마우스에서 종양 억제인자 Arid1a 및 Pten 의 Pax8 지시 결실에서 자궁내막암 진행의 비침습적 초음파 평가

요약

이 프로토콜은 전체 및 조직학적 변화와 상관관계가 있는 초음파 영상을 사용하여 자궁내막암의 유도성 마우스 모델에서 시간 경과에 따른 형태학적 변화의 진행을 모니터링하는 방법을 설명합니다.

초록

자궁암은 이러한 모델에서 취급 및 유전자 조작의 용이성으로 인해 생쥐에서 연구될 수 있습니다. 그러나 이러한 연구는 종종 다른 코호트에서 여러 시점에서 안락사된 동물의 사후 병리를 평가하는 것으로 제한되며, 이는 연구에 필요한 마우스의 수를 증가시킵니다. 종단 연구에서 이미징 마우스는 개별 동물의 질병 진행을 추적하여 필요한 마우스의 수를 줄일 수 있습니다. 초음파 기술의 발전으로 조직의 마이크로미터 수준의 변화를 감지할 수 있게 되었습니다. 초음파는 난소의 난포 성숙과 이종 이식 성장을 연구하는 데 사용되었지만 마우스 자궁의 형태학적 변화에는 적용되지 않았습니다. 이 프로토콜은 유도된 자궁내막암 마우스 모델에서 병리학과 생체 내 이미징 비교의 병치를 조사합니다. 초음파로 관찰된 특징은 육안적 병리학 및 조직학에서 볼 수 있는 변화의 정도와 일치했습니다. 초음파는 관찰 된 병리를 매우 예측하는 것으로 밝혀졌으며, 생쥐의 암과 같은 자궁 질환의 종단 연구에 초음파 검사의 통합을 지원합니다.

서문

마우스는 생식 장애에 대한 가장 중요한 동물 모델 중 하나이다 ^1,2,3. 난소암과 자궁암의 여러 유전자 변형 또는 유도 설치류 모델이 있습니다. 이러한 연구는 일반적으로 형태학적 및 병리학적 변화의 종단적 경향을 포착하기 위해 서로 다른 시점에서 안락사된 여러 코호트에 의존합니다. 이것은 개별 마우스에서 암 발병에 대한 지속적인 데이터를 획득하는 능력을 방지합니다. 추가적으로, 개별 마우스의 질병 진행 상태를 알지 못하면, 개입 연구는 특정 동물에서 진행을 검출하기 위한 개별 역치보다는 미리 결정된 시점과 이전 코호트의 평균 소견을 기반으로 한다 ^4,5. 따라서 신약 또는 화합물 테스트를 위한 전임상 모델을 용이하게 하고 병리학에 대한 이해를 가속화하는 동시에 엄격함과 재현성을 높이기 위해 살아있는 동물에서 종단적 평가를 허용하는 이미징 접근법이 필요합니다⁶.

초음파 영상(US)은 다른 영상 방법에 비해 상대적으로 쉽고 저렴하며 수행하기 쉽고 놀라운 해상도를 가질 수 있기 때문에 마우스 자궁암 진행의 종단 모니터링에 매력적인 방법입니다 ^6,7. 이 비침습적 방식은 깨어 있는 생쥐 또는 5-10분 검사를 사용하여 짧은 진정 상태에서 생쥐에서 미크론 규모의 특징을 포착할 수 있습니다. 초음파 현미경은 마우스 난포 발달 ⁸ 및 이식 또는 유도된 신생물의 성장을 측정하는 방법으로 검증되었다 9,10,11. 고주파 US는 또한 경피적 자궁내 주사¹² 및 발정 주기¹³ 동안 쥐의 자궁 변화 관찰에 사용되었다. 고주파 US는 표준화된 위치와 압력으로 고해상도 이미지를 캡처하기 위해 변환기/프로브를 고정하는 레일 시스템을 사용하여 특수 고정 플랫폼에 고정된 마우스와 함께 사용할 수 있습니다. 그러나 이 장비는 모든 기관에서 사용할 수 있는 것은 아닙니다. 휴대용 변환기 스캐닝 방법은 덜 전용 장비로 채택할 수 있으며 마우스의 임상 진단 및 연구 응용 프로그램 모두에 사용할 수 있습니다.

