تقييم الموجات فوق الصوتية غير الغازية لتطور سرطان بطانة الرحم في الحذف الموجه Pax8 لمثبطات الورم Arid1a و Pten في الفئران

Summary

يصف هذا البروتوكول طريقة لمراقبة تطور التغيرات المورفولوجية بمرور الوقت في الرحم في نموذج فأر محفز لسرطان بطانة الرحم باستخدام التصوير بالموجات فوق الصوتية مع الارتباط بالتغيرات الإجمالية والنسيجية.

Abstract

يمكن دراسة سرطانات الرحم في الفئران بسبب سهولة التعامل والتلاعب الجيني في هذه النماذج. ومع ذلك ، غالبا ما تقتصر هذه الدراسات على تقييم علم الأمراض بعد الوفاة في الحيوانات التي تم قتلها رحيما في نقاط زمنية متعددة في مجموعات مختلفة ، مما يزيد من عدد الفئران اللازمة للدراسة. يمكن لفئران التصوير في الدراسات الطولية تتبع تطور المرض في الحيوانات الفردية ، مما يقلل من عدد الفئران اللازمة. سمحت التطورات في تكنولوجيا الموجات فوق الصوتية بالكشف عن التغيرات على مستوى الميكرومتر في الأنسجة. تم استخدام الموجات فوق الصوتية لدراسة نضوج الجريب في المبايض ونمو الطعم الأجنبي ولكن لم يتم تطبيقه على التغيرات المورفولوجية في رحم الفأر. يفحص هذا البروتوكول تجاور علم الأمراض مع مقارنات التصوير في الجسم الحي في نموذج فأر سرطان بطانة الرحم المستحث. كانت الميزات التي لوحظت بواسطة الموجات فوق الصوتية متسقة مع درجة التغيير التي شوهدت من قبل علم الأمراض الإجمالي والأنسجة. تم العثور على الموجات فوق الصوتية لتكون تنبؤية للغاية من علم الأمراض المرصودة ، ودعم دمج الموجات فوق الصوتية في الدراسات الطولية لأمراض الرحم مثل السرطان في الفئران.

Introduction

تظل الفئران واحدة من أهم النماذج الحيوانية للاضطرابات التناسلية^1،2،3. هناك العديد من نماذج القوارض المعدلة وراثيا أو المستحثة لسرطانات المبيض والرحم. تعتمد هذه الدراسات عادة على مجموعات متعددة تم قتلها رحيما في نقاط زمنية مختلفة لالتقاط الاتجاهات الطولية في التغيرات المورفولوجية والمرضية. هذا يمنع القدرة على الحصول على بيانات مستمرة عن تطور السرطان في الماوس الفردي. بالإضافة إلى ذلك ، دون معرفة حالة تطور مرض الفئران الفردية ، تستند دراسات التدخل إلى نقاط زمنية محددة مسبقا ومتوسط نتائج الأفواج السابقة بدلا من العتبات الفردية للكشف عن التقدم في^{معين 4,5}. لذلك ، هناك حاجة إلى مناهج التصوير التي تسمح بالتقييم الطولي في الحيوانات الحية لتسهيل النماذج قبل السريرية لاختبار الأدوية أو المركبات الجديدة وتسريع فهم البيولوجيا المرضية مع زيادة الدقة والتكاثر⁶.

يعد التصوير بالموجات فوق الصوتية (الولايات المتحدة) طريقة جذابة للمراقبة الطولية لتطور سرطان رحم الفأر لأنه سهل نسبيا وغير مكلف مقارنة بطرق التصوير الأخرى ، وسهل الأداء ، ويمكن أن يكون له دقة رائعة ^6,7. يمكن لهذه الطريقة غير الغازية التقاط الميزات على مقياس ميكرون في الفئران المستيقظة أو مع الفئران تحت التخدير القصير باستخدام اختبار 5-10 دقائق. تم التحقق من صحة الفحص المجهري بالموجات فوق الصوتية كطريقة لقياس تطور جريب مبيض الفأر ⁸ ونمو الأورام المزروعة أو المستحثة⁹،^10،11. كما تم استخدام الولايات المتحدة عالية التردد للحقن داخل الرحم عن طريق الجلد¹² ومراقبة تغير رحم الفئران خلال دورة الشبق¹³. يمكن استخدام الولايات المتحدة عالية التردد مع الفئران الموجودة على منصات ثابتة متخصصة باستخدام نظام السكك الحديدية لعقد محول الطاقة / المسبار لالتقاط صور عالية الدقة مع وضع وضغط قياسيين ؛ ومع ذلك ، فإن هذه المعدات غير متوفرة في جميع المؤسسات. يمكن اعتماد طرق مسح محول الطاقة المحمولة باليد مع معدات أقل تكريسا واستخدامها لكل من التشخيص السريري والتطبيقات البحثية في الفئران.

