نموذج الاستئصال القمي في قلب Xenopus tropicalis البالغ

Summary

Xenopus tropicalis هو نموذج مثالي للبحث التجديدي حيث تمتلك العديد من أعضائه قدرة تجددية ملحوظة. هنا ، نقدم طريقة لبناء نموذج إصابة القلب في X. tropicalis عبر استئصال القمة.

Abstract

من المعروف أنه في الثدييات البالغة ، فقد القلب قدرته على التجدد ، مما يجعل قصور القلب أحد الأسباب الرئيسية للوفاة في جميع أنحاء العالم. أظهرت الأبحاث السابقة القدرة التجديدية لقلب Xenopus tropicalis البالغ ، وهو برمائيات أنوران ذات جينوم ثنائي الصيغة الصبغية وعلاقة تطورية وثيقة مع الثدييات. بالإضافة إلى ذلك ، أظهرت الدراسات أنه بعد استئصال قمة البطين ، يمكن للقلب أن يتجدد دون تندب في X. tropicalis. وبالتالي ، تشير هذه النتائج السابقة إلى أن X. tropicalis هو نموذج فقاري بديل مناسب لدراسة تجديد قلب البالغين. يتم تقديم نموذج جراحي لتجديد القلب في البالغين X. tropicalis هنا. لفترة وجيزة ، تم تخدير الضفادع وإصلاحها. ثم ، تم إجراء شق صغير باستخدام مقص استئصال القزحية ، واختراق الجلد والتامور. تم تطبيق ضغط لطيف على البطين ، ثم تم قطع قمة البطين بالمقص. تم تأكيد إصابة القلب والتجديد عن طريق الأنسجة في 7-30 يوما بعد الاستئصال (dpr). أنشأ هذا البروتوكول نموذج استئصال قمي في البالغين X. tropicalis ، والذي يمكن استخدامه لتوضيح آليات تجديد قلب البالغين.

Introduction

كان قصور القلب سببا رئيسيا للوفيات في جميع أنحاء العالم في السنوات الأخيرة. منذ عام 2000 ، تزايد عدد الوفيات الناجمة عن قصور القلب بمرور الوقت. توفي أكثر من 9 ملايين شخص بسبب اعتلال عضلة القلب في عام 2019 ، وهو ما يمثل 16٪ من إجمالي عدد الوفيات على مستوى^{العالم 1}. بسبب فقدان القدرة التجديدية للقلب في الثدييات البالغة ، في بعض الحالات ، لا يوجد ما يكفي من خلايا عضلة القلب للحفاظ على وظائف الانقباض في القلب ، مما يؤثر على وظائف القلب ويساهم في إعادة تشكيل البطين غير الطبيعي وفشل القلب²،^3،4. في الواقع ، في الثدييات ، يتمتع القلب بأفقر قدرة على التجدد مقارنة بالأعضاء الأخرى ، مثل الكبد والرئتين والأمعاء والمثانة والعظام والجلد. نظرا لأن شيخوخة سكان العالم أصبحت اتجاها عالميا كبيرا ، فإن التحديات التي نواجهها مع أمراض القلب ستزداد حدة⁵.

قد يكون لتوضيح آليات تجديد القلب آثار كبيرة على علاجات أمراض القلب الإقفارية. كشفت التقارير أن قلوب الفئران حديثي الولادة لديها قدرة على التجدد بعد استئصال القمة⁶. ومع ذلك ، يتم فقدان هذه القدرة على التجدد بعد 7 أيام من سن⁷. أظهرت الدراسات أن قلوب الثدييات البالغة غير قادرة على التجدد لأن قدرتها على تكاثر خلايا عضلة القلب قد تضاءلت ^8,9. ومع ذلك ، فإن قلوب الفقاريات السفلية تمتلك قدرة تجددية قوية بعد الإصابة. على سبيل المثال ، الزرد¹⁰ ، X. tropicalis¹¹ ، Xenopus laevis 12 ، newt¹³ ، و axolotl¹⁴ قادرون على التجدد الكامل بعد استئصال القمة. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أن تخضع الأجزاء الأخرى من أجسام بعض الفقاريات السفلية أيضا للتجديد الكامل ، مثل أطراف النوتات وذيول وعدسات وأذرع الضفادع الاستوائية ذات المخالب⁴،^15،16.

