Modelo de Ressecção Apical no Coração de Xenopus tropicalis Adulto

Resumo

Xenopus tropicalis é um modelo ideal para pesquisa regenerativa, pois muitos de seus órgãos possuem uma notável capacidade regenerativa. Apresentamos aqui um método para a construção de um modelo de lesão cardíaca em X. tropicalis via ressecção do ápice.

Resumo

Sabe-se que, em mamíferos adultos, o coração perdeu sua capacidade regenerativa, tornando a insuficiência cardíaca uma das principais causas de morte em todo o mundo. Pesquisas anteriores demonstraram a capacidade regenerativa do coração do adulto Xenopus tropicalis, um anfíbio anuro com genoma diploide e estreita relação evolutiva com mamíferos. Além disso, estudos têm demonstrado que, após a ressecção do ápice ventricular, o coração pode se regenerar sem cicatrizes em X. tropicalis. Consequentemente, esses resultados prévios sugerem que X. tropicalis é um modelo alternativo apropriado de vertebrados para o estudo da regeneração cardíaca de adultos. Um modelo cirúrgico de regeneração cardíaca no adulto X. tropicalis é apresentado neste artigo. Resumidamente, as rãs foram anestesiadas e fixadas; Em seguida, foi feita uma pequena incisão com tesoura de iridectomia, penetrando na pele e pericárdio. Suave pressão foi aplicada ao ventrículo, e o ápice do ventrículo foi então cortado com tesoura. A lesão cardíaca e a regeneração foram confirmadas pela histologia aos 7-30 dias pós-ressecção (dpr). Este protocolo estabeleceu um modelo de ressecção apical em X. tropicalis adulto, que pode ser empregado para elucidar os mecanismos de regeneração cardíaca do adulto.

Introdução

A insuficiência cardíaca tem sido uma das principais causas de mortalidade no mundo nos últimos anos. Desde 2000, o número de mortes por insuficiência cardíaca vem aumentando ao longo do tempo. Mais de 9 milhões de pessoas morreram de cardiomiopatia em 2019, o que representou 16% do número total de mortalidades em todo o mundo¹. Devido à perda da capacidade regenerativa do coração em mamíferos adultos, em alguns casos, não há cardiomiócitos suficientes para manter as funções de contração no coração, o que afeta a função cardíaca e contribui para remodelamento ventricular anormal e insuficiência^{cardíaca2,3,4}. De fato, nos mamíferos, o coração tem a menor capacidade regenerativa em comparação com os outros órgãos, como fígado, pulmões, intestinos, bexiga, osso e pele. À medida que o envelhecimento da população mundial se torna uma megatendência mundial, os desafios que enfrentamos com as doenças cardíacas se intensificarão⁵.

A elucidação dos mecanismos de regeneração cardíaca pode ter implicações significativas para as terapias da cardiopatia isquêmica. Relatos revelaram que os corações de camundongos neonatais têm uma capacidade regenerativa após a ressecção do ápice⁶. No entanto, essa capacidade regenerativa é perdida após os 7 dias de idade⁷. Estudos têm demonstrado que corações adultos de mamíferos são incapazes de se regenerar porque sua capacidade de proliferação de cardiomiócitos tem diminuído ^8,9. No entanto, os corações dos vertebrados inferiores possuem uma poderosa capacidade regenerativa após lesão. Por exemplo, zebrafish¹⁰, X. tropicalis¹¹, Xenopus laevis¹², newt 13 e axolotl¹⁴ são capazes de regeneração completa após ressecção do ápice. Além disso, as outras partes do corpo de alguns vertebrados inferiores também podem sofrer regeneração completa, como os membros dos tritões e as caudas, lentes e braços de rãs tropicais com garras 4,15,16.

O estabelecimento de modelos de lesão cardíaca é o primeiro passo para elucidar os mecanismos subjacentes à regeneração cardíaca e tem grande importância na pesquisa regenerativa. Pesquisadores desenvolveram vários métodos para construir modelos de lesão cardíaca, incluindo facada, contussão, ablação genética, criolesão e infarto ^5,6.

