Un modelo de resección apical en el corazón adulto de Xenopus tropicalis

Resumen

Xenopus tropicalis es un modelo ideal para la investigación regenerativa ya que muchos de sus órganos poseen una notable capacidad regenerativa. Aquí, presentamos un método para construir un modelo de lesión cardíaca en X. tropicalis a través de la resección del ápice.

Resumen

Se sabe que en los mamíferos adultos, el corazón ha perdido su capacidad regenerativa, haciendo de la insuficiencia cardíaca una de las principales causas de muerte en todo el mundo. Investigaciones anteriores han demostrado la capacidad regenerativa del corazón del adulto Xenopus tropicalis, un anfibio anuro con un genoma diploide y una estrecha relación evolutiva con los mamíferos. Además, los estudios han demostrado que después de la resección del ápice ventricular, el corazón puede regenerarse sin cicatrización en X. tropicalis. En consecuencia, estos resultados previos sugieren que X. tropicalis es un modelo de vertebrados alternativo apropiado para el estudio de la regeneración cardíaca adulta. Aquí se presenta un modelo quirúrgico de regeneración cardíaca en el adulto X. tropicalis. Brevemente, las ranas fueron anestesiadas y fijadas; Luego, se realizó una pequeña incisión con tijeras de iridectomía, penetrando en la piel y el pericardio. Se aplicó una presión suave al ventrículo, y el ápice del ventrículo se cortó con tijeras. La lesión cardíaca y la regeneración se confirmaron por histología a los 7-30 días después de la resección (DPR). Este protocolo estableció un modelo de resección apical en adultos de X. tropicalis, que puede emplearse para dilucidar los mecanismos de regeneración cardíaca adulta.

Introducción

La insuficiencia cardíaca ha sido una de las principales causas de mortalidad en todo el mundo en los últimos años. Desde el año 2000, el número de muertes debidas a insuficiencia cardíaca ha ido aumentando con el tiempo. Más de 9 millones de personas murieron de miocardiopatía en 2019, lo que representó el 16% del número total de mortalidades a nivel mundial¹. Debido a la pérdida de la capacidad regenerativa del corazón en mamíferos adultos, en algunos casos, no hay suficientes cardiomiocitos para mantener las funciones de contracción en el corazón, lo que afecta la función cardíaca y contribuye a la remodelación ventricular anormal y la insuficiencia cardíaca ^2,3,4. De hecho, en los mamíferos, el corazón tiene la capacidad regenerativa más pobre en comparación con los otros órganos, como el hígado, los pulmones, los intestinos, la vejiga, los huesos y la piel. A medida que el envejecimiento de la población mundial se convierte en una megatendencia global, los desafíos que enfrentamos con las enfermedades cardíacas se intensificarán⁵.

Dilucidar los mecanismos de regeneración cardíaca puede tener implicaciones significativas para las terapias para la cardiopatía isquémica. Los informes han revelado que los corazones de ratones neonatos tienen una capacidad regenerativa después de la resección del ápice⁶. Sin embargo, esta capacidad regenerativa se pierde a los 7 días de edad⁷. Los estudios han demostrado que los corazones de los mamíferos adultos son incapaces de regenerarse porque su capacidad de proliferación de cardiomiocitos ha disminuido ^8,9. Sin embargo, los corazones de los vertebrados inferiores poseen una poderosa capacidad regenerativa después de una lesión. Por ejemplo, el pez cebra 10, X. tropicalis¹¹, Xenopus laevis¹², tritón 13 y axolotl¹⁴ son capaces de regenerarse completamente después de la resección del ápice. Además, las otras partes de los cuerpos de algunos vertebrados inferiores también pueden sufrir una regeneración completa, como las extremidades de los tritones y las colas, lentes y brazos de las ranas tropicales^con garras 4,15,16.

El establecimiento de modelos de lesión cardíaca es el primer paso para dilucidar los mecanismos subyacentes a la regeneración cardíaca y tiene gran importancia en la investigación regenerativa. Los investigadores han desarrollado varios métodos para construir modelos de lesión cardíaca, incluyendo apuñalamiento, contuso, ablación genética, criolesión e infarto ^5,6.