يعد إنشاء نماذج لإصابات القلب الخطوة الأولى لتوضيح الآليات الكامنة وراء تجديد القلب وله أهمية كبيرة في البحث التجديدي. طور الباحثون طرقا مختلفة لبناء نماذج إصابات القلب ، بما في ذلك الطعن ، والكدمات ، والاستئصال الجيني ، والإصابة بالتبريد ، والاحتشاء ^5,6.

تستخدم الإصابة بالتبريد واحتشاء عضلة القلب (MI) واستئصال القمة على نطاق واسع لإحداث إصابة قلبية ، وقد يكون لنوع الإصابة تأثيرات كبيرة على التجديد التالي لخلايا عضلة القلب⁶. اعتمادا على التقنية الجراحية ، يمكن أن تختلف استجابة القلب للتجديد. تسبب الإصابة بالتبريد موتا هائلا للخلايا وتنتج ندوبا ليفية في قلوب الزرد¹⁷ ، مما يخلق نموذجا يشبه احتشاء الثدييات. يتم إجراء الاستئصال القمي عن طريق قطع جزء من أنسجة البطين ، وهو ما تم في الزرد¹⁰ و X. tropicalis¹¹ ، دون التسبب في ندوب دائمة. أجرت هذه الدراسة الاستئصال القمي ، وهي عملية أبسط وتتطلب أدوات جراحية أقل من الإصابة بالتبريد. باستخدام تحليل تتبع النسب ، أظهرت دراسة سابقة أن تجديد القلب مرتبط بتكاثر خلايا عضلة القلب الموجودة مسبقا في قلوب الفأر⁶ وسمك الزرد¹⁸ ، ولكن لا توجد تقارير عن البرمائيات. ومن ثم ، فإن نموذج استئصال القمة في X. tropicalis يلعب دورا مهما في توضيح الآليات الكامنة وراء الاستجابات التجديدية.

Protocol

تمت الموافقة على جميع البروتوكولات التجريبية المتعلقة ب X. tropicalis من قبل لجنة رعاية الحيوان بجامعة جينان.