A criolesão, o infarto do miocárdio (IM) e a ressecção do ápice são amplamente utilizados para induzir lesão cardíaca, e o tipo de lesão pode ter efeitos substanciais na regeneração subsequente dos cardiomiócitos⁶. Dependendo da técnica cirúrgica, a resposta do coração à regeneração pode variar. A criolesão causa morte celular maciça e produz cicatrizes fibróticas no coração do peixe-zebra17, criando um modelo que se assemelha ao infarto de mamíferos. A ressecção apical é realizada cortando-se uma parte dos tecidos ventriculares, o que tem sido feito em zebrafish¹⁰ e X. tropicalis¹¹, sem causar cicatrizes permanentes. Este estudo realizou a ressecção apical, que é uma operação mais simples e requer menos instrumentais cirúrgicos do que a criolesão. Usando análise de traçado de linhagem, um estudo anterior demonstrou que a regeneração cardíaca está relacionada à proliferação de cardiomiócitos que preexistem nos corações de camundongos⁶ e zebrafish¹⁸, mas não há relatos para anfíbios. Assim, o modelo de ressecção de ápice em X. tropicalis desempenha um papel importante na elucidação dos mecanismos subjacentes às respostas regenerativas.

Protocolo

Todos os protocolos experimentais relacionados a X. tropicalis foram aprovados pelo Comitê de Cuidados com Animais da Universidade de Jinan.

1. Cirurgia

1. Preparo pré-operatório: Manter prontas tesouras oftálmicas, pinças oftálmicas, pinças de agulha, bolas absorventes, papel filtro e suturas/agulhas cirúrgicas para ressecção do ápice no coração de X. tropicalis. Consulte a Tabela de Materiais para obter informações detalhadas. Antes do uso, esterilizar todos os instrumentais cirúrgicos por autoclavação e preparar uma quantidade adequada de gelo para uso futuro.
2. Anestesiar um adulto de X. tropicalis com tricaína colocando-o em 500 mL de solução de tricaína (1 mg/mL) à temperatura ambiente por 4 min¹⁹ e, em seguida, colocá-lo em uma superfície de gelo na mesa cirúrgica para garantir que a rã não acorde durante o processo operacional.
   CUIDADO: Todo o procedimento requer 5-10 min; o tempo de anestesia não deve ser muito longo, caso contrário, o X. tropicalis pode não ser capaz de acordar após a operação.
3. Toracotomia
   1. Coloque o abdômen de X. tropicalis anestesiado para cima e cubra o abdômen da rã com gaze pré-embebida em água destilada para evitar o ressecamento da pele do animal durante a operação.
   2. Pressione suavemente o peito com pinças, encontre o centro do tórax paralelo ao membro anterior inferior, levante a pele com tesoura oftálmica e faça suavemente uma pequena incisão de ~1 cm. Usando tesoura oftálmica, pegue a camada muscular sob a pele e crie uma ferida no músculo central do peito. Como o coração está localizado na posição superior do local da ferida, pressione suavemente o peito com a pinça oftálmica para espremer o coração para fora da ferida.
      CUIDADO: Como a pele de X. tropicalis pode produzir peptídeos antimicrobianos, é desnecessário empregar procedimentos convencionais de desinfecção no sítio cirúrgico de X. tropicalis. Qualquer desinfetante danificará a pele do X. tropicalis.
4. Ressecção do ápice ventricular
   1. Aperte suavemente o pericárdio com pinça e quebre-o suavemente usando tesoura oftálmica perto do ápice do coração. Aguarde a saída do pericárdio devido ao bombeamento de sangue sistólico (Figura 1A, B).
   2. Segure a ponta do coração com pinça na mão não dominante e levante o coração levemente de acordo com o ritmo de contração cardíaca. Quando o coração se contrai para recircular o sangue através dos vasos sanguíneos, corte rapidamente o ápice do coração (~14% do ventrículo) (Figura 1C).
   3. Para garantir que a quantidade de ressecção do ápice seja de aproximadamente 14% de todo o coração, analise o peso do coração (CH) e a área de superfície com ou sem ressecção²⁰. Coloque o coração no peito usando pinça e uma bola absorvente.
      OBS: Não pressione o coração diretamente com a pinça; caso contrário, outras partes do coração serão perfuradas.
5. Sutura da pele com fio cirúrgico não absorvente 4-0 e não seda (Figura 1D). Tenha cuidado para evitar sutura na camada muscular para evitar mortalidade pós-operatória. Espere que a ferida da pele cicatrize naturalmente dentro de 1 semana após a cirurgia.
6. No grupo operação simulada, realizar a toracotomia, abrir o pericárdio e suturar, sem realizar a ressecção do ápice.

2. Recuperação cirúrgica

1. Coloque o X. tropicalis pós-operatório com o abdômen voltado para cima em uma placa de Petri contendo uma pequena quantidade de água deionizada (não inunde completamente o animal). Espere o X. tropicalis acordar dentro de ~10 min.
2. Ao recuperar a consciência, observe a mobilidade e a atividade do animal, bem como a sutura da ferida durante a atividade. Transfira as rãs que recuperaram o equilíbrio para um recipiente cheio de água pura para cultivo. Substitua a água por água pura todos os dias para evitar a infecção da ferida.
   NOTA: Com essas medidas, a taxa de sobrevivência poderia chegar a ~90%. Um tempo prolongado de anestesia e sangramento excessivo durante a cirurgia levam à morte, que normalmente ocorre no dia da cirurgia.

