הערכת אולטרסאונד לא פולשנית של התקדמות סרטן רירית הרחם במחיקה מכוונת Pax8 של מדכאי הגידול Arid1a ו - Pten בעכברים

Summary

פרוטוקול זה מתאר שיטה למעקב אחר התקדמות שינויים מורפולוגיים לאורך זמן ברחם במודל עכברי מושרה של סרטן רירית הרחם באמצעות הדמיית אולטרסאונד עם קורלציה לשינויים גסים והיסטולוגיים.

Abstract

סרטן הרחם יכול להיחקר בעכברים בשל קלות הטיפול והמניפולציה הגנטית במודלים אלה. עם זאת, מחקרים אלה מוגבלים לעתים קרובות להערכת פתולוגיה לאחר המוות בבעלי חיים שהומתו בנקודות זמן מרובות בקבוצות שונות, מה שמגדיל את מספר העכברים הדרושים למחקר. הדמיה של עכברים במחקרי אורך יכולה לעקוב אחר התקדמות המחלה בבעלי חיים בודדים, ולהפחית את מספר העכברים הדרושים. ההתקדמות בטכנולוגיית האולטרסאונד אפשרה זיהוי של שינויים ברמת המיקרומטר ברקמות. אולטרסאונד שימש לחקר הבשלת זקיקים בשחלות וצמיחת קסנוגרפט, אך לא יושם על שינויים מורפולוגיים ברחם העכבר. פרוטוקול זה בוחן את הסמיכות של פתולוגיה עם השוואות הדמיה in vivo במודל עכבר סרטן רירית הרחם המושרה. המאפיינים שנצפו על ידי אולטרסאונד היו עקביים עם מידת השינוי שנצפתה על ידי פתולוגיה גסה והיסטולוגיה. אולטרסאונד נמצא כמנבא מאוד את הפתולוגיה הנצפית, ותומך בשילוב אולטרה-סאונד במחקרי אורך של מחלות רחם כגון סרטן בעכברים.

Introduction

עכברים נותרו אחד המודלים החשובים ביותר של בעלי חיים להפרעות רבייה ^1,2,3. ישנם מספר מודלים מהונדסים גנטית או מושרית מכרסמים של סרטן השחלות והרחם. מחקרים אלה מסתמכים בדרך כלל על קבוצות מרובות שהומתו בנקודות זמן שונות כדי ללכוד מגמות אורך בשינויים מורפולוגיים ופתולוגיים. זה מונע את היכולת לרכוש נתונים רציפים על התפתחות סרטן בעכבר בודד. בנוסף, מבלי לדעת את מצב התקדמות מחלת העכבר הבודד, מחקרי התערבות מבוססים על נקודות זמן קבועות מראש וממצאים ממוצעים של קבוצות קודמות ולא על סף בודד לזיהוי התקדמות בחיה ספציפית ^4,5. לכן, יש צורך בגישות הדמיה המאפשרות הערכת אורך בבעלי חיים כדי להקל על מודלים פרה-קליניים לבדיקת תרופות או תרכובות חדשות ולהאיץ את הבנת הפתולוגיה תוך הגברת ההקפדה והשכפול⁶.

