מודל כריתה אפית בלב הבוגר Xenopus tropicalis

Summary

Xenopus tropicalis הוא מודל אידיאלי למחקר רגנרטיבי מכיוון שלרבים מאיבריו יש יכולת התחדשות יוצאת דופן. כאן אנו מציגים שיטה לבניית מודל של פגיעה בלב ב-X. tropicalis באמצעות כריתת קודקוד.

Abstract

ידוע כי אצל יונקים בוגרים, הלב איבד את יכולת ההתחדשות שלו, מה שהופך את אי ספיקת הלב לאחד הגורמים המובילים למוות ברחבי העולם. מחקרים קודמים הוכיחו את יכולת ההתחדשות של ליבו של הקסנופוס טרופיקליס הבוגר, דו-חי אנורי בעל גנום דיפלואידי וקשר אבולוציוני הדוק עם יונקים. בנוסף, מחקרים הראו כי לאחר כריתת קודקוד החדר, הלב יכול להתחדש ללא הצטלקות ב - X. tropicalis. כתוצאה מכך, תוצאות קודמות אלה מצביעות על כך ש - X. tropicalis הוא מודל חלופי מתאים לבעלי חוליות לחקר התחדשות לב בוגר. מודל כירורגי של התחדשות הלב אצל X. tropicalis הבוגר מוצג כאן. בקצרה, הצפרדעים הורדמו וקובעו; לאחר מכן, חתך קטן נעשה עם מספריים iridectomy, חודר את העור ואת קרום הלב. לחץ עדין הופעל על החדר, ואת קודקוד החדר נחתך אז עם מספריים. פגיעה לבבית והתחדשות אושרו על ידי היסטולוגיה ב 7-30 ימים לאחר כריתה (dpr). פרוטוקול זה ביסס מודל כריתה אפיקלי במבוגרים X. tropicalis, אשר ניתן להשתמש בו כדי להבהיר את מנגנוני התחדשות הלב הבוגר.

Introduction

אי ספיקת לב היא גורם תמותה מוביל בעולם בשנים האחרונות. מאז שנת 2000, מספר מקרי המוות עקב אי ספיקת לב גדל עם הזמן. יותר מ -9 מיליון אנשים מתו מקרדיומיופתיה בשנת 2019, שהיוותה 16% מכלל התמותה בעולם¹. בשל אובדן יכולת ההתחדשות של הלב אצל יונקים בוגרים, במקרים מסוימים, אין מספיק קרדיומיוציטים כדי לשמור על תפקודי ההתכווצות בלב, מה שמשפיע על תפקוד הלב ותורם לעיצוב מחדש של חדרים ואי ספיקת לב ^2,3,4. ואכן, אצל יונקים, ללב יש את יכולת ההתחדשות הירודה ביותר בהשוואה לאיברים אחרים, כגון הכבד, הריאות, המעיים, שלפוחית השתן, העצם והעור. ככל שהזדקנות אוכלוסיית העולם תהפוך למגה-מגמה עולמית, האתגרים העומדים בפנינו עם מחלות לב יתעצמו⁵.

להבהרת מנגנוני התחדשות הלב עשויות להיות השלכות משמעותיות על טיפולים במחלת לב איסכמית. דיווחים גילו כי ללבבות של עכברים ילודים יש יכולת התחדשות לאחר כריתה⁶ קודקוד. עם זאת, יכולת התחדשות זו אובדת לאחר 7 ימים של גיל⁷. מחקרים הראו כי לבבות יונקים בוגרים אינם מסוגלים להתחדש מכיוון שיכולתם להתפשטות קרדיומיוציטים פחתה ^8,9. עם זאת, לבבות של חולייתנים נמוכים יותר יש יכולת התחדשות חזקה לאחר פציעה. לדוגמה, דגי זברה¹⁰, X. tropicalis¹¹, Xenopus laevis¹², newt 13 ו-axolotl¹⁴ מסוגלים להתחדשות מלאה לאחר כריתת קודקוד. בנוסף, חלקים אחרים של גופם של חלק מבעלי החוליות התחתונים יכולים גם הם לעבור התחדשות מלאה, כגון הגפיים של ניוטים והזנבות, העדשות והזרועות של צפרדעים טרופיות^בעלות טפרים 4,15,16.

