Un modello di resezione apicale nel cuore adulto di Xenopus tropicalis

Riepilogo

Xenopus tropicalis è un modello ideale per la ricerca rigenerativa in quanto molti dei suoi organi possiedono una notevole capacità rigenerativa. Qui, presentiamo un metodo per costruire un modello di lesione cardiaca in X. tropicalis tramite resezione dell'apice.

Abstract

È noto che nei mammiferi adulti, il cuore ha perso la sua capacità rigenerativa, rendendo l'insufficienza cardiaca una delle principali cause di morte in tutto il mondo. Ricerche precedenti hanno dimostrato la capacità rigenerativa del cuore dell'adulto Xenopus tropicalis, un anfibio anuro con un genoma diploide e una stretta relazione evolutiva con i mammiferi. Inoltre, gli studi hanno dimostrato che dopo la resezione dell'apice ventricolare, il cuore può rigenerarsi senza cicatrici in X. tropicalis. Di conseguenza, questi risultati precedenti suggeriscono che X. tropicalis è un modello di vertebrato alternativo appropriato per lo studio della rigenerazione cardiaca adulta. Un modello chirurgico di rigenerazione cardiaca nell'adulto X. tropicalis è presentato qui. In breve, le rane furono anestetizzate, fissate; Quindi, è stata praticata una piccola incisione con forbici per iridectomia, penetrando nella pelle e nel pericardio. Una leggera pressione è stata applicata al ventricolo e l'apice del ventricolo è stato quindi tagliato con le forbici. Il danno cardiaco e la rigenerazione sono stati confermati dall'istologia a 7-30 giorni dopo la resezione (dpr). Questo protocollo ha stabilito un modello di resezione apicale nell'adulto X. tropicalis, che può essere impiegato per chiarire i meccanismi della rigenerazione cardiaca adulta.

Introduzione

L'insufficienza cardiaca è stata una delle principali cause di mortalità in tutto il mondo negli ultimi anni. Dal 2000, il numero di decessi dovuti a insufficienza cardiaca è aumentato nel tempo. Più di 9 milioni di persone sono morte per cardiomiopatia nel 2019, che ha rappresentato il 16% del numero totale di decessi a livello globale¹. A causa della perdita della capacità rigenerativa del cuore nei mammiferi adulti, in alcuni casi, non ci sono abbastanza cardiomiociti per mantenere le funzioni di contrazione nel cuore, che influisce sulla funzione cardiaca e contribuisce al rimodellamento ventricolare anormale e all'insufficienza cardiaca ^2,3,4. Infatti, nei mammiferi, il cuore ha la capacità rigenerativa più scarsa rispetto agli altri organi, come fegato, polmoni, intestino, vescica, ossa e pelle. Man mano che l'invecchiamento della popolazione mondiale diventa un megatrend globale, le sfide che affrontiamo con le malattie cardiache si intensificheranno⁵.

Chiarire i meccanismi della rigenerazione cardiaca può avere implicazioni significative per le terapie per la cardiopatia ischemica. I rapporti hanno rivelato che i cuori dei topi neonatali hanno una capacità rigenerativa dopo la^{resezione 6} dell'apice. Tuttavia, questa capacità rigenerativa viene persa dopo 7 giorni di età⁷. Gli studi hanno dimostrato che i cuori adulti dei mammiferi non sono in grado di rigenerarsi perché la loro capacità di proliferazione dei cardiomiociti è diminuita^dell'8,9. Tuttavia, i cuori dei vertebrati inferiori possiedono una potente capacità rigenerativa dopo l'infortunio. Ad esempio, zebrafish¹⁰, X. tropicalis¹¹, Xenopus laevis¹², newt 13 e axolotl¹⁴ sono in grado di rigenerarsi completamente dopo la resezione dell'apice. Inoltre, anche le altre parti del corpo di alcuni vertebrati inferiori possono subire una completa rigenerazione, come gli arti dei tritoni e le code, le lenti e le braccia delle rane artigliate tropicali 4,15,16.

Stabilire modelli di lesioni cardiache è il primo passo per chiarire i meccanismi alla base della rigenerazione cardiaca e ha un grande significato nella ricerca rigenerativa. I ricercatori hanno sviluppato vari metodi per costruire modelli di lesioni cardiache, tra cui accoltellamento, contusing, ablazione genetica, criolesione e infarto ^5,6.