הדמיית אולטרסאונד (US) היא שיטה מושכת לניטור אורכי של התקדמות סרטן הרחם בעכבר מכיוון שהיא קלה יחסית וזולה בהשוואה לשיטות הדמיה אחרות, קלה לביצוע ויכולה להיות ברזולוציה יוצאת דופן ^6,7. שיטה לא פולשנית זו יכולה ללכוד תכונות בקנה מידה מיקרוני בעכברים ערים או עם עכברים תחת טשטוש קצר באמצעות בדיקה של 5-10 דקות. מיקרוסקופ אולטרסאונד אומת כשיטה למדידת התפתחות זקיק השחלות ^{של עכבר 8} וצמיחת ניאופלזיה מושתלת או מושרית 9,10,11. US בתדירות גבוהה שימש גם לזריקות תוך רחמיות מלעוריות¹² ולצפייה בשינוי רחם חולדה במהלך מחזור הייחום¹³. ניתן להשתמש בארה"ב בתדר גבוה עם עכברים המוחזקים על פלטפורמות נייחות מיוחדות באמצעות מערכת מסילות להחזקת המתמר / הגשושית כדי לצלם תמונות ברזולוציה גבוהה עם מיקום ולחץ סטנדרטיים; עם זאת, ציוד זה אינו זמין בכל המוסדות. ניתן לאמץ שיטות סריקת מתמרים ידניות עם ציוד פחות ייעודי ולהשתמש בהן הן לאבחון קליני והן ליישומי מחקר בעכברים.

נשאלת השאלה האם ניתן להשתמש בהדמיה אמריקאית עם בדיקות ידניות בתדירות גבוהה כדי לעקוב אחר התפתחות סרטן הרחם במשך שבועות רבים. בדומה למעיים, הרחם המכרסם הוא מבנה דק ודק שהוא נייד מאוד בתוך הבטן והוא רציף דרך עומקי רקמות מרובים, מה שהופך את ההדמיה למאתגרת יותר מאשר עם איברים חסרי תנועה יחסית כמו הכליות. מחקר זה ביקש לקבוע את המתאם בין רקמות שנצפו על ידי אולטרסאונד והיסטופתולוגיה, להגדיר ציוני דרך לאיתור רחם העכבר ולקבוע את היתכנות ההערכה האורכית של סרטן רירית הרחם. מחקר זה מציג נתונים המראים התאמה איכותית בין הופעת הרחם שצולם על ידי US לבין היסטופתולוגיה, כמו גם הדמיה סדרתית של עכברים במשך מספר שבועות. תוצאות אלה מצביעות על כך שניתן להשתמש ב- US ידני כדי לעקוב אחר התפתחות סרטן רירית הרחם בעכברים, ובכך ליצור הזדמנות לאיסוף נתוני אורך של עכברים בודדים לחקר סרטן הרחם ללא צורך בציוד ייעודי.

Protocol

כל ההליכים והניסויים בעכברים בוצעו על פי פרוטוקולים שאושרו על ידי הוועדה לטיפול ושימוש בבעלי חיים של ג'ונס הופקינס. לכל ההליכים נלבש ציוד הגנה אישי מתאים, כולל כפפות וחלוקי בידוד חד פעמיים. ננקטו אמצעי זהירות בעת הטיפול בחדים, אשר הושלכו כראוי במיכלי חדים בקופסה אדומה מיד לאחר השימוש. עיין בטבלת החומרים לקבלת פרטים על כל החומרים והציוד המשמשים בפרוטוקול זה.

1. השראת סרטן רירית הרחם בעכברי iPAD ( inducible Pten, Arid1a Double Deletion) עם דוקסיציקלין

1. שמרו על 10 עכברים טרנסגניים מסוג Pax8-Cre-Arid1a-Pten (iPAD) על רקע גנטי מעורב (129S, BALB/C, C57BL/6), כפי שתואר קודם לכן¹⁴.
2. אסוף תמונות אולטרסאונד בסיסיות (2D) של השחלות, האובידוקט והרחם של כל עכבר לפני הטיפול בדוקסיציקלין.
3. ספקו באופן בלעדי דיאטות צ'או עכברים המכילות דוקסיציקלין (דוקסיציקלין היקלט במינון 625 מ"ג/ק"ג מזון) לנקבות עכברי iPAD למשך שבועיים לפחות החל מגיל 7-8 שבועות כדי לגרום למחיקת גנים.