ביסוס מודלים של פגיעות לב הוא הצעד הראשון להבהרת המנגנונים העומדים בבסיס התחדשות הלב ויש לו משמעות רבה במחקר רגנרטיבי. חוקרים פיתחו שיטות שונות לבניית מודלים של פגיעות לב, כולל דקירה, קונטוציה, אבלציה גנטית, קריופציעה, אוטם ^5,6.

Cryoinjury, אוטם שריר הלב (MI) וכריתת קודקוד נמצאים בשימוש נרחב לגרימת פגיעה לבבית, ולסוג הפציעה עשויות להיות השפעות משמעותיות על ההתחדשות הבאה של קרדיומיוציטים⁶. בהתאם לטכניקה הכירורגית, תגובת הלב להתחדשות עשויה להשתנות. Cryoinjury גורם למוות תאי מסיבי ומייצר צלקות פיברוטיות בליבם של דגי זברה¹⁷, ובכך יוצר מודל הדומה לאוטם יונקים. כריתה אפית מבוצעת על ידי חיתוך חלק מרקמות החדר, אשר נעשה בדגי זברה¹⁰ ו - X. tropicalis¹¹, מבלי לגרום לצלקות קבועות. מחקר זה ביצע כריתה אפיקלית, שהיא פעולה פשוטה יותר ודורשת פחות כלי ניתוח מאשר cryoinjury. באמצעות ניתוח מעקב אחר שושלות, מחקר קודם הראה כי התחדשות הלב קשורה לשגשוג של קרדיומיוציטים הקיימים מראש בליבם של עכבר⁶ ודגי זברה¹⁸, אך לא קיימים דיווחים עבור דו-חיים. לפיכך, המודל של כריתת קודקוד ב- X. tropicalis ממלא תפקיד חשוב בהבהרת המנגנונים העומדים בבסיס תגובות רגנרטיביות.

Protocol

כל פרוטוקולי הניסוי הקשורים X. tropicalis אושרו על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים באוניברסיטת ג'ינאן.