La criolesione, l'infarto miocardico (IM) e la resezione all'apice sono ampiamente utilizzati per indurre lesioni cardiache e il tipo di lesione può avere effetti sostanziali sulla successiva rigenerazione dei cardiomiociti⁶. A seconda della tecnica chirurgica, la risposta del cuore alla rigenerazione potrebbe variare. La criolesione provoca una massiccia morte cellulare e produce cicatrici fibrotiche nel cuore del pesce zebra¹⁷, creando così un modello che assomiglia all'infarto dei mammiferi. La resezione apicale viene eseguita tagliando via una parte dei tessuti ventricolari, che è stata fatta in zebrafish¹⁰ e X. tropicalis¹¹, senza causare cicatrici permanenti. Questo studio ha eseguito la resezione apicale, che è un'operazione più semplice e richiede meno strumenti chirurgici rispetto alla criolesione. Utilizzando l'analisi del lineage-tracing, uno studio precedente ha dimostrato che la rigenerazione cardiaca è correlata alla proliferazione di cardiomiociti che preesistono nei cuori del topo⁶ e del pesce zebra¹⁸, ma non esistono segnalazioni per gli anfibi. Quindi, il modello di resezione dell'apice in X. tropicalis gioca un ruolo importante nel chiarire i meccanismi alla base delle risposte rigenerative.

Protocollo

Tutti i protocolli sperimentali relativi a X. tropicalis sono stati approvati dal Jinan University Animal Care Committee.

1. Chirurgia

1. Preparazione preoperatoria: tenere pronte forbici oftalmiche, pinze oftalmiche, pinze per aghi, sfere assorbenti, carta da filtro e suture chirurgiche / aghi per la resezione dell'apice nel cuore di X. tropicalis. Fare riferimento alla tabella dei materiali per informazioni dettagliate. Prima dell'uso, sterilizzare tutti gli strumenti chirurgici in autoclave e preparare una quantità adeguata di ghiaccio per un uso futuro.
2. Anestetizzare un adulto X. tropicalis con tricaina mettendolo in 500 ml di soluzione di tricaina (1 mg/ml) a temperatura ambiente per 4 min¹⁹, quindi metterlo su una superficie di ghiaccio sul tavolo operatorio per assicurarsi che la rana non si svegli durante il processo operativo.
   ATTENZIONE: L'intera procedura richiede 5-10 min; il tempo di anestesia non dovrebbe essere troppo lungo, altrimenti X. tropicalis potrebbe non essere in grado di svegliarsi dopo l'operazione.
3. Thoracotomy
   1. Posizionare l'addome di X. tropicalis anestetizzato verso l'alto e coprire l'addome della rana con una garza imbevuta di acqua distillata per evitare l'essiccazione della pelle dell'animale durante l'operazione.
   2. Premere delicatamente il torace con una pinza, trovare il centro del torace parallelo all'arto anteriore inferiore, sollevare la pelle con le forbici oftalmiche e praticare delicatamente una piccola incisione di ~ 1 cm. Usando le forbici oftalmiche, raccogli lo strato muscolare sotto la pelle e crea una ferita nel muscolo toracico centrale. Poiché il cuore si trova nella posizione superiore del sito della ferita, premere delicatamente il torace con la pinza oftalmica per spremere il cuore dalla ferita.
      ATTENZIONE: Poiché la pelle di X. tropicalis può produrre peptidi antimicrobici, non è necessario impiegare procedure di disinfezione convenzionali sul sito chirurgico di X. tropicalis. Qualsiasi disinfettante danneggerà la pelle di X. tropicalis.
4. Resezione dell'apice ventricolare
   1. Bloccare delicatamente il pericardio con una pinza e romperlo delicatamente usando le forbici oftalmiche vicino all'apice del cuore. Attendere che il pericardio si stacchi a causa del pompaggio del sangue sistolico (Figura 1A, B).
   2. Tenere la punta del cuore con una pinza nella mano non dominante e sollevare leggermente il cuore in base al ritmo di contrazione cardiaca. Quando il cuore si contrae per ricircolare il sangue attraverso i vasi sanguigni, tagliare rapidamente l'apice del cuore (~ 14% del ventricolo) (Figura 1C).
   3. Per garantire che la quantità di resezione dell'apice sia circa il 14% dell'intero cuore, analizzare il peso cardiaco (HW) e l'area superficiale con o senza resezione²⁰. Metti il cuore nel petto usando una pinza e una palla assorbente.
      NOTA: Non premere il cuore direttamente con la pinza; Altrimenti, altre parti del cuore saranno perforate.
5. Suturare la pelle con una sutura chirurgica del filo chirurgico non di seta non assorbente 4-0 (Figura 1D). Fare attenzione a evitare di suturare nello strato muscolare per prevenire la mortalità postoperatoria. Attendere che la ferita cutanea guarisca naturalmente entro 1 settimana dopo l'intervento chirurgico.
6. Nel gruppo di operazioni fittizie, eseguire la toracotomia, aprire il pericardio e la sutura, senza eseguire la resezione dell'apice.

2. Recupero chirurgico

1. Posizionare il postoperatorio X. tropicalis con l'addome rivolto verso l'alto in una capsula di Petri contenente una piccola quantità di acqua deionizzata (non inondare completamente l'animale). Attendi che X. tropicalis si svegli entro ~ 10 minuti.
2. Dopo aver ripreso conoscenza, osservare la mobilità e l'attività dell'animale, nonché la sutura della ferita durante l'attività. Trasferire le rane che hanno ritrovato il loro equilibrio in un contenitore pieno di acqua pura per la coltivazione. Sostituire l'acqua con acqua pura ogni giorno per evitare l'infezione della ferita.
   NOTA: Con queste misure, il tasso di sopravvivenza potrebbe raggiungere ~ 90%. Un tempo prolungato di anestesia e sanguinamento eccessivo durante l'intervento chirurgico portano entrambi alla morte, che in genere si verifica il giorno dell'intervento.