ويبقى السؤال حول ما إذا كان يمكن استخدام التصوير الأمريكي باستخدام مجسات عالية التردد محمولة باليد لمراقبة تطور سرطان الرحم على مدى عدة أسابيع. على غرار الأمعاء ، فإن رحم القوارض عبارة عن بنية نحيلة رقيقة الجدران متحركة للغاية داخل البطن ومتجاورة عبر أعماق الأنسجة المتعددة ، مما يجعل التصوير أكثر صعوبة من الأعضاء غير المتحركة نسبيا مثل الكلى. سعت هذه الدراسة إلى إثبات العلاقة بين الأنسجة التي لوحظت بواسطة الموجات فوق الصوتية وعلم أمراض الأنسجة ، وتحديد معالم لتحديد موقع رحم الفأر ، وتحديد جدوى التقييم الطولي لسرطان بطانة الرحم. تقدم هذه الدراسة بيانات تظهر تطابقا نوعيا بين ظهور الرحم الذي تم تصويره بواسطة الولايات المتحدة وعلم أمراض الأنسجة ، بالإضافة إلى التصوير التسلسلي للفئران على مدى عدة أسابيع. تشير هذه النتائج إلى أنه يمكن استخدام الولايات المتحدة المحمولة باليد لمراقبة تطور سرطان بطانة الرحم في الفئران ، مما يخلق فرصة لجمع البيانات الطولية الفردية للفأر لدراسة سرطان الرحم دون الحاجة إلى معدات مخصصة.

Protocol

تم تنفيذ جميع الإجراءات والتجارب التي شملت الفئران وفقا للبروتوكولات المعتمدة من قبل لجنة جونز هوبكنز لرعاية واستخدام الحيوان. بالنسبة لجميع الإجراءات ، تم ارتداء معدات الوقاية الشخصية المناسبة ، بما في ذلك القفازات وأردية العزل التي تستخدم لمرة واحدة. تم اتخاذ الاحتياطات عند التعامل مع الأدوات الحادة ، والتي تم التخلص منها بشكل صحيح في حاويات الأدوات الحادة ذات الصندوق الأحمر مباشرة بعد الاستخدام. انظر جدول المواد للحصول على تفاصيل حول جميع المواد والمعدات المستخدمة في هذا البروتوكول.

1. تحريض سرطان بطانة الرحم في الفئران iPAD ( Pten المحرض ، Arid1a الحذف المزدوج) مع الدوكسيسيكلين

1. الحفاظ على 10 Pax8-Cre-Arid1a-Pten الفئران المعدلة وراثيا (iPAD) (الشكل 1) على خلفية وراثية مختلطة (129S ، BALB / C ، C57BL / 6) ، كما هو موضح سابقا¹⁴.
2. اجمع صور خط الأساس بالموجات فوق الصوتية (2D) للمبيض وقناة البيض والرحم لكل فأر قبل العلاج بالدوكسيسيكلين.
3. توفير وجبات تشاو تحتوي على الدوكسيسيكلين حصريا (دوكسيسيكلين هيكلات عند 625 مجم / كجم من العلف) لإناث الفئران iPAD لمدة لا تقل عن 2 أسابيع بدءا من 7-8 أسابيع من العمر للحث على حذف الجينات.

