Ein apikales Resektionsmodell im adulten Xenopus tropicalis-Herzen

Zusammenfassung

Xenopus tropicalis ist ein ideales Modell für die regenerative Forschung, da viele seiner Organe eine bemerkenswerte Regenerationsfähigkeit besitzen. In dieser Arbeit stellen wir eine Methode zur Konstruktion eines Herzverletzungsmodells in X. tropicalis mittels Apexresektion vor.

Zusammenfassung

Es ist bekannt, dass bei erwachsenen Säugetieren das Herz seine Regenerationsfähigkeit verloren hat, was Herzinsuffizienz zu einer der häufigsten Todesursachen weltweit macht. Frühere Forschungen haben die Regenerationsfähigkeit des Herzens des erwachsenen Xenopus tropicalis nachgewiesen, einer Anurenamphibie mit einem diploiden Genom und einer engen evolutionären Verwandtschaft mit Säugetieren. Darüber hinaus haben Studien gezeigt, dass sich das Herz nach einer Resektion der ventrikulären Spitze regenerieren kann, ohne dass es bei X. tropicalis zu Narbenbildung kommt. Folglich deuten diese bisherigen Ergebnisse darauf hin, dass X. tropicalis ein geeignetes alternatives Wirbeltiermodell für die Untersuchung der adulten Herzregeneration ist. Ein chirurgisches Modell der kardialen Regeneration beim adulten X. tropicalis wird hier vorgestellt. Kurz wurden die Frösche betäubt und fixiert; Dann wurde mit einer Iridektomieschere ein kleiner Schnitt gemacht, der in die Haut und den Herzbeutel eindrang. Es wurde sanfter Druck auf die Herzkammer ausgeübt und die Spitze der Herzkammer wurde dann mit einer Schere herausgeschnitten. Die kardiale Schädigung und Regeneration wurde 7-30 Tage nach der Resektion (dpr) histologisch bestätigt. Dieses Protokoll etablierte ein apikales Resektionsmodell bei adultem X. tropicalis, das zur Aufklärung der Mechanismen der adulten Herzregeneration verwendet werden kann.

Einleitung

Herzinsuffizienz war in den letzten Jahren weltweit eine der häufigsten Todesursachen. Seit dem Jahr 2000 steigt die Zahl der Todesfälle aufgrund von Herzinsuffizienz im Laufe der Zeit an. Im Jahr 2019 starben mehr als 9 Millionen Menschen an Kardiomyopathie, was 16 % der Gesamtzahl der Todesfälle weltweit ausmachte¹. Aufgrund des Verlusts der Regenerationsfähigkeit des Herzens bei erwachsenen Säugetieren gibt es in einigen Fällen nicht genügend Kardiomyozyten, um die Kontraktionsfunktionen im Herzen aufrechtzuerhalten, was die Herzfunktion beeinträchtigt und zu abnormalem ventrikulärem Umbau und Herzinsuffizienz beiträgt ^2,3,4. Tatsächlich hat das Herz bei Säugetieren die schlechteste Regenerationsfähigkeit im Vergleich zu den anderen Organen wie Leber, Lunge, Darm, Blase, Knochen und Haut. Da die Alterung der Weltbevölkerung zu einem globalen Megatrend wird, werden sich die Herausforderungen, mit denen wir bei Herzerkrankungen konfrontiert sind, verschärfen⁵.

Die Aufklärung der Mechanismen der kardialen Regeneration könnte signifikante Auswirkungen auf die Therapie der ischämischen Herzkrankheit haben. Berichte haben gezeigt, dass die Herzen von neugeborenen Mäusen nach der Apex-Resektion eine Regenerationsfähigkeit haben⁶. Diese Regenerationsfähigkeit geht jedoch nach 7 Tagen im Alter von⁷ Jahren verloren. Studien haben gezeigt, dass erwachsene Säugetierherzen nicht in der Lage sind, sich zu regenerieren, weil ihre Fähigkeit zur Proliferation von Kardiomyozyten abgenommen hat ^8,9. Die Herzen niederer Wirbeltiere besitzen jedoch eine starke Regenerationsfähigkeit nach Verletzungen. Zum Beispiel sind Zebrafische 10, X. tropicalis¹¹, Xenopus laevis¹², Molch 13 und Axolotl¹⁴ in der Lage, sich nach Apexresektion vollständig zu regenerieren. Darüber hinaus können auch die anderen Körperteile einiger niederer Wirbeltiere vollständig regeneriert werden, wie z. B. die Gliedmaßen von Molchen und die Schwänze, Linsen und Arme tropischer Krallenfrösche 4,15,16.

