2E1)酵素の発現を評価しました12。

プロトコル

これらの実験を実施するための倫理的承認が得られ(ACA CELL Biotech GmbH / 25b-5482.2-64-1)、施設のガイドラインに従って採血前にすべてのドナーがインフォームドコンセントに署名しました。

1.ヒト末梢血(PB)からの単核球(MNC)の調製

  1. 標準プロトコルに従って、訓練を受けた医療従事者の助けを借りて、健康なドナーから30 mLの血液を抽出します。
  2. Becker-Kojićらによって公開されたプロトコルに従って、密度勾配媒体を使用してPBMNCを単離します13。ピペッティングにより、血漿と密度勾配培地の間の間相層を単離し、滅菌リン酸緩衝生理食塩水(PBS)を使用して単離された細胞を洗浄します。
  3. 計数チャンバーを使用し、標準的な方法を使用してセル数をカウントします。

2. ヒトGPIアンカー糖タンパク質による活性化による多国籍企業の脱分化

  1. 6 x 106 単核球をPBS/1%ウシ血清アルブミン(BSA)中のポリスチレンチューブ(15 mL)に入れ、Becker-Kojićら13に従って、特異的抗体とともに37°Cで30分間インキュベートします。
  2. 室温で300 x g で細胞を遠心分離し、PBS / BSAを10%ウシ胎児血清(FBS)を添加したIscoveの改変ダルベッコ培地と交換します。
  3. Becker-Kojićら13に記載されているように、37°Cの5%CO2インキュベーター内の15mLポリスチレンチューブで細胞を8〜10日間増殖させます。5日目(D5)に、10%FBSを添加したIscove培地1〜2 mLを各15 mLチューブに追加します。.

3. 新たに生成した脱分化細胞の選別

  1. 細胞懸濁液を室温で300 x g で10分間遠心分離し、得られた上清をBecker-Kojićら13に従って滅菌ピペットで吸引した。
  2. 遠心分離によって得られたペレットを90 μLのコールドPBSバッファー(PBS pH 7.2、0.5 % BSA、および2 mM EDTA)に再懸濁し、10 μLのCD45陽性ナノサイズの磁気ビーズを加えて氷上で15分間インキュベートします。
  3. 細胞懸濁液を2 mLのPBSバッファーで洗浄し、300 x g で室温で10分間遠心分離し、500 μLのPBSバッファーを細胞に加え、完全に再懸濁します。
  4. 500 μLの予冷PBSバッファーをカラムにピペットで入れて洗浄し、磁気スタンドを使用して磁場に入れます。
  5. カラムに置いた細胞を500 μLのPBSバッファーで2回洗浄し、10%FBSを添加したIscove培地でCD45陰性細胞を含むフロースルーを回収します。
  6. 計数チャンバーを使用して、再プログラムされたセルの数を決定します。

4.ヒト肝細胞作製のためのガラスカバーガラスの作製

  1. ガラスカバーガラス(14 mm)を分離し、非イオン性洗剤で10分間インキュベートします。ガラスカバーガラスを脱イオン水で泡がなくなるまで洗浄し、1M HClで30分間インキュベートします(Marchenkoら14から採用)。
  2. ガラスカバーガラスを脱イオン水で少なくとも3倍洗浄し、室温で一晩乾燥させます。適切な容器に乾燥したガラスカバーガラスをオートクレーブします。

5. BD-PSCの2次元肝分化のためのバイオラミニンによる細胞培養プレートのコーティング

  1. オートクレーブ滅菌したガラスカバーガラスカバースリップを無菌ピンセットで4ウェルプレートに入れ、UVライトを30分間オンにして無菌状態を確保します。
  2. バイオラミニンのアリコートを解凍し、各ガラスカバースリップに120 μLの5 μg/mLバイオラミニンを加えます。コーティングされたガラスカバーガラスを4°Cで一晩放置します。
  3. 過剰のバイオラミニンを除去し、下記のように200 μLの肝細胞分化培地を加えます。