1. الجراحة

1. التحضير قبل الجراحة: احتفظ بمقص العيون الجاهز ، ملقط العيون ، ملقط الإبرة ، الكرات الماصة ، ورق الترشيح ، والخيوط الجراحية / الإبر لاستئصال القمة في قلوب X. tropicalis. ارجع إلى جدول المواد للحصول على معلومات مفصلة. قبل الاستخدام ، قم بتعقيم جميع الأدوات الجراحية عن طريق التعقيم ، وقم بإعداد كمية كافية من الثلج للاستخدام في المستقبل.
2. تخدير شخص بالغ من X. tropicalis باستخدام التريكائين عن طريق وضعه في 500 مل من محلول التريكائين (1 مجم / مل) في درجة حرارة الغرفة لمدة 4 دقائق¹⁹ ، ثم وضعه على سطح من الثلج على طاولة العمليات لضمان عدم استيقاظ الضفدع أثناء عملية التشغيل.
   تنبيه: الإجراء بأكمله يتطلب 5-10 دقائق. يجب ألا يكون وقت التخدير طويلا جدا ، وإلا فقد لا يتمكن X. tropicalis من الاستيقاظ بعد العملية.
3. بضع الصدر
   1. ضع البطن X. tropicalis المخدر ، وقم بتغطية بطن الضفدع بشاش منقوع مسبقا في الماء المقطر لتجنب جفاف جلد الحيوان أثناء العملية.
   2. اضغط برفق على الصدر بالملقط ، وابحث عن مركز الصدر بالتوازي مع الطرف الأمامي السفلي ، وارفع الجلد بمقص العيون ، وقم بعمل شق صغير برفق ~ 1 سم. باستخدام مقص العيون ، التقط طبقة العضلات تحت الجلد ، وخلق جرح في عضلة الصدر المركزية. نظرا لأن القلب يقع في الموضع العلوي من موقع الجرح ، اضغط برفق على الصدر باستخدام ملقط العيون للضغط على القلب من الجرح.
      تنبيه: نظرا لأن جلد X. tropicalis يمكن أن ينتج الببتيدات المضادة للميكروبات ، فمن غير الضروري استخدام إجراءات التطهير التقليدية في الموقع الجراحي ل X. tropicalis. أي مطهر سوف يضر جلد X. tropicalis.
4. استئصال قمة البطين
   1. قم بتثبيت التامور برفق بالملقط ، وكسره برفق باستخدام مقص العيون بالقرب من قمة القلب. انتظر حتى ينفجر التامور بسبب ضخ الدم الانقباضي (الشكل 1 أ ، ب).
   2. امسك طرف القلب بالملقط في اليد غير المهيمنة ، وارفع القلب قليلا وفقا لإيقاع انقباض القلب. عندما ينقبض القلب لإعادة تدوير الدم عبر الأوعية الدموية ، قم بقطع قمة القلب بسرعة (~ 14٪ من البطين) (الشكل 1C).
   3. للتأكد من أن كمية استئصال القمة تبلغ حوالي 14٪ من القلب كله ، قم بتحليل وزن القلب (HW) ومساحة السطح مع أو بدون استئصال²⁰. ضع القلب في الصدر باستخدام ملقط وكرة ماصة.
      ملاحظة: لا تضغط على القلب مباشرة بالملقط; خلاف ذلك ، سيتم ثقب أجزاء أخرى من القلب.
5. خياطة الجلد بخيط جراحي غير ماص 4-0 غير ماص (الشكل 1 د). احرص على تجنب الخياطة في طبقة العضلات لمنع الوفيات بعد العملية الجراحية. انتظر حتى يشفى جرح الجلد بشكل طبيعي في غضون 1 أسبوع بعد الجراحة.
6. في مجموعة العمليات الوهمية ، قم بإجراء بضع الصدر ، وافتح التامور ، والخياطة ، دون إجراء استئصال القمة.

2. الانتعاش الجراحي

1. ضع X. tropicalis بعد العملية الجراحية مع توجيه بطنه لأعلى في طبق بتري يحتوي على كمية صغيرة من الماء منزوع الأيونات (لا تغمر الحيوان تماما). انتظر حتى يستيقظ X. tropicalis في غضون ~ 10 دقائق.
2. عند استعادة الوعي ، لاحظ حركة الحيوان ونشاطه ، وكذلك خياطة الجرح أثناء النشاط. نقل الضفادع التي استعادت توازنها إلى وعاء مملوء بالماء النقي للزراعة. استبدل الماء بالماء النقي كل يوم لتجنب عدوى الجرح.
   ملاحظة: مع هذه التدابير ، يمكن أن يصل معدل البقاء على قيد الحياة ~ 90٪. يؤدي كل من التخدير المطول والنزيف المفرط أثناء الجراحة إلى الوفاة ، والتي تحدث عادة في يوم الجراحة.