La criolesión, el infarto de miocardio (IM) y la resección del ápice son ampliamente utilizados para inducir lesión cardíaca, y el tipo de lesión puede tener efectos sustanciales en la siguiente regeneración de cardiomiocitos⁶. Dependiendo de la técnica quirúrgica, la respuesta del corazón a la regeneración puede variar. La criolesión causa la muerte celular masiva y produce cicatrices fibróticas en los corazones del pez cebra¹⁷, creando así un modelo que se asemeja al infarto de mamíferos. La resección apical se realiza cortando una parte de los tejidos ventriculares, lo que se ha hecho en el pez cebra¹⁰ y X. tropicalis¹¹, sin causar cicatrices permanentes. Este estudio realizó la resección apical, que es una operación más simple y requiere menos instrumentos quirúrgicos que la criolesión. Utilizando el análisis de rastreo de linaje, un estudio previo demostró que la regeneración cardíaca está relacionada con la proliferación de cardiomiocitos que preexisten en los corazones del ratón⁶ y el pez cebra¹⁸, pero no existen informes para los anfibios. Por lo tanto, el modelo de resección del ápice en X. tropicalis juega un papel importante en la elucidación de los mecanismos subyacentes a las respuestas regenerativas.

Protocolo

Todos los protocolos experimentales relacionados con X. tropicalis fueron aprobados por el Comité de Cuidado de Animales de la Universidad de Jinan.

1. Cirugía

1. Preparación preoperatoria: Mantenga listas tijeras oftálmicas, fórceps oftálmicos, pinzas con aguja, bolas absorbentes, papel de filtro y suturas/agujas quirúrgicas para la resección del ápice en los corazones de X. tropicalis. Consulte la Tabla de materiales para obtener información detallada. Antes de su uso, esterilice todos los instrumentos quirúrgicos en autoclave y prepare una cantidad adecuada de hielo para su uso futuro.
2. Anestesiar un adulto de X. tropicalis con tricaína colocándolo en 500 ml de solución de tricaína (1 mg/ml) a temperatura ambiente durante 4 min¹⁹, y luego colóquelo sobre una superficie de hielo en la mesa de operaciones para asegurarse de que la rana no se despierte durante el proceso operativo.
   PRECAUCIÓN: Todo el procedimiento requiere 5-10 min; el tiempo de anestesia no debe ser demasiado largo, de lo contrario el X. tropicalis puede no ser capaz de despertarse después de la operación.
3. Toracotomía
   1. Coloque el abdomen anestesiado de X. tropicalis hacia arriba, y cubra el abdomen de la rana con una gasa preempapada en agua destilada para evitar el secado de la piel del animal durante la operación.
   2. Presione suavemente el pecho con fórceps, encuentre el centro del pecho paralelo a la extremidad anterior inferior, levante la piel con tijeras oftálmicas y haga suavemente una pequeña incisión de ~ 1 cm. Usando tijeras oftálmicas, levante la capa muscular debajo de la piel y cree una herida en el músculo central del pecho. Como el corazón está ubicado en la posición superior del sitio de la herida, presione suavemente el tórax con los fórceps oftálmicos para exprimir el corazón de la herida.
      PRECAUCIÓN: Como la piel de X. tropicalis puede producir péptidos antimicrobianos, no es necesario emplear procedimientos de desinfección convencionales en el sitio quirúrgico de X. tropicalis. Cualquier desinfectante dañará la piel del X. tropicalis.
4. Resección del ápice ventricular
   1. Sujete suavemente el pericardio con fórceps y rompa suavemente con tijeras oftálmicas cerca del ápice del corazón. Espere a que el pericardio se desprenda debido al bombeo sanguíneo sistólico (Figura 1A, B).
   2. Sostenga la punta del corazón con fórceps en la mano no dominante y levante el corazón ligeramente de acuerdo con el ritmo de contracción cardíaca. Cuando el corazón se contrae para recircular la sangre a través de los vasos sanguíneos, corte rápidamente el ápice del corazón (~ 14% del ventrículo) (Figura 1C).
   3. Para asegurar que la cantidad de resección del ápice sea aproximadamente el 14% de todo el corazón, analice el peso del corazón (HW) y el área de superficie con o sin resección²⁰. Coloque el corazón en el pecho usando fórceps y una bola absorbente.
      NOTA: No presione el corazón directamente con los fórceps; de lo contrario, se perforarán otras partes del corazón.
5. Suturar la piel con una sutura de hilo quirúrgico no absorbente no sedoso 4-0 (Figura 1D). Tenga cuidado de evitar la sutura en la capa muscular para prevenir la mortalidad postoperatoria. Espere a que la herida de la piel sane naturalmente dentro de 1 semana después de la cirugía.
6. En el grupo de operación simulada, realizar la toracotomía, abrir el pericardio y suturar, sin realizar la resección del ápice.

