小鼠中Pax8定向缺失肿瘤抑制因子 Arid1a 和 Pten 的子宫内膜癌进展的非侵入性超声评估

摘要

该协议描述了一种使用与大体和组织学变化相关的超声成像在子宫内膜癌诱导小鼠模型中监测子宫中形态变化随时间进展的方法。

摘要

由于这些模型中易于处理和遗传操作，可以在小鼠中研究子宫癌。然而，这些研究通常仅限于评估在不同队列的多个时间点安乐死的动物的病理学死后，这增加了研究所需的小鼠数量。纵向研究中的小鼠成像可以跟踪个体动物的疾病进展，减少所需的小鼠数量。超声技术的进步使得检测组织中的微米级变化成为可能。超声已被用于研究卵巢中的卵泡成熟和异种移植物的生长，但尚未应用于小鼠子宫的形态变化。该协议检查了诱导子宫内膜癌小鼠模型中病理学与 体内 成像比较的并置。超声观察到的特征与大体病理学和组织学观察到的变化程度一致。发现超声波对观察到的病理具有高度预测性，支持将超声检查纳入子宫疾病（如小鼠癌症）的纵向研究中。

引言

小鼠仍然是生殖疾病最重要的动物模型之一¹，^2，3。卵巢癌和子宫癌有几种转基因或诱导的啮齿动物模型。这些研究通常依赖于在不同时间点安乐死的多个队列来捕捉形态和病理变化的纵向趋势。这阻止了在单个小鼠中获取有关癌症发展的连续数据的能力。此外，在不知道个体小鼠疾病进展状态的情况下，干预研究基于预定的时间点和先前队列的平均结果，而不是检测特定动物进展的个体阈值^4，5。因此，需要允许对活体动物进行纵向评估的成像方法，以促进用于测试新药或化合物的临床前模型，并加速对病理生物学的理解，同时提高严谨性和可重复^性6。

超声成像（US）是纵向监测小鼠子宫癌进展的一种有吸引力的方法，因为与其他成像方法相比，它相对简单且便宜，易于执行，并且可以具有显着的分辨率^6，7。这种非侵入性方式可以在清醒小鼠或短暂镇静下的小鼠中使用5-10分钟的检查捕获微米级的特征。超声显微镜已被验证为测量小鼠卵巢卵^泡发育8和植入或诱导的肿瘤生长的方法9，^10，11。高频US也被用于经皮宫内注射¹²和观察大鼠子宫在发情周期的变化¹³。高频US可用于固定在专用固定平台上的小鼠，使用导轨系统固定换能器/探头，以捕获具有标准化位置和压力的高分辨率图像;但是，并非所有机构都提供此设备。手持式换能器扫描方法可以采用较少的专用设备，并用于小鼠的临床诊断和研究应用。

问题仍然是，使用手持式高频探头进行美国成像是否可以用于监测数周的子宫癌发展。与肠道类似，啮齿动物子宫是一种薄壁细长的结构，在腹部内非常移动，并且通过多个组织深度连续，这使得成像比相对不动的器官（如肾脏）更具挑战性。本研究旨在建立超声观察到的组织与组织病理学之间的相关性，确定定位小鼠子宫的标志，并确定子宫内膜癌纵向评估的可行性。这项研究提供的数据显示了US成像的子宫外观与组织病理学之间的定性对应关系，以及小鼠在几周内的连续成像。这些结果表明，手持式US可用于监测小鼠子宫内膜癌的发展，从而为收集单个小鼠纵向数据以研究子宫癌创造了机会，而无需专用设备。

研究方案

所有涉及小鼠的程序和实验均按照约翰霍普金斯大学动物护理和使用委员会批准的方案进行。对于所有程序，都穿着适当的个人防护装备，包括手套和一次性隔离衣。处理锐器时采取了预防措施，使用后立即妥善处理在红箱锐器容器中。有关本协议中使用的所有材料和设备的详细信息，请参阅 材料表 。