6. 肝細胞分化培地の調製

  1. 76.4%ノックアウトDMEM(KO-DMEM)、20%KSR、0.5%L-グルタミン、1%非必須アミノ酸(NEAA)、0.1%β-メルカプトエタノール、1%DMSO、および1%ペニシリン-ストレプトマイシン(Pen/Strep)からなる500mLの肝芽細胞ノックアウト血清置換(KSR)/ジメチルスルホキシド(DMSO)培地を作ります。
  2. 1%のL-グルタミン、10 μMのヒドロコルチゾン21-ヘミコハク酸ナトリウム塩(HCC)、および1%のPen/Strepを含む500 mLの肝細胞成熟培地を準備します。
  3. ストックから培地を分注し、培地交換ごとに最終濃度10 ng/mLおよび/または20 ng/mLで新鮮な肝細胞成長因子(HGF)およびオンコスタチンM(OSM)を追加します。
    注:オンコスタチンMは、サイトカインのインターロイキン6グループに属するサイトカインであり、造血および肝臓の発達に重要です。

7. BD-PSCから分化した肝細胞の培養

  1. 3 x 105 BD-PSCS細胞を、バイオラミニンでコーティングした4ウェルプレートの各ウェルに入れます。
  2. 4ウェルプレートを37°C、5%CO2のインキュベーターに入れる。内胚葉分化をサポートするKSR/DMSO肝芽細胞培地で細胞を5日間培養し、2日ごとに培地を交換します。
  3. 5日目に肝細胞成熟培地に切り替え、37°Cおよび5%CO2のインキュベーター内でさらに7〜10日間細胞を培養します。48時間ごとに培地を交換してください。

8.3Dスフェロイド肝分化

  1. 計数チャンバーを使用して細胞をカウントします。
  2. BD脱分化細胞懸濁液を300 x g で室温で10分間遠心分離します。上清を除去し、脱分化したBD細胞をKSR/DMSO培地に2 x 106 細胞/mLで再懸濁します。
  3. 細胞を40 μmのセルストレーナーに通して、単一細胞の懸濁液を確保し、追加の破片を取り除きます。
  4. 計数チャンバーを使用して細胞をカウントし、ウェルあたりに必要な量を分注するために、各細胞播種密度に対して十分な容量を準備します。1 x 106 セルのトップシードで4000セルの低いシード密度までのグラデーションを準備します。
  5. 100 μLのKSR/DMSO培地を96ウェルローアタッチメントプレートに分注し、100 μLの細胞播種希釈液を加えます。
  6. 低アタッチメントプレートを37°C、5%CO2 のインキュベーターに入れ、5日間培養します。
  7. スフェロイドが十分にコンパクトになったら播種後3〜4日目から培地の50%を交換する。
  8. 5日目に、培地を肝細胞成熟培地に変更し、細胞をさらに7〜10日間培養してさらに成熟させます。2日ごとに培地を交換してください。

9. 新たに作製した2D肝細胞培養物の免疫蛍光解析

  1. 上記の分化方法に従って細胞を4、8、15、および24日間培養し、培地を除去します。
  2. 4%パラホルムアルデヒドからなる予め温めた固定液で細胞をPBS中で10分間インキュベートします。固定液を廃棄し、細胞をPBSでそれぞれ5分間2回洗浄する。直ちに0.1%トリトンX-100溶液を加え、細胞を5分間透過処理する。PBSで2回洗浄します。
  3. PBSと5%BSA製のブロッキング溶液を加え、ロッカープレートに室温で1時間置きます。
  4. 一次抗体を希釈バッファー1%BSA/PBSで希釈します:アルブミン(ALB)1:50、α-1フェトプロテイン(AFP)1:250、サイトケラチン18(CK18)1:50、肝細胞核因子4アルファ(HNF4α)1:1000およびトランスサイレチン(TTR)1:50。ウェルあたり50 μLの抗体希釈液を使用します。
  5. 細胞を室温で1時間インキュベートする。その後、抗体溶液を捨て、細胞を5分間洗浄し、洗浄工程を3回繰り返す。
  6. 以下の二次抗体を希釈バッファー中で調製します:ウサギ抗ニワトリIgG(テキサスレッド)1:1000、ヤギ抗マウスIgG(488)1:1000、およびヤギ抗ウサギ(488)1:500。ウェルあたり50 μLの抗体希釈液を使用し、室温で30分間細胞をインキュベートします。
  7. 細胞をPBSでそれぞれ5分間3回洗浄し、顕微鏡分析のためにDAPIを含む封入剤でカバーガラスをマウントします。