1. ניתוח

1. הכנה לפני הניתוח: יש להכין מספריים אופתלמיים, מלקחיים עיניים, מלקחיים מחט, כדורי סופג, נייר סינון ותפרים/מחטים כירורגיים לכריתת קודקוד בלב X. tropicalis. עיין בטבלת החומרים לקבלת מידע מפורט. לפני השימוש, לעקר את כל כלי הניתוח על ידי autoclaving, ולהכין כמות מספקת של קרח לשימוש עתידי.
2. מרדימים X. tropicalis בוגר עם טריקאין על ידי הצבתו ב 500 מ"ל של תמיסת טריקאין (1 מ"ג / מ"ל) בטמפרטורת החדר למשך 4 דקות¹⁹, ולאחר מכן מניחים אותו על משטח קרח על שולחן הניתוחים כדי להבטיח שהצפרדע לא תתעורר במהלך תהליך ההפעלה.
   זהירות: ההליך כולו דורש 5-10 דקות; זמן ההרדמה לא צריך להיות ארוך מדי, אחרת X. tropicalis לא יוכל להתעורר לאחר הניתוח.
3. ניתוחי בית החזה
   1. הניחו את הבטן X. tropicalis המורדמת כלפי מעלה, וכסו את בטנה של הצפרדע בגזה ספוגה מראש במים מזוקקים כדי למנוע התייבשות של עור החיה במהלך הניתוח.
   2. לחץ בעדינות על החזה עם מלקחיים, מצא את מרכז החזה במקביל לגפה הקדמית התחתונה, הרם את העור עם מספריים אופתלמיים, ובצע בעדינות חתך קטן של ~ 1 ס"מ. בעזרת מספריים אופתלמיים מרימים את שכבת השריר מתחת לעור ויוצרים פצע בשריר החזה המרכזי. כמו הלב ממוקם במיקום העליון של אתר הפצע, בעדינות לחץ על החזה עם מלקחיים אופתלמיים כדי לסחוט את הלב מתוך הפצע.
      זהירות: מכיוון שהעור של X. tropicalis יכול לייצר פפטידים אנטי-מיקרוביאליים, אין צורך להשתמש בהליכי חיטוי קונבנציונליים באתר הניתוח של X. tropicalis. כל חומר חיטוי יפגע בעור של X. tropicalis.
4. כריתת קודקוד החדר
   1. מהדקים בעדינות את קרום הלב עם מלקחיים, ושוברים אותו בעדינות באמצעות מספריים אופתלמיים ליד קודקוד הלב. המתינו עד שקרום הלב יירד כתוצאה משאיבת דם סיסטולי (איור 1A, B).
   2. החזיקו את קצה הלב עם מלקחיים ביד הלא דומיננטית, והרימו מעט את הלב בהתאם לקצב התכווצות הלב. כאשר הלב מתכווץ כדי להזרים דם דרך כלי הדם, חתכו במהירות את קודקוד הלב (~14% מהחדר) (איור 1C).
   3. כדי להבטיח שכמות כריתת הקודקוד היא כ-14% מהלב כולו, יש לנתח את משקל הלב (HW) ואת שטח הפנים עם או בלי כריתה²⁰. הכניסו את הלב לחזה בעזרת מלקחיים וכדור סופג.
      הערה: אין ללחוץ על הלב ישירות עם המלקחיים; אחרת, חלקים אחרים של הלב ינוקבו.
5. תפרו את העור עם תפר חוט כירורגי 4-0 שאינו סופג משי (איור 1D). יש להקפיד להימנע מתפירה לתוך שכבת השריר כדי למנוע תמותה לאחר הניתוח. יש להמתין עד שהפצע בעור יחלים באופן טבעי תוך שבוע לאחר הניתוח.
6. בקבוצת ניתוח דמה, לבצע את בית החזה, לפתוח את קרום הלב, ולתפור, מבלי לבצע את כריתת קודקוד.

2. התאוששות כירורגית

1. מניחים את X. tropicalis לאחר הניתוח עם בטנו פונה כלפי מעלה בתוך צלחת פטרי המכילה כמות קטנה של מים deionized (לא להציף לחלוטין את החיה). המתן עד שה - X. tropicalis יתעורר תוך ~ 10 דקות.
2. עם חזרתו להכרה, שימו לב לתנועתיות ולפעילות של בעל החיים, כמו גם לתפר הפצע במהלך הפעילות. העבירו את הצפרדעים שחזרו לאיזון למיכל מלא במים טהורים לטיפוח. החלף את המים במים טהורים כל יום כדי למנוע זיהום פצע.
   הערה: עם אמצעים אלה, שיעור ההישרדות יכול להגיע ~ 90%. זמן ממושך של הרדמה ודימום יתר במהלך הניתוח מובילים שניהם למוות, המתרחש בדרך כלל ביום הניתוח.