휴대용 고주파 프로브를 사용한 미국 이미징을 사용하여 여러 주에 걸쳐 자궁암 발병을 모니터링할 수 있는지 여부에 대한 의문이 남아 있습니다. 내장과 유사하게 설치류 자궁은 복부 내에서 매우 움직이고 여러 조직 깊이를 통해 인접해 있는 얇고 가느다란 구조로 신장과 같이 상대적으로 움직이지 않는 기관보다 이미징이 더 어렵습니다. 이 연구는 초음파로 관찰된 조직과 조직병리학 사이의 상관관계를 확립하고, 마우스 자궁을 찾기 위한 랜드마크를 정의하고, 자궁내막암의 종단적 평가의 타당성을 결정하고자 했습니다. 이 연구는 미국에 의해 이미지화된 자궁의 모양과 조직 병리학 사이의 질적 일치를 보여주는 데이터와 몇 주에 걸친 마우스의 연속 이미징을 보여줍니다. 이러한 결과는 휴대용 US가 마우스의 자궁내막암 발병을 모니터링하는 데 사용될 수 있음을 나타내며, 따라서 전용 장비 없이 자궁암을 연구하기 위해 개별 마우스 종단 데이터를 수집할 수 있는 기회를 제공합니다.

프로토콜

마우스를 포함하는 모든 절차 및 실험은 존스 홉킨스 동물 관리 및 사용 위원회에 의해 승인된 프로토콜에 따라 수행되었다. 모든 절차에 대해 장갑과 일회용 격리 가운을 포함하여 적절한 PPE를 착용했습니다. 날카로운 물건을 취급할 때 예방 조치를 취했으며, 사용 직후 빨간색 상자 날카로운 물건 용기에 적절하게 폐기했습니다. 이 프로토콜에 사용된 모든 재료 및 장비에 대한 자세한 내용은 재료 표를 참조하십시오.

1. 독시사이클린을 이용한 iPAD(inducible Pten, Arid1a double deletion) 마우스에서 자궁내막암 유도

1. 앞서 설명한 대로 혼합 유전적 배경(129S, BALB/C, C57BL/6)에서 10마리의 Pax8-Cre-Arid1a-Pten 이중 결실(iPAD) 형질전환 마우스(그림 1)를 유지합니다¹⁴.
2. 독시사이클린 치료 전에 각 마우스의 난소, 난관 및 자궁의 기본 초음파(2D) 이미지를 수집합니다.
3. 유전자 결실을 유도하기 위해 7-8주령부터 최소 2주 동안 암컷 iPAD 마우스에 독점적으로 독점적으로 감소시킨 독시사이클린 하이클레이트 사료 7-8주령부터 시작하여 최소 2주 동안 암컷 iPAD 마우스에 제공합니다.

2. 장비 설정

1. 가열 패드를 켜고 깨끗한 흡수 패드로 덮습니다(목표 온도: 38°C).
2. 이소플루란 기화기와 O₂ 탱크가 적절하게 채워졌는지 확인하십시오. 내용물이 부족하면 다시 채우고 교체하십시오.
3. 유도 챔버, 노즈 콘 및 청소 시스템을 기화기에 연결합니다.
4. 초음파 기계를 설치합니다.
   1. 자궁 또는 난소 이미징을 위해 각각 32-56MHz 또는 최대 70MHz 범위의 변환기(프로브)를 선택하십시오.
   2. 프로브를 부착하고 기기의 전원을 켭니다.
   3. 시스템 부팅 후 제어판을 사용하여 사용자 자격 증명으로 로그인하고 홈 화면에 액세스합니다.
   4. 홈 화면에서 Applications(응용 프로그램 ) 탭으로 이동하여 Mouse (small) abdomen mode(마우스(작은) 복부 모드)를 선택합니다.
   5. 스캔을 클릭하여 홈 화면으로 돌아가 라이브 이미지가 표시될 때까지 기다립니다.
   6. 왼쪽 도구 모음의 옵션에서 B 모드를 선택합니다.
   7. 추가 컨트롤을 클릭하여 이미지 게인 및 심도와 같은 이미지 미세 조정을 위한 추가 도구를 보거나 초당 프레임 수와 같은 클립 획득 설정을 조정합니다.
   8. 이미지 설정이 선택되면 스캔을 클릭하여 홈 화면으로 돌아갑니다.
5. O₂ 탱크를 켜고 유량을 유도실로 향하게 하고 유량을 1L/min으로 설정합니다.