10.新しく形成された肝スフェロイドの生染色

  1. スフェロイドに触れずに培養液を慎重に廃棄し、作りたてのPBSに0.1%トリトンX-100溶液を加え、5分間インキュベートして細胞を透過処理します。
  2. スフェロイドを培地でゆっくりと5分間ピペッティングして洗浄し、2回繰り返します。
  3. PBSで調製した一次抗体ALB(1:50)、AFP(1:250)、CK18(1:50)、CYP2E1(1:200)、およびCYP3A4(1:200)をPBSで調製したスフェロイドを1%BSAとともに、37°Cの5%CO2 インキュベーターで1時間インキュベートします。 ウェルあたり50 μLの抗体希釈液を使用します。
  4. 余分な抗体溶液を慎重に除去し、スフェロイドを培地で3回洗浄します。
  5. 対応する二次抗体ヤギ抗マウスIgG(Cy3)、ヤギ抗マウスIgG(488)、およびウサギ抗ニワトリIgG(テキサスレッド)を1%BSA中のPBS中の1:1000および1:500の希釈で調製します。ウェルあたり50 μLの抗体希釈液を使用し、インキュベーター内で37°C、5%CO2で20分間インキュベートします。
  6. 培地で3回注意深く洗浄し、蛍光顕微鏡検査を行う前に、プレートを37°Cおよび5%CO2 のインキュベーター内に30分間放置します。

11. 蛍光顕微鏡によるスフェロイドの検査

  1. 使用の10分前に蛍光光源の電源を入れ、コンピューターの電源を入れてイメージングソフトウェアを開きます。
  2. 倍率4倍の対物レンズを使用し、ツールバーの ボタン4倍 をクリックして正しいスケールバーを選択し、96ウェルプレートをステージセンタープレートに配置します。
  3. LED光源をオンにし、明視野フィルターを使用し、x-y軸ステージ調整ノブを使用してプレートを目的のウェルに配置します。
  4. カメラの光路に変更し、イメージングソフトウェアの ライブ ボタンをクリックして画面上の画像を視覚化し、X-Y軸ノブを使用して回転楕円体が中央に配置され、粗い/細かいフォーカスノブを使用してフォーカスされていることを確認します。
    注:スフェロイドの形状は、ライブ染色を適用した後も一定のままです。
  5. ツールバーで 明視野観察 方法を選択し、露出設定を自動にして、カメラのコントロールパネルの[ スナップショット ]ボタンをクリックして写真を撮ります。次に、目的のフォルダーに適切な名前を使用して、画像を .vsi ファイルとして保存します。
  6. 周囲遮光板を配置してLEDライトを消灯し、B励起のフィルターに変更し、ツールバーで 488観察 方法を選択し、シャッターを開き、ボタンをクリックして写真を撮ります スナップショット、シャッターを閉じてから、上記のようにファイルを保存します。
  7. 適切な観察方法(テキサスレッドまたはCY3)を使用して、G励起のフィルターでこれを繰り返します。次に、目的の各ウェルについて手順全体を繰り返します。
  8. プレートを37°Cの5%CO2 インキュベーターに戻し、上記のように培養する。

結果

ヒトBD-PSCを2段階のプロトコルを適用することにより、内胚葉/肝前駆細胞および肝細胞への分化に成功しました。肝分化過程における形態学的変化を 図1に示す。BD-PSCは、3つの異なる段階を経る肝細胞に分化します。第1段階は、内胚葉細胞L4への分化を表し、第2段階は、肝前駆細胞(肝芽細胞)L8への分化は、典型的な多角形の形態を呈し、第3段階は、肝細胞L15-L24への成?...

ディスカッション

肝臓は、代謝産物の解毒など、多くの重要な生物学的機能を備えた人体の主要な器官です。肝硬変やウイルス性肝炎などの重度の肝不全により、世界中で年間200万人近くが死亡しています。肝移植は世界の固形臓器移植で2番目にランクされていますが、現在のニーズの約10%しか満たされていません22。

初代ヒト肝細胞(PHH)は、肝毒性の研究によく使用さ...