Die Etablierung von Herzverletzungsmodellen ist der erste Schritt zur Aufklärung der Mechanismen, die der kardialen Regeneration zugrunde liegen, und hat eine große Bedeutung in der regenerativen Forschung. Forscher haben verschiedene Methoden entwickelt, um Modelle für Herzverletzungen zu erstellen, darunter Stiche, Prellungen, genetische Ablation, Kryoverletzung und Infarkt ^5,6.

Kryoverletzung, Myokardinfarkt (MI) und Apexresektion werden häufig zur Induktion von Herzverletzungen eingesetzt, und die Art der Verletzung kann erhebliche Auswirkungen auf die anschließende Regeneration von Kardiomyozyten haben⁶. Je nach Operationstechnik kann das Herz unterschiedlich auf die Regeneration reagieren. Kryoverletzungen verursachen einen massiven Zelltod und erzeugen fibrotische Narben im Herzen von Zebrafischen¹⁷, wodurch ein Modell entsteht, das einem Säugetierinfarkt ähnelt. Die apikale Resektion wird durchgeführt, indem ein Teil des ventrikulären Gewebes weggeschnitten wird, was beim Zebrafisch¹⁰ und X. tropicalis¹¹ der Fall war, ohne bleibende Narben zu verursachen. In dieser Studie wurde eine apikale Resektion durchgeführt, die eine einfachere Operation darstellt und weniger chirurgische Instrumente erfordert als Kryoverletzungen. Eine frühere Studie zeigte anhand von Abstammungsanalysen, dass die kardiale Regeneration mit der Proliferation von Kardiomyozyten zusammenhängt, die bereits in den Herzen^{der Maus 6} und des Zebrafisches¹⁸ vorhanden sind, aber es gibt keine Berichte über Amphibien. Daher spielt das Modell der Apexresektion in X. tropicalis eine wichtige Rolle bei der Aufklärung der Mechanismen, die regenerativen Reaktionen zugrunde liegen.

Protokoll

Alle Versuchsprotokolle im Zusammenhang mit X. tropicalis wurden vom Tierpflegeausschuss der Universität Jinan genehmigt.