3. 제모를 포함한 초음파 스크리닝을 위한 마우스의 준비

1. 유도 챔버에 마우스를 놓습니다. 마취 유도를 위해 이소플루란 기화기를 2%-3% vol/vol로 설정합니다.
2. 발가락 꼬집음에 대한 반응 부족과 약 1-2회 호흡/초의 호흡수로 적절한 마취 깊이를 결정합니다.
3. 멸균 안과 윤활제를 각 눈에 바릅니다. 적절한 크기의 가위로 마지막 갈비뼈와 골반 사이의 등쪽과 복부에서 털을 제거합니다.
4. 이미지를 촬영할 복부 및 등쪽 부위에 제모 크림을 얇게 바르십시오(필요한 경우).
5. 제모 크림이 모발을 제거하는 동안 적절한 마취 깊이를 유지하기 위해 마우스를 약 3-5분 동안 유도 챔버에 다시 넣습니다. ≤4분 후 깨끗하고 촉촉한 종이 타월로 크림을 부드럽게 닦아냅니다.
   알림: 제모 크림에 장시간 노출되면 자극적이며 피부 병변을 유발할 수 있습니다.

4. 장기 간의 대비를 높이기 위해 체액을 복강 주사합니다.

1. 멸균 등장성 유체 용액(예: 멸균 0.9% NaCl 또는 젖산 링거 용액)으로 채워진 3-10mL 주사기를 가열 패드와 흡수 패드 사이에 몇 분 동안 배치하여 35-40°C로 따뜻하게 합니다. 기계에 워머가 없는 경우 가열 패드에 초음파 젤 한 병을 놓습니다.
2. 20-25g 마우스의 경우 1-2mL의 용액을 복강에 주입합니다.
   1. 한 손으로 스크러프를 잡고 복부를 노출시킵니다.
   2. 마우스를 ~20° 각도로 잡고 코가 바닥을 향하도록 하여 중력으로 인해 장기를 두개골로 향하게 합니다.
   3. 작은 게이지 바늘 (25G, 길이 5/8, 투베르쿨린 주사기)을 사용하여 복부의 꼬리 오른쪽 사분면의 피부와 복벽을 뚫습니다.
   4. 체액을 주입하기 전에 혈관 구조나 위장관에 주입되는 것을 방지하려면 최소한의 압력으로 뒤로 당깁니다. 혈액이나 다른 물질이 주사기에 들어가면 바늘을 제거하십시오. 새 바늘과 주사기를 사용하고 약간 다른 위치에서 다시 시도하십시오.
3. 주사 중에 마우스가 깨어나면 2%-3% vol/vol 이소플루란으로 마취를 위해 작은 유도 챔버에 다시 넣습니다.

5. 등쪽 접근에서 초음파 영상

1. 가열 패드 위의 흡수 패드에 복부 누운 상태로 마우스를 놓습니다(그림 2A-C).
2. 설치류 노즈 콘을 마우스의 코와 위에 단단히 놓습니다. 노즈 콘을 통해 전달되는 이소플루란으로 마취 깊이를 100% O 2에서 1%-₂% vol/vol로 유지합니다. 필요에 따라 멸균 안과용 윤활제를 각 눈에 바릅니다.
3. 마우스에서 규칙적인 호흡수(1-2/s)와 발가락 꼬임 반응이 없는지 모니터링하여 마취를 조정해야 하는지 여부를 나타냅니다.
4. 소량(~0.5-1mL)의 예열 초음파 젤을 마지막 갈비뼈와 골반 사이의 마취된 마우스의 양쪽에 있는 척추에 축(측면)으로 놓습니다.
5. 초음파 프로브에 소량의 젤을 넣으십시오.
6. 프로브의 전면이 두개골 쪽에 오도록 프로브를 척추와 평행하게 놓습니다. 적절한 프로브 방향을 나타내기 위해 프로브 헤드에 표시기 표시가 있습니다. 수집되는 각각의 새로운 이미지 세트에 대해 날짜, 시간, 동물 ID, 프로브 방향 및 동물 측면(오른쪽, 왼쪽, 등쪽, 복부)을 기록합니다.
7. 복부 누운 상태(등쪽 피부가 프로브에 닿음)에 마우스를 놓고 신장 랜드마크가 있는지 해당 부위를 천천히 스캔합니다(그림 2B 및 그림 3). 신장을 바라보고 프로브 꼬리를 당겨 난소를 찾습니다.-약간 고에코 타원형에서 둥근 구조(그림 4A, B) 신장에 의해 두개골-복부와 등쪽 복벽에 의해 등쪽-외측으로 경계를 이루는 매우 고에코 난소 지방 패드 내에서.
   참고: 꼬리와 난소의 측면 압력은 난소를 복벽에 더 가깝게 유도하고 장의 고리에서 멀어지게 할 수 있습니다. 난소는 해부학적으로 등쪽 복벽에 맞닿아 있으며, 복부와 외측은 축근, 꼬리는 신장에 위치합니다.
8. 컨트롤 화면 하단의 슬라이더를 사용하여 신호 게 인을 조정하여 이미지 대비를 개선합니다.
9. 신장의 영상을 개선하려면 반대쪽 복부에 손가락으로 압력을 가하십시오. 압력과 각도를 척추와 직접 평행한 것에서 복부 ~20°까지 변경합니다.
10. 관심 기관이 view, 클립 저장 또는 녹화 시작을 클릭한 다음 완료되면 녹화 중지 를 클릭하여 비디오를 수집하여 미리 설정된 프레임 수로 이미지를 유지합니다.
11. 라이브 이미지 또는 Save Frame 버튼을 사용하여 녹화에서 단일 프레임을 저장합니다.
12. 자궁을 이미지화하려면 난소가 시야의 가장 두개골 측면에 올 때까지 프로브를 꼬리쪽으로 당깁니다. 자궁이 보일 때까지 프로브 압력과 각도를 변경하십시오.
13. 관심 있는 각 기관에 대해 비디오 및 프레임 수집을 반복합니다.
14. 외측 다리 근육도 볼 수 있는 등쪽 복벽을 따라 세로로 달리는 자궁을 찾습니다(그림 4B).
    참고: 자궁 크기와 내강 직경은 발정 단계와 질병 상태에 따라 달라질 수 있습니다.
15. 연동 운동에 대해 조직을 모니터링하여 장 루프와 자궁 고정 뿔을 구별합니다.