2. הגדרת ציוד

1. הפעילו את כרית החימום וכסו בכרית סופגת נקייה (טמפרטורת יעד: 38°C).
2. ודא כי אידוי isoflurane ומיכל O₂ מלאים כראוי. מלא מחדש והחלף אם התוכן נמוך.
3. חברו את תא האינדוקציה, חרוט האף ומערכת הנבלות לוופורייזר.
4. הגדר את מכשיר האולטרסאונד.
   1. בחר מתמר (בדיקה) עם טווח של 32-56 MHz או עד 70 MHz עבור הדמיה של הרחם או השחלה, בהתאמה.
   2. חבר את הגשושית והפעל את המכונה.
   3. לאחר אתחול המערכת, השתמש בלוח הבקרה כדי להיכנס באמצעות אישורי המשתמש ולגשת למסך הבית.
   4. ממסך הבית, עבור אל הכרטיסיה יישומים ובחר מצב בטן (קטן) של עכבר.
   5. לחץ על סריקה כדי לחזור למסך הבית, והמתן להצגת תמונה חיה.
   6. בחרו B-Mode מהאפשרויות בסרגל הכלים השמאלי.
   7. לחץ על פקדים נוספים כדי להציג כלים נוספים לעידון תמונה, כגון רווח ועומק תמונה, או כדי להתאים את הגדרות רכישת הקליפ, כגון מספר הפריימים לשנייה.
   8. לאחר בחירת הגדרות התמונה, חזור למסך הבית על ידי לחיצה על סרוק.
5. הפעל את מיכל O₂ , כוון את הזרימה לתא האינדוקציה והגדר את קצב הזרימה ל- 1 L/min.

3. הכנת עכברים לבדיקת אולטרסאונד, כולל הסרת שיער

1. מקם עכבר בתא האינדוקציה. הגדר את וופורייזר isoflurane על 2%-3% vol/vol להשראת הרדמה.
2. לקבוע את עומק ההרדמה המתאים על ידי חוסר תגובה לצביטה בבוהן וקצב נשימה סביב 1-2 נשימות / שנייה.
3. החל חומר סיכה אופתלמי סטרילי על כל עין. הסר את הפרווה מן dorsum ו ventrum בין הצלע האחרונה ואת האגן עם קוצץ בגודל מתאים.
4. יש למרוח שכבה דקה של קרם דפילטורי על אזורי הגחון והגב לצורך הדמיה (במידת הצורך).
5. החזירו את העכבר לתא האינדוקציה למשך כ-3-5 דקות כדי לשמור על עומק ההרדמה המתאים בזמן שקרם ההרדמה פועל להסרת השיער. לאחר ≤4 דקות, נגבו בעדינות את הקרם במגבת נייר לחה ונקייה.
   הערה: חשיפה ממושכת יותר לקרם מסיר שיער מגרה ועלולה לגרום לנגעים בעור.

4. הזרקה intraperitoneal של נוזל כדי להגדיל את הניגוד בין איברים

1. חממו מזרק בנפח 3-10 מ"ל מלא בתמיסת נוזל איזוטוני סטרילי (למשל, תמיסת רינגרים סטרילית 0.9% NaCl או Lactated Ringers) לטמפרטורה של 35-40°C על ידי הנחתו בין כרית חימום לפד סופג למשך מספר דקות. הניחו בקבוק ג'ל אולטרסאונד על כרית החימום אם אין במכשיר מחמם.
2. עבור עכבר 20-25 גרם, להזריק 1-2 מ"ל של פתרון לתוך חלל הצפק.
   1. אבטח את העכבר על ידי קשקוש ביד אחת, חושף את הוונטרום.
   2. החזק את העכבר בזווית ~ 20 מעלות, כאשר האף מכוון לרצפה כדי לכוון את האיברים באופן גולגולתי עקב כוח הכבידה.
   3. באמצעות מחט מד קטנה (25 גרם, 5/8 אורך, מזרק שחפת), לנקב דרך העור ואת דופן הבטן של הרביע הימני הקאודלי של הבטן.
   4. לפני הזרקת נוזלים, כדי למנוע הזרקה לתוך כלי הדם או מערכת העיכול, למשוך אחורה עם לחץ מינימלי. אם דם או חומר אחר נכנס מזרק, להסיר את המחט. השתמש מחט חדשה מזרק, ולנסות שוב במיקום שונה במקצת.
3. אם העכבר מתעורר במהלך ההזרקות, החזירו אותו לתא האינדוקציה הקטן להרדמה עם 2%-3% vol/vol isoflurane.