開示事項

対応する著者は、彼女が新規ヒトGPI結合タンパク質に関連する特許権者であることを宣言します。彼女はACA CELL Biotech GmbHを共同設立し、協力しています。他の著者は、利益相反はないと宣言しています。

謝辞

著者は、OksanaとJohn Greenacreによって提供された技術支援に特に感謝しています。この研究は、ドイツのハイデルベルクのACA CELL Biotech GmbHによってサポートされました。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
Albumin antibodySigma-AldrichSAB3500217produced in chicken
Albumin Fraction VCarl Roth GmbH+Co. KGT8444.4
Alpha-1 FetoproteinProteintech Germany GmbH14550-1-APrabbit polyclonal IgG
Biolaminin 111 LNBioLamina LN111-02human recombinant
CD45 MicroBeadsMiltenyi130-045-801nano-sized magnetic beads
Cell StrainerpluriSelect43-10040-40
CellSens Olympusimaging software
Centrifuge tubes 50 mL Greiner Bio-One210270
CEROplate 96 wellOLS OMNI Life Science2800-109-96
CKX53 Olympus
Commercially available detergentProcter & Gamblenonionic detergent
CYP2E1-specific antibodyProteintech Germany GmbH19937-1-APrabbit polyclonal antibody IgG
CYP3A4 Proteintech Germany GmbH67110-1-lgmouse monoclonal antibody IgG1
Cytokeratin 18DakoCytomationM7010mouse monoclonal antibody IgG1
DMSOSigma-AldrichD8418-50ML
DPBSThermo Fisher Scientific14040091
FBSMerck MilliporeS0115/1030BDiscontinued. Available under: TMS-013-B
Glass cover slips 14 mmR. Langenbrinck01-0014/1
GlutaMax 100x GibcoThermo Fisher Scientific35050038L-glutamine
Glutaraldehyde 25%Sigma-AldrichG588.2-50ML
Goat anti-mouse IgG Cy3Antibodies onlineABIN1673767polyclonal
Goat anti-mouse IgG DyLight 488Antibodies onlineABIN1889284polyclonal
Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 488Life TechnologiesA-11008
HClSigma-Aldrich30721-1LGL
HepatoZYME-SFM Thermo Fisher Scientific17705021hepatocyte maturation medium
HGFThermo Fisher ScientificPHG0324human recombinant
HNF4α antibodySigma-AldrichZRB1457-25ULclone 4C19 ZooMAb Rbmono
Hydrocortisone 21-hemisuccinate (sodium salt)BiomolCay18226-100
Knock out Serum Replacement - Multi Species GibcoFisher ScientificA3181501KSR
KnockOut DMEM/F-12Thermo Fisher Scientific12660012Discontinued. Available under Catalog No. 10-828-010
MACS BufferMiltenyi130-091-221
MACS MultiStandMiltenyi130-042-303magnetic stand
MEM NEAA 100x GibcoThermo Fisher Scientific11140035
MercaptoethanolThermo Fisher Scientific3135001050mM
MiniMACS columnsMiltenyi130-042-201
Nunclon MultidishesSigma-AldrichD67894 well plates
Oncostatin MThermo Fisher ScientificPHC5015human recombinant
ParaformaldehydeSigma-Aldrich158127
PBS sterileCarl Roth GmbH+Co. KG9143.2
Penicillin/StreptomycinBiochrom GmbHA221310000 U/ml
PS 15ml tubes sterileGreiner Bio-One188171
Rabbit anti-chicken IgG Texas redAntibodies onlineABIN637943
Roti Cell Iscoves MDMCarl Roth GmbH+Co. KG9033.1
Roti Mount FluorCare DAPICarl Roth GmbH+Co. KGHP20.1
Roti Sep 1077 humanCarl Roth GmbH+Co. KG0642.2
Transthyretin antibody Sigma-AldrichSAB3500378produced in chicken
Triton X-100Thermo Fisher ScientificHFH101%

参考文献

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