2. إعداد المعدات

1. قم بتشغيل وسادة التدفئة ، وقم بتغطيتها بوسادة ماصة نظيفة (درجة الحرارة المستهدفة: 38 درجة مئوية).
2. تأكد من ملء مبخر الأيزوفلوران وخزان O₂ بشكل كاف. أعد التعبئة واستبدل إذا كانت المحتويات منخفضة.
3. قم بتوصيل غرفة الحث ومخروط الأنف ونظام الكسح بالمبخر.
4. قم بإعداد جهاز الموجات فوق الصوتية.
   1. حدد محول (مسبار) بمدى 32-56 ميجاهرتز أو حتى 70 ميجاهرتز لتصوير الرحم أو المبيض ، على التوالي.
   2. قم بتوصيل المسبار والطاقة على الجهاز.
   3. بعد تمهيد النظام ، استخدم لوحة التحكم لتسجيل الدخول باستخدام بيانات اعتماد المستخدم والوصول إلى الشاشة الرئيسية.
   4. من الشاشة الرئيسية ، انتقل إلى علامة التبويب التطبيقات ، وحدد وضع الماوس (الصغير) في البطن.
   5. انقر فوق مسح ضوئي للعودة إلى الشاشة الرئيسية ، وانتظر حتى يتم عرض صورة حية.
   6. حدد B-Mode من الخيارات الموجودة على شريط الأدوات الأيسر.
   7. انقر فوق المزيد من عناصر التحكم لعرض أدوات إضافية لتحسين الصورة ، مثل اكتساب الصورة وعمقها ، أو لضبط إعدادات الحصول على المقطع ، مثل عدد الإطارات في الثانية.
   8. بمجرد تحديد إعدادات الصورة ، ارجع إلى الشاشة الرئيسية بالنقر فوق مسح ضوئي.
5. قم بتشغيل خزان O₂ ، وقم بتوجيه التدفق إلى غرفة الحث ، واضبط معدل التدفق على 1 لتر / دقيقة.

3. إعداد الفئران للفحص بالموجات فوق الصوتية ، بما في ذلك إزالة الشعر

1. ضع الماوس في غرفة الحث. اضبط مبخر الأيزوفلوران على 2٪ -3٪ حجم / حجم لتحريض التخدير.
2. تحديد عمق التخدير المناسب من خلال عدم الاستجابة لقرصة إصبع القدم ومعدل التنفس حوالي 1-2 أنفاس / ثانية.
3. ضع مادة تشحيم العيون المعقمة على كل عين. قم بإزالة الفراء من الظهر والبطن بين الضلع الأخير والحوض باستخدام كليبرز بحجم مناسب.
4. ضع طبقة رقيقة من كريم مزيل الشعر على المناطق البطنية والظهرية ليتم تصويرها (إذا لزم الأمر).
5. ضع الفأرة مرة أخرى في غرفة الحث لمدة 3-5 دقائق تقريبا للحفاظ على عمق التخدير المناسب بينما يعمل كريم مزيل الشعر على إزالة الشعر. بعد ≤4 دقيقة ، امسح الكريم برفق بمنشفة ورقية رطبة نظيفة.
   ملاحظة: التعرض لفترة أطول لكريم مزيل الشعر أمر مزعج وقد يسبب آفات جلدية.