5. הדמיית אולטרסאונד בגישה גבית

1. מקמו את העכבר בשכיבה גחונית על כרית הספיגה מעל כרית חימום (איור 2A-C).
2. הניחו חרוט אף מכרסם היטב על אפו ולוע העכבר. שמור על עומק ההרדמה עם איזופלורן המועבר דרך חרוט האף ב 1%-2% vol/vol ב 100% O₂. יש למרוח חומר סיכה אופתלמי סטרילי, לפי הצורך, על כל עין.
3. עקוב אחר קצב נשימה רגיל (1-2/s) וחוסר תגובה של צביטת בוהן כדי לציין אם יש צורך להתאים את ההרדמה.
4. מניחים כמות קטנה (~ 0.5-1 מ"ל) של ג'ל אולטרסאונד שחומם מראש abaxial (לרוחב) לעמוד השדרה משני צדי העכבר המרדים, בין הצלע האחרונה לאגן.
5. שים כמות קטנה של ג'ל על הבדיקה אולטרסאונד.
6. מקם את הבדיקה במקביל לחוליות עם החלק הקדמי של הבדיקה בצד הגולגולת. סימן חיווי קיים על ראש הבדיקה כדי לציין את כיוון הבדיקה הנכון. תעד את היום, השעה, מזהה בעל החיים, כיוון הגשושית וצד החיה (ימין, שמאל, גבי, גחון) עבור כל קבוצה חדשה של תמונות שנאספות.
7. עם עכבר בשכיבה גחונית (העור הגבי נוגע בבדיקה), סרוק באיטיות את האזור בחיפוש אחר ציון הדרך בכליות (איור 2B ואיור 3). כאשר הכליה במבט כולל, משכו את הגשושית כדי למצוא את השחלה – מבנה אליפטי מעט היפראקואי עד עגול (איור 4A, B) בתוך כרית שומן שחלתית היפראקואית מאוד הגובלת בקרניו-ונטרלית על ידי הכליה ובגב-לטרלית על ידי דופן הבטן הגבית.
   הערה: לחץ קאודלי ורוחבי לשחלה יכול לכוון את השחלה קרוב יותר לדופן הבטן והרחק מלולאות המעי. השחלה ממוקמת אנטומית כנגד דופן הבטן הגבית, רק גחונית וצידית לשרירים האפקסיאליים וקאודלית לכליה.
8. התאם את עוצמת האות באמצעות המחוון בתחתית מסך הבקרה כדי לשפר את ניגודיות התמונה.
9. כדי לשפר את ההדמיה של הכליה, להפעיל לחץ עם אצבע על הבטן contralateral. שנה את הלחץ והזווית ממקביל ישירות לעמוד השדרה ל~ 20° גחון.
10. ברגע שהאיבר המעניין מוצג, אסוף סרטון על ידי לחיצה על שמור קליפ או התחל להקליט ואז הפסק להקליט בסיום כדי לשמור על תמונות במספר מוגדר מראש של מסגרות.
11. שמור מסגרות בודדות מתמונה חיה או מהקלטה באמצעות הלחצן Save Frame .
12. כדי לדמיין את הרחם, משוך את הבדיקה באופן קאודלי עד שהשחלה נמצאת בהיבט הגולגולתי ביותר של שדה הראייה. שנו את לחץ הבדיקה ואת הזווית עד שהרחם יהיה גלוי.
13. חזור על אוסף וידאו ומסגרות עבור כל איבר מעניין.
14. מצאו את הרחם רץ לאורך דופן הבטן הגבית, כשגם שרירי הרגל הצידית נראים לעין (איור 4B).
    הערה: גודל הרחם וקוטר הלומן עשויים להשתנות עם שלב הייחום ומצב המחלה.
15. לפקח על הרקמה עבור תנועה פריסטלטית כדי להבדיל את לולאות המעי מן הקרניים נייחות הרחם.