1.用多西环素诱导iPAD小鼠（诱导 Pten，Arid1a 双缺失）子宫内膜癌

1. 在混合遗传背景（129S，BALB / C，C57BL / 6）上维持10 Pax8-Cre-Arid1a-Pten双缺失（iPAD）转基因小鼠（图1），如前所述¹⁴。
2. 在多西环素治疗之前收集每只小鼠的卵巢、输卵管和子宫的基线超声 （2D） 图像。
3. 从7-8周龄开始，向雌性iPAD小鼠提供仅含多西环素的小鼠食物日粮（625mg / kg饲料的盐酸多西环素）至少2周，以诱导基因缺失。

2. 设备设置

1. 打开加热垫，并盖上干净的吸收垫（目标温度:38°C）。
2. 确认异氟醚蒸发器和O₂ 罐已充分填充。如果内容物不足，请重新填充并更换。
3. 将感应室、鼻锥和清除系统连接到蒸发器。
4. 设置超声波机器。
   1. 选择范围为 32-56 MHz 或高达 70 MHz 的换能器（探头）分别用于子宫或卵巢成像。
   2. 连接探头，然后打开机器电源。
   3. 系统启动后，使用控制面板使用用户凭据登录并访问主屏幕。
   4. 在主屏幕中，转到 "应用程序 "选项卡，然后选择 "鼠标（小）腹部模式"。
   5. 单击 扫描 返回主屏幕，然后等待显示实时图像。
   6. 从左侧工具栏上的选项中选择 B 模式。
   7. 单击 "更多控件 "以查看用于图像细化的其他工具，例如图像增益和深度，或调整剪辑采集设置（例如每秒帧数）。
   8. 选择图像设置后，单击" 扫描"返回主屏幕。
5. 打开 O₂ 罐，将流量引导至感应室，并将流速设置为 1 L/min。

3.准备小鼠进行超声筛查，包括脱毛

1. 将鼠标放在感应室中。将异氟醚蒸发器设置为2%-3%体积/体积以诱导麻醉。
2. 通过对脚趾夹伤缺乏反应和呼吸频率约为 1-2 次呼吸/秒来确定适当的麻醉深度。
3. 在每只眼睛上涂抹无菌眼科润滑剂。用适当大小的剪刀从最后一根肋骨和骨盆之间的背部和腹侧去除皮毛。
4. 在要成像的腹侧和背部区域涂上一层薄薄的脱毛膏（如果需要）。
5. 将鼠标放回诱导室约3-5分钟，以保持适当的麻醉深度，同时脱毛膏去除毛发。≤4分钟后，用干净的湿纸巾轻轻擦去面霜。
   注意:长时间接触脱毛膏具有刺激性，并可能导致皮肤损伤。

4.腹腔注射液体以增加器官之间的对比度

1. 将装有无菌等渗液体溶液（例如无菌 0.9% NaCl 或乳酸环状动脉瓣溶液）的 3-10 mL 注射器加热至 35-40 °C，将其置于加热垫和吸收垫之间几分钟。如果机器没有加热器，请将一瓶超声波凝胶放在加热垫上。
2. 对于20-25g小鼠，将1-2mL溶液注入腹膜腔。
   1. 一只手抓住鼠标的肋骨，露出腹侧。
   2. 以~20°角握住鼠标，鼻子指向地板，以由于重力而颅骨地引导器官。
   3. 使用小规格针（25 G，5/8 英寸长，结核菌素注射器），穿刺腹部尾部右象限的皮肤和腹壁。
   4. 在注射液体之前，为避免注射到脉管系统或胃肠道，请以最小的压力拉回。如果血液或其他物质进入注射器，请取出针头。使用新的针头和注射器，然后在稍微不同的位置重试。
3. 如果小鼠在注射过程中醒来，将其放回小诱导室中，用2%-3%vol/vol异氟醚麻醉。