4. حقن السائل داخل الصفاق لزيادة التباين بين الأعضاء

1. قم بتسخين حقنة سعة 3-10 مل مملوءة بمحلول سائل متساوي التوتر معقم (على سبيل المثال ، محلول كلوريد الصوديوم المعقم 0.9٪ أو محلول رنين الرضاعة) إلى 35-40 درجة مئوية عن طريق وضعه بين وسادة تسخين ووسادة ماصة لعدة دقائق. ضع زجاجة من جل الموجات فوق الصوتية على وسادة التدفئة إذا لم يكن الجهاز يحتوي على جهاز تدفئة.
2. للحصول على ماوس 20-25 جم ، قم بحقن 1-2 مل من المحلول في التجويف البريتوني.
   1. تأمين الماوس من القفا في يد واحدة ، وفضح البطن.
   2. امسك الماوس بزاوية ~ 20 درجة ، مع توجيه الأنف إلى الأرض لتوجيه الأعضاء بشكل جمجمي بسبب الجاذبية.
   3. باستخدام إبرة قياس صغيرة (25 جم ، 5/8 في الطول ، حقنة السلين) ، ثقب من خلال الجلد وجدار البطن من الربع الأيمن الذيلي من البطن.
   4. قبل حقن السوائل ، لتجنب الحقن في الأوعية الدموية أو الجهاز الهضمي ، اسحب بأقل قدر من الضغط. إذا دخل الدم أو أي مادة أخرى إلى المحقنة ، فقم بإزالة الإبرة. استخدم إبرة ومحقنة جديدة ، وحاول مرة أخرى في وضع مختلف قليلا.
3. إذا استيقظ الفأر أثناء الحقن ، ضعه مرة أخرى في غرفة الحث الصغيرة للتخدير باستخدام 2٪ -3٪ حجم / حجم إيزوفلوران.

5. التصوير بالموجات فوق الصوتية من النهج الظهري

1. ضع الماوس في الاستلقاء البطني على وسادة الامتصاص فوق وسادة التدفئة (الشكل 2A-C).
2. ضع مخروط أنف القوارض بإحكام على أنف الفأر وكمامة. الحفاظ على عمق التخدير مع إيزوفلوران تسليمها من خلال مخروط الأنف في 1٪ -2٪ حجم / حجم في 100٪ O₂. ضع مادة تشحيم العيون المعقمة ، حسب الحاجة ، على كل عين.
3. راقب الماوس للحصول على معدل تنفس منتظم (1-2 / ثانية) وعدم استجابة قرصة إصبع القدم للإشارة إلى ما إذا كان التخدير بحاجة إلى تعديل.
4. ضع كمية صغيرة (~ 0.5-1 مل) من هلام الموجات فوق الصوتية المسخن مسبقا (الجانبي) على العمود الفقري على جانبي الفأر المخدر ، بين الضلع الأخير والحوض.
5. ضع كمية صغيرة من الجل على مسبار الموجات فوق الصوتية.
6. ضع المسبار بالتوازي مع الفقرات مع مقدمة المسبار على جانب الجمجمة. توجد علامة مؤشر على رأس المسبار للإشارة إلى الاتجاه الصحيح للمسبار. سجل اليوم والوقت ومعرف الحيوان واتجاه المسبار وجانب الحيوان (اليمين واليسار والظهر والبطن) لكل مجموعة جديدة من الصور التي يتم جمعها.
7. باستخدام فأر في الاستلقاء البطني (الجلد الظهري يلامس المسبار) ، امسح المنطقة ببطء بحثا عن معلم الكلى (الشكل 2 ب والشكل 3). مع وضع الكلى في العرض ، اسحب المسبار الذيلي للعثور على المبيض - وهو شكل بيضاوي مفرط الصدى قليلا إلى هيكل دائري (الشكل 4 أ ، ب) داخل وسادة دهنية مبيضة مفرطة الصدى للغاية تحدها الكلية القحفية البطنية والظهرية الجانبية جدار البطن الظهري.
   ملاحظة: الضغط الذيلي والجانبي للمبيض يمكن أن يوجه المبيض أقرب إلى جدار البطن وبعيدا عن حلقات الأمعاء. يتم وضع المبيض تشريحيا مقابل جدار البطن الظهري ، فقط البطني والجانبي للعضلات المحورية والذيلية إلى الكلى.
8. اضبط كسب الإشارة باستخدام شريط التمرير الموجود أسفل شاشة التحكم لتحسين تباين الصورة.
9. لتحسين تصوير الكلى ، اضغط بإصبعك على البطن المقابل. قم بتغيير الضغط والزاوية من موازية مباشرة للعمود الفقري إلى ~ 20 درجة بطنية.
10. بمجرد عرض الجهاز محل الاهتمام ، اجمع مقطع فيديو بالنقر فوق حفظ مقطع أو بدء التسجيل ثم إيقاف التسجيل عند الانتهاء للاحتفاظ بالصور بعدد محدد مسبقا من الإطارات.
11. احفظ إطارات مفردة من صورة مباشرة أو تسجيل باستخدام زر حفظ الإطار .
12. لتصوير الرحم ، اسحب المسبار ذيليا حتى يصبح المبيض في الجانب الأكثر جمجمة من مجال الرؤية. قم بتغيير ضغط المسبار وزاويته حتى يصبح الرحم في الأفق.
13. كرر جمع الفيديو والإطار لكل جهاز مهم.
14. ابحث عن الرحم الذي يمتد طوليا على طول جدار البطن الظهري مع وجود عضلات الساق الجانبية أيضا في العرض (الشكل 4 ب).
    ملاحظة: قد يختلف حجم الرحم وقطر التجويف باختلاف مرحلة الشبق وحالة المرض.
15. مراقبة الأنسجة للحركة التمعجية لتمييز الحلقات المعوية عن قرون الرحم الثابتة.

