Yetişkin Xenopus tropicalis Kalbinde Apikal Rezeksiyon Modeli

Özet

Xenopus tropicalis, organlarının çoğu dikkate değer bir rejeneratif kapasiteye sahip olduğu için rejeneratif araştırmalar için ideal bir modeldir. Burada, X. tropicalis'te apeks rezeksiyonu yoluyla bir kalp hasarı modeli oluşturmak için bir yöntem sunuyoruz.

Özet

Yetişkin memelilerde, kalbin rejeneratif kapasitesini kaybettiği ve kalp yetmezliğini dünya çapında önde gelen ölüm nedenlerinden biri haline getirdiği bilinmektedir. Önceki araştırmalar, diploid genoma sahip bir anuran amfibi olan yetişkin Xenopus tropicalis'in kalbinin rejeneratif yeteneğini ve memelilerle yakın bir evrimsel ilişkiyi göstermiştir. Ek olarak, çalışmalar ventriküler apeks rezeksiyonunu takiben, X. tropicalis'te kalbin skar olmadan yenilenebileceğini göstermiştir. Sonuç olarak, bu önceki sonuçlar X. tropicalis'in yetişkin kalp rejenerasyonu çalışması için uygun bir alternatif omurgalı modeli olduğunu göstermektedir. Burada erişkin X. tropicalis'te kardiyak rejenerasyonun cerrahi bir modeli sunulmaktadır. Kısaca, kurbağalar uyuşturuldu ve sabitlendi; Daha sonra iridektomi makası ile cilde ve perikarda nüfuz eden küçük bir kesi yapıldı. Ventriküle hafif basınç uygulandı ve ventrikülün tepesi makasla kesildi. Kardiyak hasar ve rejenerasyon rezeksiyon (dpr) sonrası 7-30 gün sonra histoloji ile doğrulandı. Bu protokol , yetişkin X. tropicalis'te yetişkin kalp rejenerasyonunun mekanizmalarını aydınlatmak için kullanılabilecek apikal bir rezeksiyon modeli oluşturmuştur.

Giriş

Kalp yetmezliği son yıllarda dünya çapında mortalitenin önde gelen nedenlerinden biri olmuştur. 2000 yılından bu yana, kalp yetmezliğine bağlı ölümlerin sayısı zamanla artmaktadır. 2019 yılında 9 milyondan fazla insan kardiyomiyopatiden öldü ve bu da küresel olarak toplam ölüm sayısının% 16'sını oluşturdu¹. Yetişkin memelilerde kalbin rejeneratif kapasitesinin kaybı nedeniyle, bazı durumlarda, kalpteki kasılma fonksiyonlarını korumak için yeterli kardiyomiyosit yoktur, bu da kalp fonksiyonunu etkiler ve anormal ventrikül yeniden şekillenmesine ve kalp yetmezliğine katkıda bulunur ^2,3,4. Gerçekten de, memelilerde, kalp, karaciğer, akciğerler, bağırsaklar, mesane, kemik ve cilt gibi diğer organlara kıyasla en zayıf rejeneratif kapasiteye sahiptir. Dünya nüfusunun yaşlanması küresel bir megatrend haline geldikçe, kalp hastalığı ile karşı karşıya kaldığımız zorluklar yoğunlaşacaktır⁵.

Kardiyak rejenerasyon mekanizmalarının aydınlatılması, iskemik kalp hastalığının tedavileri için önemli etkilere sahip olabilir. Raporlar, yenidoğan farelerin kalplerinin apeks rezeksiyon⁶ sonrası rejeneratif kapasiteye sahip olduğunu ortaya koymuştur. Bununla birlikte, bu rejeneratif kapasite^{7 günlük 7} yaşından sonra kaybolur. Çalışmalar, yetişkin memeli kalplerinin yenilenemediğini, çünkü kardiyomiyosit proliferasyonu kapasitelerinin ^8,9 azaldığını göstermiştir. Bununla birlikte, alt omurgalıların kalpleri yaralanma sonrası güçlü bir rejeneratif kapasiteye sahiptir. Örneğin, zebra balığı 10, X. tropicalis¹¹, Xenopus laevis¹², newt 13 ve axolotl¹⁴, apeks rezeksiyonundan sonra tam rejenerasyon yeteneğine sahiptir. Ek olarak, bazı alt omurgalıların vücutlarının diğer kısımları da, yenilerin uzuvları ve tropikal pençeli kurbağaların kuyrukları, lensleri ve kolları gibi tam bir yenilenme geçirebilir 4,15,16.