5. 背侧入路超声成像

1. 将鼠标置于加热垫上的吸收垫上的腹侧卧位（图2A-C）。
2. 将啮齿动物鼻锥牢固地放在老鼠的鼻子和口吻上。用异氟醚在100%O 2中以1%-₂%体积/体积通过鼻锥输送保持麻醉深度。根据需要在每只眼睛上涂抹无菌眼科润滑剂。
3. 监测小鼠的正常呼吸频率（1-2 / s）和缺乏脚趾捏反应，以指示是否需要调整麻醉。
4. 将少量（~0.5-1mL）预热的超声凝胶远轴（侧向）放在麻醉小鼠两侧的脊柱上，在最后一根肋骨和骨盆之间。
5. 将少量凝胶放在超声探头上。
6. 将探头平行于椎骨放置，探头的前部位于颅侧。探头上有一个指示标记，用于指示正确的探头方向。记录正在收集的每组新图像的日期、时间、动物 ID、探头方向和动物侧（右、左、背、腹）。
7. 将小鼠置于腹侧卧位（背部皮肤接触探头），缓慢扫描肾脏标志的区域（图2B和图3）。在看到肾脏的情况下，拉动探头尾部以找到卵巢 - 一个非常高回声的卵巢脂肪垫内的轻微高回声椭圆形到圆形结构（图4A，B），该脂肪垫在颅腹侧与肾脏接壤，背侧与背腹壁接壤。
   注意:尾部和卵巢外侧的压力可以使卵巢更靠近腹壁并远离肠袢。卵巢在解剖学上靠腹背壁，仅靠腹肌和外侧至外周肌，尾部至肾脏。
8. 使用控制屏幕底部的滑块调整 信号增益 以提高图像对比度。
9. 为了改善肾脏的成像，用手指对对侧腹部施加压力。改变压力和角度，从直接平行于脊柱到~20°腹侧。
10. 查看感兴趣的器官后，通过单击" 保存剪辑 "或 "开始 录制"来收集视频，然后单击"完成后 停止录制 "以将图像保留在预设的帧数上。
11. 使用"保存帧"按钮保存实时图像或录制中的单个 帧 。
12. 要对子宫进行成像，请向尾部拉动探头，直到卵巢位于视野的最颅面。改变探头压力和角度，直到子宫在视野中。
13. 对每个感兴趣的器官重复视频和帧收集。
14. 找到沿着背腹壁纵向运行的子宫，腿部外侧肌肉组织也在视野中（图4B）。
    注意:子宫大小和管腔直径可能随发情期和疾病状态而变化。
15. 监测组织的蠕动运动，以区分肠袢和子宫固定角。

6. 从腹侧方法收集图像

1. 将鼠标放在背卧中，并检查眼睛润滑是否充分并且枪口牢固地位于鼻锥中（图2A）。
2. 将少量（~0.5-1 mL）预热的超声凝胶涂在腹腹上，并将探头涂在耻骨颅骨的中线，以将膀胱定位为低回声标志（图5）。
   注意:如果膀胱太大并且模糊了子宫成像，则可以在下腹部轻轻按压以挤出尿液。
3. 将探头拉向膀胱侧面以找到子宫角。从鼠标的一侧或两侧施加轻微的数字压力，使喇叭进入视野。垂直于鼠标握住探头，扫描腹部两侧以捕获两个角的横向视图（横截面）。旋转探头以捕获矢状视图。
4. 超声波检查后，用纸巾将鼠标擦拭干净凝胶，然后将其放回笼子中恢复。小鼠在2-5分钟内完全清醒。一旦它完全清醒并走动，将鼠标送回动物室。
   注意:可以在笼子下面放置一个低火加热垫，以加热笼子以进行恢复。
5. 在实验或人道终点，对小鼠实施安乐死。理想情况下，对家中笼子中的小鼠实施安乐死以减轻压力;或者，将鼠标放在干净的房间中。以每分钟腔室体积的 10%-30% 的置换率输送加压的 CO₂ 。在无可见呼吸约 5 分钟后，确认颈椎脱位死亡。进行腹部尸检以收获肿瘤。

结果

Pax8-Cre-Arid1a-Pten 双缺失 （iPAD） 转基因小鼠维持在混合遗传背景 （129S， BALB/C， C57BL/6） 上，如前所述¹⁴.小鼠均饲喂多西环素饲料2周以诱导Cre重组酶。在我们小组以前的工作中，多西环素通过管饲^法给药14;然而，在目前的研究中，多西环素饲料诱导方法有效地工作并降低了小鼠的管饲压力。重要的是要检查多西环素给药方法是否足以诱导Cre重组酶...