3. איתור מצב התיקון לאחר פגיעה לבבית

1. לאסוף את הלבבות של X. tropicalis במספר נקודות זמן לאחר הניתוח.
   1. לאחר הרדמת X. tropicalis עם tricaine, לפתוח את הבטן, ולהשתמש במלקחיים כדי להסיר את האיברים הפנימיים האחרים ורקמות כדי למצוא את המיקום של הלב.
      הערה: בשל כריתת הקודקוד, הלב עשוי להתפתח לצד רקמות ואיברים אחרים במהלך תהליך התיקון. לעיתים, הוא נדבק לדופן השריר ולא קל להפריד אותו, ולכן יש לטפל בו בזהירות במהלך האיסוף.
   2. לאחר מציאת הלב, השתמש במלקחיים כדי לקרוע בעדינות את האיברים האחרים מהלב. קלף בעדינות את הרקמות האחרות המקיפות את הלב כדי לחשוף את הלב. השתמש במלקחיים כדי להרים בעדינות את הלב, וגזור אותו באמצעות מספריים. הניחו את הלב מיד ב-PBS כדי להסיר את שאריות הדם, וצלמו אותו עם סטריאוסקופ לתיעוד (איור 2).
2. התייבשות הדרגתית
   1. הכתם את הלבבות בנייר פילטר כדי לייבש את שאריות PBS העודפים, והניחו אותם בכלי תרבית תאים של 24 בארות. השתמש 1-2 מ"ל של 4% paraformaldehyde כדי לתקן את רקמות הלב במשך הלילה. למחרת, לבצע התייבשות אתנול. ראשית, השתמשו ב-70% אתנול למשך הלילה, ולאחר מכן ב-80% אתנול, 90% אתנול ו-100% אתנול להתייבשות הדרגתית (שעה בכל פעם). חזור על השימוש באתנול 100% שלוש פעמים.
3. שיבוץ פרפין
   1. לטפל ברקמת הלב המיובשת עם קסילן במשך 6-8 דקות. הניחו את הרקמה שטופלה בקסילן במיכל זכוכית מלא בשעוות פרפין בטמפרטורה של 65°C למשך 2-3 שעות.
      הערה: חיוני להימנע מבועות אוויר מכיוון שהן משפיעות על החלק במהלך תהליך ההטבעה.
4. מקפיאים את הרקמה המשובצת ב -20 מעלות צלזיוס למשך שעה אחת, וחותכים אותה.
5. לאחר חיתוך הלב, בצע טכניקות סטנדרטיות של המטוקסילין ואוזין (H&E) ושל מאסון על קטעי¹¹.

תוצאות

הלבבות נאספו ב 0 dpr, 7 dpr, 14 dpr, ו 30 dpr. הניתוח המורפולוגי גילה שקריש הדם שנגרם על-ידי הפגיעה בלב נעלם ב-30 dpr (איור 2). יחד עם זאת, הופעת הלבבות ב 30 dpr בקבוצת הכריתה הייתה דומה לזו של הלבבות בקבוצת הפעולה המזויפת; לא היו פצעים ברורים (איור 2). לאחר כריתה אפיקלית נוצר קריש...

Discussion

כריתה אפית, הכוללת קטיעה כירורגית של קודקוד הלב, תוארה בדגי זברה ובעכברים ^6,18; עם זאת, זה לא תואר X. tropicalis. דו"ח זה מתאר מודל אמין של פגיעה לבבית ומדגים כי הלב של X. tropicalis בוגר יכול להתחדש באופן מלא לאחר כריתה אפית ללא צלקות. עם זאת, כמה חסרונות צריך לשפר, ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetic acid	GHTECH	64-19-7-500ml
Acid Alcohol Fast Differentiation Solution	Beyotime	C0163M
Acid Fuchsin	aladdin	A104916
Alcohol Soluble Eosin Y Stainin Solution	Servicebio	G1001-500ML
BioReagent	Beyotime	ST2600-100g
Ethanol absolute	Guangzhou Chemical Reagent Factory	HB15-GR-0.5L
Hematoxylin Stain Solution	Servicebio	G1004-500ML
Neutral balsam	Solarbio	G8590
Operating Scissors	Prosperich	HC-JZ-YK-Z-10cm
Paraffins	Leica	39601095
Para-formaldehyde Fixative	Servicebio	G1101-500ML
Phosphate Buffered Saline (PBS) powder	Servicebio	G0002-2L
Phosphomolybdic acid hydrate	Macklin	P815551
Stereo microscope	Leica
surgical forceps	ChangZhou	zfq-11-btjw
Surgical Suture	HUAYON	18-5140
Tricaine	Macklin
Xylene	Guangzhou Chemical Reagent Factory	IC02-AR-0.5L