Kardiyak hasar modellerinin oluşturulması, kardiyak rejenerasyonun altında yatan mekanizmaların aydınlatılmasında ilk adımdır ve rejeneratif araştırmalarda büyük öneme sahiptir. Araştırmacılar, bıçaklama, kontüzyon, genetik ablasyon, kriyoyaralanma ve enfarktüs dahil olmak üzere kardiyak yaralanma modelleri oluşturmak için çeşitli yöntemler geliştirmişlerdir ^5,6.

Kriyoyaralanma, miyokard enfarktüsü (MI) ve apeks rezeksiyonu kardiyak hasarı indüklemek için yaygın olarak kullanılmaktadır ve yaralanma tipinin kardiyomiyositlerin aşağıdaki rejenerasyonu üzerinde önemli etkileri olabilir⁶. Cerrahi tekniğe bağlı olarak, kalbin yenilenmeye cevabı değişebilir. Kriyoyaralanma büyük hücre ölümüne neden olur ve zebra balığı^17'nin kalbinde fibrotik izler üretir, böylece memeli enfarktüsüne benzeyen bir model oluşturur. Apikal rezeksiyon, zebra balığı 10 ve X. tropicalis^11'de yapılan ventrikül dokularının bir kısmının kalıcı izlere neden olmadan kesilmesiyle gerçekleştirilir. Bu çalışmada daha basit bir operasyon olan ve kriyoyaralanmaya göre daha az cerrahi alet gerektiren apikal rezeksiyon uygulandı. Soy izleme analizini kullanarak, önceki bir çalışma, kardiyak rejenerasyonun, fare⁶ ve zebra balığı^18'in kalplerinde önceden var olan kardiyomiyositlerin çoğalmasıyla ilişkili olduğunu, ancak amfibiler için hiçbir rapor bulunmadığını göstermiştir. Bu nedenle, X. tropicalis'teki apeks rezeksiyon modeli, rejeneratif yanıtların altında yatan mekanizmaların aydınlatılmasında önemli bir rol oynamaktadır.