3. Rilevamento della condizione di riparazione dopo lesione cardiaca

1. Raccogli i cuori di X. tropicalis in più punti temporali dopo l'intervento chirurgico.
   1. Dopo aver anestetizzato X. tropicalis con tricaina, aprire l'addome e utilizzare una pinza per rimuovere gli altri organi interni e tessuti per trovare la posizione del cuore.
      NOTA: A causa della resezione dell'apice, è probabile che il cuore si sviluppi insieme ad altri tessuti e organi durante il processo di riparazione. A volte, si attacca alla parete muscolare e non è facile da separare, quindi deve essere maneggiato con cura durante la raccolta.
   2. Dopo aver trovato il cuore, usa una pinza per strappare delicatamente gli altri organi dal cuore. Rimuovere delicatamente gli altri tessuti che circondano il cuore per esporre il cuore. Usa una pinza per sollevare delicatamente il cuore e taglialo usando le forbici. Posizionare immediatamente il cuore in PBS per rimuovere il sangue residuo e fotografarlo con uno stereoscopio per la documentazione (Figura 2).
2. Disidratazione gradiente
   1. Tamponare i cuori con carta da filtro per asciugare i residui di PBS in eccesso e metterli in un piatto di coltura cellulare a 24 pozzetti. Utilizzare 1-2 ml di paraformaldeide al 4% per fissare i tessuti cardiaci durante la notte. Il giorno seguente, eseguire la disidratazione dell'etanolo. In primo luogo, utilizzare il 70% di etanolo durante la notte, seguito da 80% di etanolo, 90% di etanolo e 100% di etanolo per la disidratazione del gradiente (1 ora ogni volta). Ripetere l'uso di etanolo al 100% tre volte.
3. Incorporazione di paraffina
   1. Trattare il tessuto cardiaco disidratato con xilene per 6-8 minuti. Porre il tessuto trattato con xilene in un contenitore di vetro riempito con cera di paraffina a 65 °C per 2-3 ore.
      NOTA: è essenziale evitare bolle d'aria in quanto influenzano la sezione durante il processo di incorporamento.
4. Congelare il tessuto incorporato a -20 °C per 1 ora e sezionarlo.
5. Dopo aver sezionato il cuore, eseguire le tecniche standard di ematossilina ed eosina (H & E) e le tecniche di colorazione tricromatica di Masson sulle sezioni¹¹.

Risultati

I cuori sono stati raccolti a 0 dpr, 7 dpr, 14 dpr e 30 dpr. L'analisi morfologica ha rivelato che il coagulo di sangue causato dalla lesione cardiaca è scomparso a 30 dpr (Figura 2). Allo stesso tempo, l'aspetto dei cuori a 30 dpr nel gruppo di resezione era simile a quello dei cuori nel gruppo di operazione fittizia; non c'erano ferite evidenti (Figura 2). Dopo la resezione apicale, un coagulo di sangue si è formato e ha sigillato la ferita nel ventricolo, c...

Discussione

La resezione apicale, che comporta l'amputazione chirurgica dell'apice del cuore, è stata descritta in zebrafish e topi ^6,18; tuttavia, questo non è stato descritto in X. tropicalis. Questo rapporto descrive un modello credibile di danno cardiaco e dimostra che il cuore di X. tropicalis adulto può rigenerarsi completamente dopo la resezione apicale senza cicatrici. Tuttavia, alcune carenze devono essere migliorate e alcuni dettagli richiedono...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetic acid	GHTECH	64-19-7-500ml
Acid Alcohol Fast Differentiation Solution	Beyotime	C0163M
Acid Fuchsin	aladdin	A104916
Alcohol Soluble Eosin Y Stainin Solution	Servicebio	G1001-500ML
BioReagent	Beyotime	ST2600-100g
Ethanol absolute	Guangzhou Chemical Reagent Factory	HB15-GR-0.5L
Hematoxylin Stain Solution	Servicebio	G1004-500ML
Neutral balsam	Solarbio	G8590
Operating Scissors	Prosperich	HC-JZ-YK-Z-10cm
Paraffins	Leica	39601095
Para-formaldehyde Fixative	Servicebio	G1101-500ML
Phosphate Buffered Saline (PBS) powder	Servicebio	G0002-2L
Phosphomolybdic acid hydrate	Macklin	P815551
Stereo microscope	Leica
surgical forceps	ChangZhou	zfq-11-btjw
Surgical Suture	HUAYON	18-5140
Tricaine	Macklin
Xylene	Guangzhou Chemical Reagent Factory	IC02-AR-0.5L