6. אסוף תמונות מגישה גחונית

1. הניחו את העכבר בשכיבה גבית, ובדקו שסיכוך העיניים מספיק והלוע נמצא היטב בחרוט האף (איור 2A).
2. יש למרוח כמות קטנה (~0.5-1 מ"ל) של ג'ל אולטרסאונד שחומם מראש על הבטן הגחון, ולמרוח את הבדיקה בקו האמצע של הערווה כדי לאתר את שלפוחית השתן כנקודת ציון היפואקואית (איור 5).
   הערה: אם שלפוחית השתן גדולה מדי ומסתירה את הדמיית הרחם, ניתן להפעיל לחץ עדין על הבטן התחתונה כדי לבטא שתן.
3. משוך את הבדיקה לרוחב לשלפוחית השתן כדי למצוא את קרני הרחם. הפעל לחץ דיגיטלי קל משני צידי העכבר או משני צדי העכבר כדי להביא את הקרניים לשדה הראייה. החזק את הגשושית בניצב לעכבר, וסרוק את שני צידי הבטן כדי ללכוד מבטים רוחביים (חתכים) של שתי הקרניים. סובב את הגשושית כדי ללכוד תצוגות קשת.
4. לאחר האולטרסאונד, נגבו את העכבר מג'ל עם מגבת נייר, והחזירו אותו לכלוב שלו כדי להתאושש. עכברים ערים לחלוטין תוך 2-5 דקות. ברגע שהוא ער לחלוטין אמבולטורי, להחזיר את העכבר לחדר החיות.
   הערה: ניתן להניח כרית חימום בחום נמוך מתחת לכלוב כדי לחמם את הכלוב להתאוששות.
5. בנקודת הקצה הניסיונית או האנושית, הרדימו את העכבר. באופן אידיאלי, להרדים את העכבר בכלוב הביתי כדי להפחית את הלחץ; לחלופין, הניחו את העכבר בתא נקי. יש לספק CO₂ בלחץ בקצב תזוזה של 10%-30% מנפח התא לדקה. לאחר כ-5 דקות ללא נשימה נראית לעין, יש לוודא מוות כתוצאה מנקע צוואר הרחם. המשך עם נקרופסי בטן לקצירת גידולים.

תוצאות

Pax8-Cre-Arid1a-Pten מחיקה כפולה (iPAD) עכברים טרנסגניים נשמרו על רקע גנטי מעורב (129S, BALB/C, C57BL/6), כפי שתואר קודם לכן¹⁴. כל העכברים קיבלו מזון דוקסיציקלין במשך שבועיים כדי לגרום ל-Cre recombinase. בעבודה קודמת של הקבוצה שלנו, דוקסיציקלין קיבל מינון על ידי gavage¹⁴; עם זאת, במחקר הנו?...