Protokol

X. tropicalis ile ilgili tüm deneysel protokoller Jinan Üniversitesi Hayvan Bakım Komitesi tarafından onaylanmıştır.

1. Ameliyat

1. Preoperatif hazırlık: X. tropicalis'in kalbinde apeks rezeksiyonu için oftalmik makas, oftalmik forseps, iğne forseps, emici toplar, filtre kağıdı ve cerrahi dikişler/iğneler hazır bulundurun. Ayrıntılı bilgi için Malzeme Tablosuna bakın. Kullanmadan önce, tüm cerrahi aletleri otoklavlayarak sterilize edin ve gelecekte kullanmak üzere yeterli miktarda buz hazırlayın.
2. Yetişkin bir X. tropicalis'i 4 dakika¹⁹ boyunca oda sıcaklığında 500 mL trikain çözeltisine (1 mg / mL) yerleştirerek trikain ile uyuşturun ve daha sonra kurbağanın ameliyat işlemi sırasında uyanmamasını sağlamak için ameliyat masasındaki bir buz yüzeyine koyun.
   DİKKAT: Tüm prosedür 5-10 dakika gerektirir; anestezi süresi çok uzun olmamalıdır, aksi takdirde X. tropicalis ameliyattan sonra uyanamayabilir.
3. Torakotomi
   1. Anestezi uygulanan X. tropicalis karnını yukarı yerleştirin ve operasyon sırasında hayvanın derisinin kurumasını önlemek için kurbağanın karnını damıtılmış suya batırılmış gazlı bezle örtün.
   2. Göğsünü forseps ile hafifçe bastırın, göğsün merkezini alt ön ayağa paralel olarak bulun, cildi oftalmik makasla kaldırın ve yavaşça ~ 1 cm'lik küçük bir kesi yapın. Oftalmik makas kullanarak, cildin altındaki kas tabakasını toplayın ve merkezi göğüs kasında bir yara oluşturun. Kalp, yara bölgesinin üst pozisyonunda bulunduğundan, kalbi yaradan sıkmak için göğsüne oftalmik forseps ile hafifçe bastırın.
      DİKKAT: X. tropicalis'in derisi antimikrobiyal peptitler üretebildiğinden, X. tropicalis'in cerrahi bölgesinde geleneksel dezenfeksiyon prosedürlerinin uygulanması gereksizdir. Herhangi bir dezenfektan X. tropicalis'in cildine zarar verecektir.
4. Ventriküler apeks rezeksiyonu
   1. Perikardın forseps ile hafifçe kelepçelenmesi ve kalbin tepesine yakın oftalmik makas kullanarak hafifçe kırılması. Sistolik kan pompalaması nedeniyle perikardın çıkmasını bekleyin (Şekil 1A, B).
   2. Baskın olmayan elde forseps ile kalbin ucunu tutun ve kalp kasılma ritmine göre kalbi hafifçe kaldırın. Kalp, kan damarları boyunca kan dolaşımını sağlamak için kasıldığında, kalbin tepesini (ventrikülün ~% 14'ü) hızla kesin (Şekil 1C).
   3. Apeks rezeksiyon miktarının tüm kalbin yaklaşık% 14'ü olduğundan emin olmak için, rezeksiyon²⁰ ile veya rezeksiyon olmadan kalp ağırlığını (HW) ve yüzey alanını analiz edin. Forseps ve emici bir top kullanarak kalbi göğsüne yerleştirin.
      NOT: Kalbe doğrudan forseps ile bastırmayın; Aksi takdirde, kalbin diğer kısımları delinecektir.
5. Cildi 4-0 emici olmayan ipek olmayan cerrahi iplik sütürü ile dikin (Şekil 1D). Postoperatif mortaliteyi önlemek için kas tabakasına dikiş atılmamasına dikkat edin. Ameliyattan sonraki 1 hafta içinde cilt yarasının doğal olarak iyileşmesini bekleyin.
6. Sahte operasyon grubunda, tepe rezeksiyonu yapmadan torakotomi yapın, perikardı açın ve dikiş atın.

2. Cerrahi iyileşme

1. Postoperatif X. tropicalis'i karnı yukarı bakacak şekilde az miktarda deiyonize su içeren bir Petri kabına yerleştirin (hayvanı tamamen su basmayın). X. tropicalis'in ~ 10 dakika içinde uyanmasını bekleyin.
2. Bilinci yeniden kazandıktan sonra, hayvanın hareketliliğini ve aktivitesini ve ayrıca aktivite sırasında yara dikişini gözlemleyin. Dengelerini yeniden kazanan kurbağaları, yetiştirme için saf suyla dolu bir kaba aktarın. Yara enfeksiyonunu önlemek için suyu her gün saf suyla değiştirin.
   NOT: Bu önlemlerle, hayatta kalma oranı ~% 90'a ulaşabilir. Uzun süreli anestezi ve ameliyat sırasında aşırı kanama, tipik olarak ameliyat gününde meydana gelen ölüme yol açar.