讨论

该协议检查了超声在评估小鼠子宫腺癌进展中的子宫形态变化的效用。在这项研究中，通过纵向跟踪小鼠子宫内膜癌的诱导，发现超声检测到的解剖细节是大体和组织病理学的指标。这为使用纵向研究打开了大门，在多个时间点通过超声监测较少数量的小鼠来跟踪小鼠子宫癌的进展。这种纵向检测是通过使用手持式探头完成的，无需使用轨道系统超声设备。使用的高频探头（换能器）广泛使用，?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents and Equipment Used for Animal Care
Rodent Diet (2018, 625 Doxycycline)	Envigio	TD.01306	Mouse Feed
Reagents and Equipment Used for Ultrasound Imaging
10 mL injectable 0.9% NaCl	Hospira, Inc	RL-7302	Isotonic Fluid
Absorbent Pad with Plastic Backing	Daigger	EF8313	Absorbant Pads
Anesthesia Induction Chambers	Harvard Apparatus	75-2029	Induction Chamber
Anesthetic absorber kit with absorber canister, holder, tubing, & adapters	CWE, Inc	13-20000	Nose Cone and Tubing
Aquasonic Clear Ultrasound Gel (0.25 Liter)	Parker Laboratoies	08-03	Ultrasound Gel
BD Plastipak 3 mL Syringe	BD Biosciences	309657	Syringe
F/Air Scavenger Charcoal Canister	OMNICON	80120	Scavenging System for Anesthesia
Isoflurane, USP	Vet One	502017	Anesthesia Agent
M1050 Non-Rebreathing Mobile Anesthesia Machine	Scivena Scientific	M1050	Anestheic Vaporizer
MX550S, 25-55 MHz Transducer, 15mm, Linear	VisualSonics	MX550S	Ultrasound Transducer (Probe)
Nair Hair Aloe & Lanolin Hair Removal Lotion - 9.0 oz	Nair		Depilliating Cream
Philips Norelco Multigroomer All-in-One Trimmer Series 7000	Philips North America	MG7750	Clippers
PrecisionGlide 25 G 1" Needle	BD Biosciences	305125	Needle
Puralube Ophthalmic Ointment	Dechra	17033-211-38	Lubricating Eye Drops
Vevo 3100 Imaging System	VisualSonics	Vevo 3100	Ultrasound Machine
Vevo LAB 5.6.1	VisualSonics	Vevo LAB 5.6.1	Ultrasound Analysis Software
Vinyl Heating Pad with cover, 12 x 15"	Sunbeam	731-500-000R	Heating Pad
Wd Elements 2TB Basic Storage	Western Digital Elements	WDBU6Y0020BBK-WESN	Data Storage
Reagents and Equipment Used for Immunohistochemistry
10% w/v Formalin	Fischer Scientific	SF98-4	Tissue Fixation Buffer
Animal-Free Blocker and Diluent, R.T.U.	Vector Laboratories Inc.	SP5035	Antibody Blocker
Charged Super Frost Plus Glass Slides	VWR	4831-703	Tissue Mounting Slides
Citrate Buffer	MilliporeSigma	C9999-1000ML	Epitope Retrival Buffer (pTEN)
Cytoseal – 60	Thermo Scientific	8310-4	Resin for Slide Sealing
Gold Seal Cover Glass	Thermo Scientific	3322	Coverslide
Harris Modified Hematoxylin	MilliporeSigma	HHS32-1L	Counterstain Buffer
Hybridization Incubator (Dual Chamber)	Fischer Scientific	13-247-30Q	Oven to Melt Parraffin
ImmPACT DAB Substrate, Peroxidase (HRP)	Vector Laboratories Inc.	SK-4105	Signal Development Substrate
ImmPRESS HRP Goat Anti-Rabbit IgG Polymer Detection Kit, Peroxidase	Vector Laboratories Inc.	MP-7451	Secondary IHC Antibody
Oster 5712 Digital Food Steamer	Oster	5712	Vegetable Steamer for Epitope Retrival
rabbit mAB anti-ARID1a	abcam	ab182560	Primary IHC Antibody (1:1,000)
rabbit mAB anti-PTEN	Cell Signaling	9559	Primary IHC Antibody (1:100)
Scotts Tap Water Substitute	MilliporeSigma	S5134-100ML	"Blueing" Buffer
Tissue Path IV Cassette	Fischer Scientific	22272416	Tissue Fixation Cassette
Trilogy Buffer	Cell Marque	920P-10	Epitope Retrival Buffer (ARID1a)