3. Detecção da condição de reparo após lesão cardíaca

1. Coletar os corações de X. tropicalis em vários pontos de tempo após a cirurgia.
   1. Depois de anestesiar o X. tropicalis com tricaína, abra o abdômen e use fórceps para remover os outros órgãos e tecidos internos para encontrar a localização do coração.
      NOTA: Devido à ressecção do ápice, é provável que o coração se desenvolva ao lado de outros tecidos e órgãos durante o processo de reparo. Às vezes, ele adere à parede muscular e não é fácil de separar, por isso precisa ser manuseado com cuidado durante a coleta.
   2. Depois de encontrar o coração, use pinças para arrancar suavemente os outros órgãos do coração. Descasque suavemente os outros tecidos ao redor do coração para expor o coração. Use pinças para levantar suavemente o coração e corte-o usando tesoura. Coloque o coração imediatamente em PBS para remover o sangue remanescente e fotografe-o com um estereoscópio para documentação (Figura 2).
2. Desidratação gradiente
   1. Limpe os corações com papel filtro para secar o excesso de resíduos de PBS e coloque-os em uma placa de cultura celular de 24 poços. Use 1-2 ml de paraformaldeído a 4% para fixar os tecidos cardíacos durante a noite. No dia seguinte, realizar a desidratação com etanol. Primeiro, use 70% de etanol durante a noite, seguido por 80% de etanol, 90% de etanol e 100% de etanol para desidratação do gradiente (1 h de cada vez). Repita o uso de etanol 100% três vezes.
3. Incorporação de parafina
   1. Trate o tecido cardíaco desidratado com xileno por 6-8 min. Colocar o tecido tratado com xileno num recipiente de vidro preenchido com cera de parafina a 65 °C durante 2-3 horas.
      NOTA: É essencial evitar bolhas de ar, pois elas afetam a seção durante o processo de incorporação.
4. Congelar o tecido incorporado a -20 °C durante 1 h e seccioná-lo.
5. Após a secção do coração, realizar-se as técnicas padrão de hematoxilina e eosina (H&E) e tricrômico de Masson nos cortes¹¹.

Resultados

Os corações foram coletados a 0 dpr, 7 dpr, 14 dpr e 30 dpr. A análise morfológica revelou que o coágulo sanguíneo causado pela lesão cardíaca desapareceu aos 30 dpr (Figura 2). Ao mesmo tempo, a aparência dos corações a 30 dpr no grupo de ressecção foi semelhante à dos corações no grupo de operação simulada; não havia ferimentos evidentes (Figura 2). Após a ressecção apical, um coágulo sanguíneo se formou e selou a ferida no ventrículo,...

Discussão

A ressecção apical, que envolve a amputação cirúrgica do ápice do coração, tem sido descrita em peixes-zebra e camundongos ^6,18; no entanto, isso não foi descrito em X. tropicalis. Este relato descreve um modelo crível de lesão cardíaca e demonstra que o coração de adultos X. tropicalis pode se regenerar completamente após ressecção apical sem cicatrizes. No entanto, algumas deficiências precisam ser melhoradas, e certos detalh...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetic acid	GHTECH	64-19-7-500ml
Acid Alcohol Fast Differentiation Solution	Beyotime	C0163M
Acid Fuchsin	aladdin	A104916
Alcohol Soluble Eosin Y Stainin Solution	Servicebio	G1001-500ML
BioReagent	Beyotime	ST2600-100g
Ethanol absolute	Guangzhou Chemical Reagent Factory	HB15-GR-0.5L
Hematoxylin Stain Solution	Servicebio	G1004-500ML
Neutral balsam	Solarbio	G8590
Operating Scissors	Prosperich	HC-JZ-YK-Z-10cm
Paraffins	Leica	39601095
Para-formaldehyde Fixative	Servicebio	G1101-500ML
Phosphate Buffered Saline (PBS) powder	Servicebio	G0002-2L
Phosphomolybdic acid hydrate	Macklin	P815551
Stereo microscope	Leica
surgical forceps	ChangZhou	zfq-11-btjw
Surgical Suture	HUAYON	18-5140
Tricaine	Macklin
Xylene	Guangzhou Chemical Reagent Factory	IC02-AR-0.5L