1. Chirurgie

1. Präoperative Vorbereitung: Halten Sie Augenschere, Augenzange, Nadelzange, absorbierende Kugeln, Filterpapier und chirurgische Nähte/Nadeln für die Apexresektion im Herzen von X. tropicalis bereit. Detaillierte Informationen finden Sie in der Materialtabelle . Sterilisieren Sie vor dem Gebrauch alle chirurgischen Instrumente durch Autoklavieren und bereiten Sie eine ausreichende Menge Eis für die zukünftige Verwendung vor.
2. Betäuben Sie einen erwachsenen X. tropicalis mit Tricain, indem Sie ihn 4 Minuten^lang in 500 ml Tricainlösung (1 mg/ml) bei Raumtemperatur legen und dann auf eine Eisfläche auf dem Operationstisch legen, um sicherzustellen, dass der Frosch während des Operationsvorgangs nicht aufwacht.
   ACHTUNG: Der gesamte Vorgang dauert 5-10 Minuten; Die Narkosezeit sollte nicht zu lang sein, da der X. tropicalis sonst nach der Operation möglicherweise nicht mehr aufwachen kann.
3. Thorakotomie
   1. Legen Sie den betäubten X. tropicalis-Bauch nach oben und bedecken Sie den Hinterleib des Frosches mit Gaze, die in destilliertem Wasser eingeweicht ist, um ein Austrocknen der Tierhaut während der Operation zu vermeiden.
   2. Drücken Sie sanft mit einer Pinzette auf die Brust, suchen Sie die Mitte der Brust parallel zur unteren Vordergliedmaße, heben Sie die Haut mit einer Augenschere an und machen Sie vorsichtig einen kleinen Schnitt von ~1 cm. Heben Sie mit einer Augenschere die Muskelschicht unter der Haut auf und erzeugen Sie eine Wunde im zentralen Brustmuskel. Da sich das Herz in der oberen Position der Wundstelle befindet, drücken Sie vorsichtig mit der Augenzange auf den Brustkorb, um das Herz aus der Wunde zu drücken.
      ACHTUNG: Da die Haut von X. tropicalis antimikrobielle Peptide produzieren kann, ist der Einsatz herkömmlicher Desinfektionsverfahren an der Operationsstelle des X. tropicalis nicht erforderlich . Jedes Desinfektionsmittel schädigt die Haut des X. tropicalis.
4. Ventrikuläre Apexresektion
   1. Klemmen Sie den Herzbeutel vorsichtig mit einer Pinzette ein und brechen Sie ihn vorsichtig mit einer Augenschere in der Nähe der Herzspitze. Warten Sie, bis sich der Perikard aufgrund des systolischen Blutpumpens gelöst hat (Abbildung 1A, B).
   2. Halten Sie die Herzspitze mit einer Pinzette in der nicht-dominanten Hand und heben Sie das Herz entsprechend dem Herzkontraktionsrhythmus leicht an. Wenn sich das Herz zusammenzieht, um Blut durch die Blutgefäße zu zirkulieren, schneiden Sie schnell die Spitze des Herzens (~14% der Herzkammer) ab (Abbildung 1C).
   3. Um sicherzustellen, dass die Menge der Apexresektion etwa 14 % des gesamten Herzens beträgt, analysieren Sie das Herzgewicht (HW) und die Oberfläche mit oder ohne Resektion²⁰. Legen Sie das Herz mit einer Pinzette und einer saugfähigen Kugel in die Brust.
      Anmerkungen: Drücken Sie das Herz nicht direkt mit der Pinzette; Andernfalls werden andere Teile des Herzens durchstochen.
5. Nähen Sie die Haut mit einem 4-0 nicht absorbierenden, seidenfreien chirurgischen Fadennaht (Abbildung 1D). Achten Sie darauf, dass Sie nicht in die Muskelschicht einnähen, um eine postoperative Sterblichkeit zu vermeiden. Warten Sie, bis die Hautwunde innerhalb von 1 Woche nach der Operation auf natürliche Weise verheilt ist.
6. Führen Sie in der Scheinoperationsgruppe die Thorakotomie durch, öffnen Sie den Perikard und nähen Sie, ohne die Apexresektion durchzuführen.

2. Chirurgische Genesung

1. Legen Sie den postoperativen X. tropicalis mit dem Hinterleib nach oben in eine Petrischale, die eine kleine Menge deionisiertes Wasser enthält (das Tier nicht vollständig fluten). Warten Sie, bis der X. tropicalis innerhalb von ~10 Minuten aufwacht.
2. Beobachten Sie nach der Wiedererlangung des Bewusstseins die Beweglichkeit und Aktivität des Tieres sowie die Wundnaht während der Aktivität. Übertragen Sie die Frösche, die ihr Gleichgewicht wiedererlangt haben, zur Kultivierung in einen mit reinem Wasser gefüllten Behälter. Ersetzen Sie das Wasser jeden Tag durch reines Wasser, um Wundinfektionen zu vermeiden.
   HINWEIS: Mit diesen Maßnahmen könnte die Überlebensrate ~90% erreichen. Eine längere Narkosezeit und übermäßige Blutungen während der Operation führen beide zum Tod, der in der Regel am Tag der Operation eintritt.