2. Recuperación quirúrgica

1. Coloque el postoperatorio X. tropicalis con su abdomen hacia arriba en una placa de Petri que contenga una pequeña cantidad de agua desionizada (no inunde completamente al animal). Espere a que el X. tropicalis se despierte dentro de ~ 10 minutos.
2. Al recuperar la conciencia, observe la movilidad y la actividad del animal, así como la sutura de la herida durante la actividad. Transfiera las ranas que han recuperado su equilibrio a un recipiente lleno de agua pura para el cultivo. Reemplace el agua con agua pura todos los días para evitar la infección de la herida.
   NOTA: Con estas medidas, la tasa de supervivencia podría alcanzar ~90%. Un tiempo prolongado de anestesia y sangrado excesivo durante la cirugía conducen a la muerte, que generalmente ocurre el día de la cirugía.

3. Detección de la condición de reparación después de una lesión cardíaca

1. Recolectar los corazones de X. tropicalis en múltiples puntos de tiempo después de la cirugía.
   1. Después de anestesiar el X. tropicalis con tricaína, abra el abdomen y use fórceps para extirpar los otros órganos y tejidos internos para encontrar la ubicación del corazón.
      NOTA: Debido a la resección del ápice, es probable que el corazón se desarrolle junto con otros tejidos y órganos durante el proceso de reparación. A veces, se adhiere a la pared muscular y no es fácil de separar, por lo que debe manipularse con cuidado durante la recolección.
   2. Después de encontrar el corazón, use fórceps para arrancar suavemente los otros órganos del corazón. Despegue suavemente los otros tejidos que rodean el corazón para exponer el corazón. Use fórceps para levantar suavemente el corazón y córtelo con tijeras. Coloque el corazón inmediatamente en PBS para eliminar cualquier resto de sangre y fotografíelo con un estereoscopio para su documentación (Figura 2).
2. Deshidratación de gradiente
   1. Seque los corazones con papel de filtro para secar el exceso de residuos de PBS y colóquelos en una placa de cultivo celular de 24 pocillos. Use 1-2 ml de paraformaldehído al 4% para reparar los tejidos del corazón durante la noche. Al día siguiente, realice la deshidratación de etanol. Primero, use etanol al 70% durante la noche, seguido de etanol al 80%, etanol al 90% y etanol al 100% para la deshidratación del gradiente (1 h cada vez). Repita el uso de etanol 100% tres veces.
3. Incrustación de parafina
   1. Tratar el tejido cardíaco deshidratado con xileno durante 6-8 min. Colocar el tejido tratado con xileno en un recipiente de vidrio lleno de cera de parafina a 65 °C durante 2-3 h.
      NOTA: Es esencial evitar las burbujas de aire, ya que afectan a la sección durante el proceso de incrustación.
4. Congelar el tejido incrustado a -20 °C durante 1 h y seccionarlo.
5. Después de seccionar el corazón, realice las técnicas estándar de hematoxilina y eosina (H&E) y tinción tricrómica de Masson en las secciones¹¹.

Resultados

Los corazones se recolectaron a 0 dpr, 7 dpr, 14 dpr y 30 dpr. El análisis morfológico reveló que el coágulo de sangre causado por la lesión cardíaca desapareció a 30 dpr (Figura 2). Al mismo tiempo, la apariencia de los corazones a 30 dpr en el grupo de resección fue similar a la de los corazones en el grupo de operación simulada; no había heridas evidentes (Figura 2). Después de la resección apical, se formó un coágulo de sangre y selló la herid...

Discusión

La resección apical, que implica la amputación quirúrgica del ápice del corazón, ha sido descrita en peces cebra y ratones ^6,18; sin embargo, esto no ha sido descrito en X. tropicalis. Este informe describe un modelo creíble de lesión cardíaca y demuestra que el corazón de X. tropicalis adulto puede regenerarse completamente después de la resección apical sin dejar cicatrices. Sin embargo, es necesario mejorar algunas deficiencias y p...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetic acid	GHTECH	64-19-7-500ml
Acid Alcohol Fast Differentiation Solution	Beyotime	C0163M
Acid Fuchsin	aladdin	A104916
Alcohol Soluble Eosin Y Stainin Solution	Servicebio	G1001-500ML
BioReagent	Beyotime	ST2600-100g
Ethanol absolute	Guangzhou Chemical Reagent Factory	HB15-GR-0.5L
Hematoxylin Stain Solution	Servicebio	G1004-500ML
Neutral balsam	Solarbio	G8590
Operating Scissors	Prosperich	HC-JZ-YK-Z-10cm
Paraffins	Leica	39601095
Para-formaldehyde Fixative	Servicebio	G1101-500ML
Phosphate Buffered Saline (PBS) powder	Servicebio	G0002-2L
Phosphomolybdic acid hydrate	Macklin	P815551
Stereo microscope	Leica
surgical forceps	ChangZhou	zfq-11-btjw
Surgical Suture	HUAYON	18-5140
Tricaine	Macklin
Xylene	Guangzhou Chemical Reagent Factory	IC02-AR-0.5L