6. جمع الصور من النهج البطني

1. ضع الفأر في الاستلقاء الظهري ، وتأكد من أن تزييت العين كاف وأن الكمامة مثبتة بإحكام في مخروط الأنف (الشكل 2 أ).
2. ضع كمية صغيرة (~ 0.5-1 مل) من جل الموجات فوق الصوتية المسخن مسبقا على البطن البطني ، وقم بتطبيق المسبار عند خط الوسط فقط في الجمجمة من العانة لتحديد موقع المثانة كمعلم ناقص الصدى (الشكل 5).
   ملاحظة: إذا كانت المثانة كبيرة جدا وتحجب تصوير الرحم ، فيمكن وضع ضغط لطيف على أسفل البطن للتعبير عن البول.
3. اسحب المسبار الجانبي إلى المثانة للعثور على قرون الرحم. قم بتطبيق ضغط رقمي خفيف من أي من جانبي الماوس أو كليهما لإدخال الأبواق في مجال الرؤية. أمسك المسبار بشكل عمودي على الماوس ، وامسح جانبي البطن لالتقاط مناظر عرضية (مقاطع عرضية) لكلا القرنين. قم بتدوير المسبار لالتقاط طرق العرض السهمية.
4. بعد الموجات فوق الصوتية ، امسح الماوس نظيفا من الجل بمنشفة ورقية ، وأعده إلى قفصه للتعافي. الفئران مستيقظة تماما في 2-5 دقائق. بمجرد أن يكون مستيقظا تماما ومتنقلا ، أعد الماوس إلى غرفة الحيوانات.
   ملاحظة: يمكن وضع وسادة تدفئة على نار خفيفة أسفل القفص لتدفئة القفص للتعافي.
5. عند نقطة النهاية التجريبية أو الإنسانية ، القتل الرحيم للماوس. من الناحية المثالية ، القتل الرحيم للفأر في قفص المنزل لتقليل التوتر ؛ بدلا من ذلك ، ضع الماوس في غرفة نظيفة. تسليم CO 2 المضغوط_بمعدل إزاحة 10٪ -30٪ من حجم الغرفة في الدقيقة. بعد حوالي 5 دقائق من عدم وجود تنفس مرئي ، تحقق من الوفاة عن طريق خلع عنق الرحم. المضي قدما في تشريح البطن لحصاد الورم.

النتائج

تم الحفاظ على الفئران المعدلة وراثيا Pax8-Cre-Arid1a-Pten (iPAD) على خلفية وراثية مختلطة (129S ، BALB / C ، C57BL / 6) ، كما هو موضح سابقا¹⁴. تم تغذية جميع الفئران تغذية الدوكسيسيكلين لمدة 2 أسابيع للحث على Cre recombinase. في العمل السابق من قبل مجموعتنا ، تم تناول الدوكسيسيكلين بواسطة gavage