3. Feststellung des Reparaturzustandes nach Herzverletzung

1. Sammeln Sie die Herzen von X. tropicalis zu mehreren Zeitpunkten nach der Operation.
   1. Nachdem Sie X. tropicalis mit Tricain betäubt haben, öffnen Sie den Bauch und entfernen Sie mit einer Zange die anderen inneren Organe und Gewebe, um die Position des Herzens zu finden.
      HINWEIS: Aufgrund der Apexresektion ist es wahrscheinlich, dass sich das Herz während des Reparaturprozesses zusammen mit anderen Geweben und Organen entwickelt. Manchmal klebt es an der Muskelwand und ist nicht leicht zu trennen, so dass es bei der Entnahme vorsichtig behandelt werden muss.
   2. Nachdem Sie das Herz gefunden haben, verwenden Sie eine Pinzette, um die anderen Organe vorsichtig aus dem Herzen zu reißen. Ziehen Sie vorsichtig das andere Gewebe ab, das das Herz umgibt, um das Herz freizulegen. Heben Sie das Herz mit einer Pinzette sanft an und schneiden Sie es mit einer Schere heraus. Legen Sie das Herz sofort in PBS, um das restliche Blut zu entfernen, und fotografieren Sie es zur Dokumentation mit einem Stereoskop (Abbildung 2).
2. Gradienten-Dehydrierung
   1. Tupfen Sie die Herzen mit Filterpapier ab, um die überschüssigen PBS-Rückstände zu trocknen, und legen Sie sie in eine 24-Well-Zellkulturschale. Verwenden Sie 1-2 ml 4%iges Paraformaldehyd, um das Herzgewebe über Nacht zu fixieren. Führen Sie am nächsten Tag eine Ethanol-Dehydrierung durch. Verwenden Sie zunächst 70 % Ethanol über Nacht, gefolgt von 80 % Ethanol, 90 % Ethanol und 100 % Ethanol für die Gradientendehydrierung (jeweils 1 Stunde). Wiederholen Sie die Verwendung von 100% Ethanol dreimal.
3. Paraffin-Einbettung
   1. Behandeln Sie das dehydrierte Herzgewebe 6-8 Minuten lang mit Xylol. Das mit Xylol behandelte Gewebe für 2-3 h in einen mit Paraffinwachs gefüllten Glasbehälter bei 65 °C geben.
      HINWEIS: Es ist wichtig, Luftblasen zu vermeiden, da diese den Abschnitt während des Einbettvorgangs beeinträchtigen.
4. Frieren Sie das eingebettete Gewebe bei −20 °C für 1 h ein und schneiden Sie es durch.
5. Nach der Durchtrennung des Herzens werden die Standard-Hämatoxylin- und Eosin-Färbetechniken (H&E) und die Trichrom-Färbetechniken nach Masson an den Schnitten^{durchgeführt 11}.

Ergebnisse

Die Herzen wurden bei 0 dpr, 7 dpr, 14 dpr und 30 dpr gesammelt. Die morphologische Analyse ergab, dass das durch die Herzverletzung verursachte Blutgerinnsel nach 30 dpr verschwand (Abbildung 2). Gleichzeitig war das Erscheinungsbild der Herzen bei 30 dpr in der Resektionsgruppe ähnlich wie das der Herzen in der Schein-Operationsgruppe; es gab keine offensichtlichen Wunden (Abbildung 2). Nach der apikalen Resektion bildete sich ein Blutgerinnsel, das die Wunde...

Diskussion

Die apikale Resektion, bei der die Herzspitze chirurgisch amputiert wird, wurde bei Zebrafischen und Mäusen beschrieben ^6,18; Dies wurde jedoch bei X. tropicalis nicht beschrieben. Dieser Bericht beschreibt ein glaubwürdiges Modell der Herzschädigung und zeigt, dass sich das Herz des adulten X. tropicalis nach apikaler Resektion vollständig regenerieren kann, ohne dass es zu Narbenbildung kommt. Einige Unzulänglichkeiten müssen jedoch beho...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetic acid	GHTECH	64-19-7-500ml
Acid Alcohol Fast Differentiation Solution	Beyotime	C0163M
Acid Fuchsin	aladdin	A104916
Alcohol Soluble Eosin Y Stainin Solution	Servicebio	G1001-500ML
BioReagent	Beyotime	ST2600-100g
Ethanol absolute	Guangzhou Chemical Reagent Factory	HB15-GR-0.5L
Hematoxylin Stain Solution	Servicebio	G1004-500ML
Neutral balsam	Solarbio	G8590
Operating Scissors	Prosperich	HC-JZ-YK-Z-10cm
Paraffins	Leica	39601095
Para-formaldehyde Fixative	Servicebio	G1101-500ML
Phosphate Buffered Saline (PBS) powder	Servicebio	G0002-2L
Phosphomolybdic acid hydrate	Macklin	P815551
Stereo microscope	Leica
surgical forceps	ChangZhou	zfq-11-btjw
Surgical Suture	HUAYON	18-5140
Tricaine	Macklin
Xylene	Guangzhou Chemical Reagent Factory	IC02-AR-0.5L