3. Kardiyak yaralanma sonrası onarım durumunun tespiti

1. Ameliyattan sonra X. tropicalis'in kalbini birden fazla zaman noktasında toplayın.
   1. X. tropicalis'i trikain ile uyuşturduktan sonra, karnı açın ve kalbin yerini bulmak için diğer iç organları ve dokuları çıkarmak için forseps kullanın.
      NOT: Apeks rezeksiyonu nedeniyle, onarım işlemi sırasında kalbin diğer doku ve organlarla birlikte gelişmesi muhtemeldir. Bazen, kas duvarına yapışır ve ayrılması kolay değildir, bu nedenle toplama sırasında dikkatlice ele alınması gerekir.
   2. Kalbi bulduktan sonra, diğer organları kalpten nazikçe yırtmak için forseps kullanın. Kalbi açığa çıkarmak için kalbi çevreleyen diğer dokuları yavaşça soyun. Kalbi yavaşça kaldırmak için forseps kullanın ve makas kullanarak kesin. Kalan kanı çıkarmak için kalbi hemen PBS'ye yerleştirin ve dokümantasyon için bir stereoskopla fotoğraflayın (Şekil 2).
2. Gradyan dehidrasyonu
   1. Fazla PBS kalıntılarını kurutmak için kalpleri filtre kağıdıyla kurutun ve 24 kuyucuklu bir hücre kültürü kabına yerleştirin. Kalp dokularını gece boyunca sabitlemek için 1-2 ml% 4 paraformaldehit kullanın. Ertesi gün, etanol dehidrasyonu yapın. İlk olarak, gece boyunca% 70 etanol, ardından gradyan dehidrasyonu için% 80 etanol,% 90 etanol ve% 100 etanol kullanın (her seferinde 1 saat). % 100 etanol kullanımını üç kez tekrarlayın.
3. Parafin gömme
   1. Susuz kalmış kalp dokusunu 6-8 dakika boyunca ksilen ile tedavi edin. Ksilen ile muamele edilmiş dokuyu 2-3 saat boyunca 65 ° C'de parafin balmumu ile doldurulmuş bir cam kaba yerleştirin.
      NOT: Gömme işlemi sırasında bölümü etkiledikleri için hava kabarcıklarından kaçınmak önemlidir.
4. Gömülü dokuyu -20 ° C'de 1 saat boyunca dondurun ve bölümlendirin.
5. Kalbi kesitledikten sonra, standart hematoksilin ve eozin (H&E) ve Masson'un trikrom boyama tekniklerini bölüm^11'de uygulayın.

Sonuçlar

Kalpler 0 dpr, 7 dpr, 14 dpr ve 30 dpr'de toplandı. Morfolojik analiz, kalp hasarının neden olduğu kan pıhtısının 30 dpr'de kaybolduğunu ortaya koydu (Şekil 2). Aynı zamanda, rezeksiyon grubunda kalplerin 30 dpr'deki görünümü, sahte operasyon grubundaki kalplerinkine benzerdi; belirgin bir yara yoktu (Şekil 2). Apikal rezeksiyondan sonra, H&E (Şekil 3) ve Masson'un trikrom boyaması (Şekil 4

Tartışmalar

Kalbin tepesinin cerrahi amputasyonunu içeren apikal rezeksiyon, zebra balığı ve farelerde^{tanımlanmıştır 6,18}; ancak, bu X. tropicalis'te tanımlanmamıştır. Bu yazıda kardiyak hasarın güvenilir bir modeli açıklanmakta ve erişkin X. tropicalis'in kalbinin apikal rezeksiyondan sonra skar oluşmadan tamamen yenilenebildiği gösterilmiştir. Bununla birlikte, bazı eksikliklerin iyileştirilmesi ve bazı detayların dikkat edilmesi...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetic acid	GHTECH	64-19-7-500ml
Acid Alcohol Fast Differentiation Solution	Beyotime	C0163M
Acid Fuchsin	aladdin	A104916
Alcohol Soluble Eosin Y Stainin Solution	Servicebio	G1001-500ML
BioReagent	Beyotime	ST2600-100g
Ethanol absolute	Guangzhou Chemical Reagent Factory	HB15-GR-0.5L
Hematoxylin Stain Solution	Servicebio	G1004-500ML
Neutral balsam	Solarbio	G8590
Operating Scissors	Prosperich	HC-JZ-YK-Z-10cm
Paraffins	Leica	39601095
Para-formaldehyde Fixative	Servicebio	G1101-500ML
Phosphate Buffered Saline (PBS) powder	Servicebio	G0002-2L
Phosphomolybdic acid hydrate	Macklin	P815551
Stereo microscope	Leica
surgical forceps	ChangZhou	zfq-11-btjw
Surgical Suture	HUAYON	18-5140
Tricaine	Macklin
Xylene	Guangzhou Chemical Reagent Factory	IC02-AR-0.5L