6. 복부 접근에서 이미지 수집

1. 마우스를 등쪽 누운 자세로 놓고 눈 윤활이 충분하고 주둥이가 코 콘에 단단히 고정되어 있는지 확인합니다(그림 2A).
2. 소량(~0.5-1mL)의 예열 초음파 젤을 복부 복부에 바르고 치골의 정중선 두개골에 프로브를 적용하여 방광을 저에코 랜드마크로 찾습니다(그림 5).
   참고: 방광이 너무 커서 자궁 영상이 가려지면 하복부에 부드러운 압력을 가하여 소변을 표현할 수 있습니다.
3. 탐침을 방광 옆으로 당겨 자궁 뿔을 찾습니다. 마우스의 한쪽 또는 양쪽에서 가벼운 디지털 압력을 가하여 뿔을 시야로 가져옵니다. 프로브를 마우스에 수직으로 잡고 복부의 양쪽을 스캔하여 양쪽 뿔의 가로 모습(단면)을 캡처합니다. 프로브를 돌려 시상 뷰를 캡처합니다.
4. 초음파 검사 후 종이 타월로 마우스의 젤을 깨끗이 닦고 케이지로 돌려 보내 회복시킵니다. 마우스는 2-5 분 안에 완전히 깨어납니다. 완전히 깨어나고 보행이 가능하면 마우스를 동물 방으로 되돌립니다.
   알림: 저온의 가열 패드를 케이지 아래에 놓아 회수를 위해 케이지를 따뜻하게 할 수 있습니다.
5. 실험적 또는 인도적 종점에서 마우스를 안락사시킵니다. 이상적으로는 스트레스를 줄이기 위해 홈 케이지에서 마우스를 안락사시키는 것이 좋습니다. 또는 마우스를 깨끗한 챔버에 넣습니다. 분당 챔버 부피의 10%-30%의 변위 속도로 가압된 CO₂ 를 전달합니다. 약 5분 동안 눈에 보이는 호흡이 없으면 경추 탈구로 인한 사망을 확인합니다. 종양 채취를 위해 복부 부검을 진행하십시오.

결과

Pax8-Cre-Arid1a-Pten 이중 결실(iPAD) 형질전환 마우스는 이전에 기술된 바와 같이 혼합 유전적 배경(129S, BALB/C, C57BL/6)에서 유지되었다¹⁴. 마우스는 모두 Cre 재조합 효소를 유도하기 위해 2 주 동안 독시사이클린 사료를 공급 받았다. 우리 그룹의 이전 연구에서 독시사이클린은 위관 영양¹⁴에 의해 투여되었습니다. 그러나 이 현재 연구에서 독시사이클린 ?...