Discussion

يفحص هذا البروتوكول فائدة الموجات فوق الصوتية لتقييم التغيرات المورفولوجية الرحمية في تطور السرطان الغدي في الرحم في الفئران. في هذه الدراسة ، من خلال اتباع تحريض سرطان بطانة الرحم في الفئران طوليا ، تم العثور على التفاصيل التشريحية المكتشفة بواسطة الموجات فوق الصوتية لتكون مؤشرات على ع...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents and Equipment Used for Animal Care
Rodent Diet (2018, 625 Doxycycline)	Envigio	TD.01306	Mouse Feed
Reagents and Equipment Used for Ultrasound Imaging
10 mL injectable 0.9% NaCl	Hospira, Inc	RL-7302	Isotonic Fluid
Absorbent Pad with Plastic Backing	Daigger	EF8313	Absorbant Pads
Anesthesia Induction Chambers	Harvard Apparatus	75-2029	Induction Chamber
Anesthetic absorber kit with absorber canister, holder, tubing, & adapters	CWE, Inc	13-20000	Nose Cone and Tubing
Aquasonic Clear Ultrasound Gel (0.25 Liter)	Parker Laboratoies	08-03	Ultrasound Gel
BD Plastipak 3 mL Syringe	BD Biosciences	309657	Syringe
F/Air Scavenger Charcoal Canister	OMNICON	80120	Scavenging System for Anesthesia
Isoflurane, USP	Vet One	502017	Anesthesia Agent
M1050 Non-Rebreathing Mobile Anesthesia Machine	Scivena Scientific	M1050	Anestheic Vaporizer
MX550S, 25-55 MHz Transducer, 15mm, Linear	VisualSonics	MX550S	Ultrasound Transducer (Probe)
Nair Hair Aloe & Lanolin Hair Removal Lotion - 9.0 oz	Nair		Depilliating Cream
Philips Norelco Multigroomer All-in-One Trimmer Series 7000	Philips North America	MG7750	Clippers
PrecisionGlide 25 G 1" Needle	BD Biosciences	305125	Needle
Puralube Ophthalmic Ointment	Dechra	17033-211-38	Lubricating Eye Drops
Vevo 3100 Imaging System	VisualSonics	Vevo 3100	Ultrasound Machine
Vevo LAB 5.6.1	VisualSonics	Vevo LAB 5.6.1	Ultrasound Analysis Software
Vinyl Heating Pad with cover, 12 x 15"	Sunbeam	731-500-000R	Heating Pad
Wd Elements 2TB Basic Storage	Western Digital Elements	WDBU6Y0020BBK-WESN	Data Storage
Reagents and Equipment Used for Immunohistochemistry
10% w/v Formalin	Fischer Scientific	SF98-4	Tissue Fixation Buffer
Animal-Free Blocker and Diluent, R.T.U.	Vector Laboratories Inc.	SP5035	Antibody Blocker
Charged Super Frost Plus Glass Slides	VWR	4831-703	Tissue Mounting Slides
Citrate Buffer	MilliporeSigma	C9999-1000ML	Epitope Retrival Buffer (pTEN)
Cytoseal – 60	Thermo Scientific	8310-4	Resin for Slide Sealing
Gold Seal Cover Glass	Thermo Scientific	3322	Coverslide
Harris Modified Hematoxylin	MilliporeSigma	HHS32-1L	Counterstain Buffer
Hybridization Incubator (Dual Chamber)	Fischer Scientific	13-247-30Q	Oven to Melt Parraffin
ImmPACT DAB Substrate, Peroxidase (HRP)	Vector Laboratories Inc.	SK-4105	Signal Development Substrate
ImmPRESS HRP Goat Anti-Rabbit IgG Polymer Detection Kit, Peroxidase	Vector Laboratories Inc.	MP-7451	Secondary IHC Antibody
Oster 5712 Digital Food Steamer	Oster	5712	Vegetable Steamer for Epitope Retrival
rabbit mAB anti-ARID1a	abcam	ab182560	Primary IHC Antibody (1:1,000)
rabbit mAB anti-PTEN	Cell Signaling	9559	Primary IHC Antibody (1:100)
Scotts Tap Water Substitute	MilliporeSigma	S5134-100ML	"Blueing" Buffer
Tissue Path IV Cassette	Fischer Scientific	22272416	Tissue Fixation Cassette
Trilogy Buffer	Cell Marque	920P-10	Epitope Retrival Buffer (ARID1a)