Discussion

פרוטוקול זה בוחן את התועלת של אולטרסאונד להערכת שינויים מורפולוגיים ברחם בהתקדמות אדנוקרצינומה ברחם בעכברים. במחקר זה, על ידי מעקב אחר השראת סרטן רירית הרחם בעכברים לאורך זמן, הפרטים האנטומיים שזוהו על ידי אולטרסאונד נמצאו כאינדיקטורים לפתולוגיה גסה והיסטולוגית. זה פותח את הדלת לשימוש ב...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents and Equipment Used for Animal Care
Rodent Diet (2018, 625 Doxycycline)	Envigio	TD.01306	Mouse Feed
Reagents and Equipment Used for Ultrasound Imaging
10 mL injectable 0.9% NaCl	Hospira, Inc	RL-7302	Isotonic Fluid
Absorbent Pad with Plastic Backing	Daigger	EF8313	Absorbant Pads
Anesthesia Induction Chambers	Harvard Apparatus	75-2029	Induction Chamber
Anesthetic absorber kit with absorber canister, holder, tubing, & adapters	CWE, Inc	13-20000	Nose Cone and Tubing
Aquasonic Clear Ultrasound Gel (0.25 Liter)	Parker Laboratoies	08-03	Ultrasound Gel
BD Plastipak 3 mL Syringe	BD Biosciences	309657	Syringe
F/Air Scavenger Charcoal Canister	OMNICON	80120	Scavenging System for Anesthesia
Isoflurane, USP	Vet One	502017	Anesthesia Agent
M1050 Non-Rebreathing Mobile Anesthesia Machine	Scivena Scientific	M1050	Anestheic Vaporizer
MX550S, 25-55 MHz Transducer, 15mm, Linear	VisualSonics	MX550S	Ultrasound Transducer (Probe)
Nair Hair Aloe & Lanolin Hair Removal Lotion - 9.0 oz	Nair		Depilliating Cream
Philips Norelco Multigroomer All-in-One Trimmer Series 7000	Philips North America	MG7750	Clippers
PrecisionGlide 25 G 1" Needle	BD Biosciences	305125	Needle
Puralube Ophthalmic Ointment	Dechra	17033-211-38	Lubricating Eye Drops
Vevo 3100 Imaging System	VisualSonics	Vevo 3100	Ultrasound Machine
Vevo LAB 5.6.1	VisualSonics	Vevo LAB 5.6.1	Ultrasound Analysis Software
Vinyl Heating Pad with cover, 12 x 15"	Sunbeam	731-500-000R	Heating Pad
Wd Elements 2TB Basic Storage	Western Digital Elements	WDBU6Y0020BBK-WESN	Data Storage
Reagents and Equipment Used for Immunohistochemistry
10% w/v Formalin	Fischer Scientific	SF98-4	Tissue Fixation Buffer
Animal-Free Blocker and Diluent, R.T.U.	Vector Laboratories Inc.	SP5035	Antibody Blocker
Charged Super Frost Plus Glass Slides	VWR	4831-703	Tissue Mounting Slides
Citrate Buffer	MilliporeSigma	C9999-1000ML	Epitope Retrival Buffer (pTEN)
Cytoseal – 60	Thermo Scientific	8310-4	Resin for Slide Sealing
Gold Seal Cover Glass	Thermo Scientific	3322	Coverslide
Harris Modified Hematoxylin	MilliporeSigma	HHS32-1L	Counterstain Buffer
Hybridization Incubator (Dual Chamber)	Fischer Scientific	13-247-30Q	Oven to Melt Parraffin
ImmPACT DAB Substrate, Peroxidase (HRP)	Vector Laboratories Inc.	SK-4105	Signal Development Substrate
ImmPRESS HRP Goat Anti-Rabbit IgG Polymer Detection Kit, Peroxidase	Vector Laboratories Inc.	MP-7451	Secondary IHC Antibody
Oster 5712 Digital Food Steamer	Oster	5712	Vegetable Steamer for Epitope Retrival
rabbit mAB anti-ARID1a	abcam	ab182560	Primary IHC Antibody (1:1,000)
rabbit mAB anti-PTEN	Cell Signaling	9559	Primary IHC Antibody (1:100)
Scotts Tap Water Substitute	MilliporeSigma	S5134-100ML	"Blueing" Buffer
Tissue Path IV Cassette	Fischer Scientific	22272416	Tissue Fixation Cassette
Trilogy Buffer	Cell Marque	920P-10	Epitope Retrival Buffer (ARID1a)