토론

이 프로토콜은 생쥐의 자궁 내 선암 진행에서 자궁 형태학적 변화를 평가하기 위한 초음파의 유용성을 조사합니다. 본 연구에서는 생쥐에서 자궁내막암의 유도를 종단으로 추적하여 초음파로 검출된 해부학적 세부 사항이 육안적 및 조직학적 병리의 지표임을 밝혀냈다. 이것은 생쥐에서 자궁암의 진행을 추적하기 위해 여러 시점에서 초음파로 모니터링되는 더 적은 수의 생쥐를 대상으로 종단 ?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents and Equipment Used for Animal Care
Rodent Diet (2018, 625 Doxycycline)	Envigio	TD.01306	Mouse Feed
Reagents and Equipment Used for Ultrasound Imaging
10 mL injectable 0.9% NaCl	Hospira, Inc	RL-7302	Isotonic Fluid
Absorbent Pad with Plastic Backing	Daigger	EF8313	Absorbant Pads
Anesthesia Induction Chambers	Harvard Apparatus	75-2029	Induction Chamber
Anesthetic absorber kit with absorber canister, holder, tubing, & adapters	CWE, Inc	13-20000	Nose Cone and Tubing
Aquasonic Clear Ultrasound Gel (0.25 Liter)	Parker Laboratoies	08-03	Ultrasound Gel
BD Plastipak 3 mL Syringe	BD Biosciences	309657	Syringe
F/Air Scavenger Charcoal Canister	OMNICON	80120	Scavenging System for Anesthesia
Isoflurane, USP	Vet One	502017	Anesthesia Agent
M1050 Non-Rebreathing Mobile Anesthesia Machine	Scivena Scientific	M1050	Anestheic Vaporizer
MX550S, 25-55 MHz Transducer, 15mm, Linear	VisualSonics	MX550S	Ultrasound Transducer (Probe)
Nair Hair Aloe & Lanolin Hair Removal Lotion - 9.0 oz	Nair		Depilliating Cream
Philips Norelco Multigroomer All-in-One Trimmer Series 7000	Philips North America	MG7750	Clippers
PrecisionGlide 25 G 1" Needle	BD Biosciences	305125	Needle
Puralube Ophthalmic Ointment	Dechra	17033-211-38	Lubricating Eye Drops
Vevo 3100 Imaging System	VisualSonics	Vevo 3100	Ultrasound Machine
Vevo LAB 5.6.1	VisualSonics	Vevo LAB 5.6.1	Ultrasound Analysis Software
Vinyl Heating Pad with cover, 12 x 15"	Sunbeam	731-500-000R	Heating Pad
Wd Elements 2TB Basic Storage	Western Digital Elements	WDBU6Y0020BBK-WESN	Data Storage
Reagents and Equipment Used for Immunohistochemistry
10% w/v Formalin	Fischer Scientific	SF98-4	Tissue Fixation Buffer
Animal-Free Blocker and Diluent, R.T.U.	Vector Laboratories Inc.	SP5035	Antibody Blocker
Charged Super Frost Plus Glass Slides	VWR	4831-703	Tissue Mounting Slides
Citrate Buffer	MilliporeSigma	C9999-1000ML	Epitope Retrival Buffer (pTEN)
Cytoseal – 60	Thermo Scientific	8310-4	Resin for Slide Sealing
Gold Seal Cover Glass	Thermo Scientific	3322	Coverslide
Harris Modified Hematoxylin	MilliporeSigma	HHS32-1L	Counterstain Buffer
Hybridization Incubator (Dual Chamber)	Fischer Scientific	13-247-30Q	Oven to Melt Parraffin
ImmPACT DAB Substrate, Peroxidase (HRP)	Vector Laboratories Inc.	SK-4105	Signal Development Substrate
ImmPRESS HRP Goat Anti-Rabbit IgG Polymer Detection Kit, Peroxidase	Vector Laboratories Inc.	MP-7451	Secondary IHC Antibody
Oster 5712 Digital Food Steamer	Oster	5712	Vegetable Steamer for Epitope Retrival
rabbit mAB anti-ARID1a	abcam	ab182560	Primary IHC Antibody (1:1,000)
rabbit mAB anti-PTEN	Cell Signaling	9559	Primary IHC Antibody (1:100)
Scotts Tap Water Substitute	MilliporeSigma	S5134-100ML	"Blueing" Buffer
Tissue Path IV Cassette	Fischer Scientific	22272416	Tissue Fixation Cassette
Trilogy Buffer	Cell Marque	920P-10	Epitope Retrival Buffer (ARID1a)