3. الكشف عن حالة الإصلاح بعد إصابة القلب

1. اجمع قلوب X. tropicalis في نقاط زمنية متعددة بعد الجراحة.
   1. بعد تخدير X. tropicalis باستخدام التريكايين ، افتح البطن ، واستخدم ملقط لإزالة الأعضاء والأنسجة الداخلية الأخرى للعثور على موقع القلب.
      ملاحظة: بسبب استئصال القمة ، من المرجح أن يتطور القلب جنبا إلى جنب مع الأنسجة والأعضاء الأخرى أثناء عملية الإصلاح. في بعض الأحيان ، يلتصق بجدار العضلات وليس من السهل فصله ، لذلك يجب التعامل معه بعناية أثناء التجميع.
   2. بعد العثور على القلب ، استخدم الملقط لتمزيق الأعضاء الأخرى من القلب برفق. قشر الأنسجة الأخرى المحيطة بالقلب برفق لكشف القلب. استخدم الملقط لرفع القلب برفق ، واقطعه باستخدام المقص. ضع القلب على الفور في برنامج تلفزيوني لإزالة أي دم متبقي ، وقم بتصويره باستخدام مجسمة للتوثيق (الشكل 2).
2. الجفاف المتدرج
   1. امسح القلوب بورق الترشيح لتجفيف بقايا PBS الزائدة ، وضعها في طبق زراعة الخلايا المكون من 24 بئرا. استخدم 1-2 مل من 4٪ بارافورمالدهيد لإصلاح أنسجة القلب بين عشية وضحاها. في اليوم التالي ، قم بإجراء تجفيف الإيثانول. أولا ، استخدم 70٪ إيثانول بين عشية وضحاها ، متبوعا ب 80٪ إيثانول و 90٪ إيثانول و 100٪ إيثانول للجفاف المتدرج (1 ساعة في كل مرة). كرر استخدام الإيثانول 100 ٪ ثلاث مرات.
3. تضمين البارافين
   1. عالج أنسجة القلب المجففة بالزيلين لمدة 6-8 دقائق. ضع الأنسجة المعالجة بالزيلين في وعاء زجاجي مملوء بشمع البارافين على حرارة 65 درجة مئوية لمدة 2-3 ساعات.
      ملاحظة: من الضروري تجنب فقاعات الهواء لأنها تؤثر على القسم أثناء عملية التضمين.
4. قم بتجميد الأنسجة المضمنة عند -20 درجة مئوية لمدة 1 ساعة ، وقم بتقسيمها.
5. بعد تقسيم القلب ، قم بإجراء تقنيات تلطيخ الهيماتوكسيلين والإيوزين (H&E) القياسية وماسون في الأقسام¹¹.

النتائج

تم جمع القلوب عند 0 dpr و 7 dpr و 14 dpr و 30 dpr. كشف التحليل المورفولوجي أن الجلطة الدموية الناجمة عن إصابة القلب اختفت عند 30 DPR (الشكل 2). في الوقت نفسه ، كان مظهر القلوب عند 30 DPR في مجموعة الاستئصال مشابها لظهور القلوب في مجموعة العمليات الوهمية. لم تكن هناك جروح واضحة (الشك...

Discussion

تم وصف الاستئصال القمي ، الذي ينطوي على البتر الجراحي لقمة القلب ، في الزرد والفئران^6،18. ومع ذلك ، لم يتم وصف هذا في X. tropicalis. يصف هذا التقرير نموذجا موثوقا به لإصابة القلب ويوضح أن قلب X. tropicalis البالغ يمكن أن يتجدد بالكامل بعد الاستئصال القمي دون تندب...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetic acid	GHTECH	64-19-7-500ml
Acid Alcohol Fast Differentiation Solution	Beyotime	C0163M
Acid Fuchsin	aladdin	A104916
Alcohol Soluble Eosin Y Stainin Solution	Servicebio	G1001-500ML
BioReagent	Beyotime	ST2600-100g
Ethanol absolute	Guangzhou Chemical Reagent Factory	HB15-GR-0.5L
Hematoxylin Stain Solution	Servicebio	G1004-500ML
Neutral balsam	Solarbio	G8590
Operating Scissors	Prosperich	HC-JZ-YK-Z-10cm
Paraffins	Leica	39601095
Para-formaldehyde Fixative	Servicebio	G1101-500ML
Phosphate Buffered Saline (PBS) powder	Servicebio	G0002-2L
Phosphomolybdic acid hydrate	Macklin	P815551
Stereo microscope	Leica
surgical forceps	ChangZhou	zfq-11-btjw
Surgical Suture	HUAYON	18-5140
Tricaine	Macklin
Xylene	Guangzhou Chemical Reagent Factory	IC02-AR-0.5L