Évaluation échographique non invasive de la progression du cancer de l’endomètre dans la délétion dirigée par Pax8 des suppresseurs de tumeurs Arid1a et Pten chez la souris

Résumé

Ce protocole décrit une méthode de surveillance de la progression des changements morphologiques au fil du temps dans l’utérus dans un modèle murin inductible de cancer de l’endomètre utilisant l’imagerie par ultrasons avec corrélation avec les changements macroscopiques et histologiques.

Résumé

Les cancers de l’utérus peuvent être étudiés chez la souris en raison de la facilité de manipulation et de manipulation génétique dans ces modèles. Cependant, ces études se limitent souvent à l’évaluation de la pathologie post-mortem chez les animaux euthanasiés à plusieurs moments dans différentes cohortes, ce qui augmente le nombre de souris nécessaires pour une étude. L’imagerie des souris dans les études longitudinales peut suivre la progression de la maladie chez des animaux individuels, réduisant ainsi le nombre de souris nécessaires. Les progrès de la technologie des ultrasons ont permis de détecter des changements au niveau micrométrique dans les tissus. L’échographie a été utilisée pour étudier la maturation des follicules dans les ovaires et la croissance de la xénogreffe, mais n’a pas été appliquée aux changements morphologiques dans l’utérus de la souris. Ce protocole examine la juxtaposition de la pathologie avec des comparaisons d’imagerie in vivo dans un modèle murin de cancer de l’endomètre induit. Les caractéristiques observées par échographie correspondaient au degré de changement observé par la pathologie macroscopique et l’histologie. L’échographie s’est avérée hautement prédictive de la pathologie observée, soutenant l’incorporation de l’échographie dans les études longitudinales des maladies utérines telles que le cancer chez la souris.

Introduction

Les souris restent l’un des modèles animaux les plus importants pour les troubles de la reproduction ^1,2,3. Il existe plusieurs modèles génétiquement modifiés ou induits de rongeurs de cancers de l’ovaire et de l’utérus. Ces études reposent généralement sur plusieurs cohortes euthanasiées à différents moments pour saisir les tendances longitudinales des changements morphologiques et pathologiques. Cela empêche la capacité d’acquérir des données continues sur le développement du cancer chez une souris individuelle. De plus, sans connaître l’état de progression de la maladie chez la souris, les études d’intervention sont basées sur des points temporels prédéterminés et des résultats moyens des cohortes précédentes plutôt que sur des seuils individuels pour la détection de la progression chez un animal spécifique ^4,5. Par conséquent, des approches d’imagerie qui permettent une évaluation longitudinale chez des animaux vivants sont nécessaires pour faciliter les modèles précliniques permettant de tester de nouveaux médicaments ou composés et accélérer la compréhension de la pathobiologie tout en augmentant la rigueur et la reproductibilité⁶.

L’imagerie par ultrasons (US) est une méthode intéressante pour la surveillance longitudinale de la progression du cancer de l’utérus chez la souris, car elle est relativement facile et peu coûteuse par rapport aux autres méthodes d’imagerie, est facile à réaliser et peut avoir une résolution remarquable ^6,7. Cette modalité non invasive peut capturer des caractéristiques à l’échelle du micron chez des souris éveillées ou avec des souris sous sédation brève à l’aide d’un examen de 5 à 10 minutes. La microscopie à ultrasons a été validée comme méthode pour mesurer le développement du follicule ovarien de souris 8 et la croissance ^de la néoplasie implantée ou induite 9,10,11. L’échographie à haute fréquence a également été utilisée pour les injections intra-utérines percutanées¹² et l’observation des changements utérins chez le rat au cours du cycle œstruel¹³. Les États-Unis à haute fréquence peuvent être utilisés avec des souris maintenues sur des plates-formes fixes spécialisées à l’aide d’un système de rail pour maintenir le transducteur / sonde afin de capturer des images haute résolution avec une position et une pression normalisées; toutefois, cet équipement n’est pas disponible dans tous les établissements. Les méthodes de balayage de transducteurs portatifs peuvent être adoptées avec moins d’équipement dédié et utilisées à la fois pour le diagnostic clinique et les applications de recherche chez la souris.

La question demeure de savoir si l’imagerie américaine avec des sondes portatives à haute fréquence pourrait être utilisée pour surveiller le développement du cancer de l’utérus sur plusieurs semaines. Semblable aux intestins, l’utérus de rongeur est une structure mince à paroi mince qui est très mobile dans l’abdomen et est contiguë à travers plusieurs profondeurs de tissus, ce qui rend l’imagerie plus difficile qu’avec des organes relativement immobiles tels que les reins. Cette étude visait à établir la corrélation entre les tissus observés par échographie et histopathologie, à définir des points de repère pour localiser l’utérus de souris et à déterminer la faisabilité de l’évaluation longitudinale du cancer de l’endomètre. Cette étude présente des données montrant une correspondance qualitative entre l’apparition de l’utérus imagé par US et l’histopathologie, ainsi que l’imagerie en série de souris sur plusieurs semaines. Ces résultats indiquent que les soins intensifs portatifs peuvent être utilisés pour surveiller le développement du cancer de l’endomètre chez la souris, créant ainsi une opportunité de collecter des données longitudinales individuelles sur des souris pour étudier le cancer de l’utérus sans avoir besoin d’équipement dédié.

Protocole

Toutes les procédures et expériences impliquant des souris ont été effectuées conformément aux protocoles approuvés par le comité de soin et d’utilisation des animaux de Johns Hopkins. Pour toutes les procédures, l’EPI approprié a été porté, y compris des gants et des blouses d’isolement jetables. Des précautions ont été prises lors de la manipulation des objets tranchants, qui ont été éliminés de façon appropriée dans des contenants d’objets pointus ou tranchants de la boîte rouge immédiatement après utilisation. Voir le tableau des matériaux pour plus de détails sur tous les matériaux et équipements utilisés dans ce protocole.

1. Induction du cancer de l’endomètre chez des souris iPAD (Inductible Pten, Arid1a double deletion) avec de la doxycycline

1. Maintenir 10 souris transgéniques Pax8-Cre-Arid1a-Pten à double délétion (iPAD) (Figure 1) sur un fond génétique mixte (129S, BALB/C, C57BL/6), comme décrit précédemment¹⁴.
2. Recueillir des images échographiques (2D) de base des ovaires, de l’oviducte et de l’utérus de chaque souris avant le traitement à la doxycycline.
3. Fournir exclusivement des régimes de chow de souris contenant de la doxycycline (hyclate de doxycycline à 625 mg / kg d’aliment) aux souris iPAD femelles pendant au moins 2 semaines à partir de 7-8 semaines pour induire la délétion des gènes.

2. Configuration de l’équipement

1. Allumez le coussin chauffant et recouvrez-le d’un tampon absorbant propre (température cible : 38 °C).
2. Confirmez que le vaporisateur d’isoflurane et le réservoir d’O₂ sont correctement remplis. Remplissez et remplacez si le contenu est faible.
3. Connectez la chambre à induction, le cône de nez et le système de récupération au vaporisateur.
4. Installez l’appareil à ultrasons.
   1. Choisissez un transducteur (sonde) avec une plage de 32-56 MHz ou jusqu’à 70 MHz pour l’imagerie de l’utérus ou de l’ovaire, respectivement.
   2. Fixez la sonde et mettez la machine sous tension.
   3. Après le démarrage du système, utilisez le panneau de configuration pour vous connecter avec les informations d’identification de l’utilisateur et accéder à l’écran d’accueil.
   4. À partir de l’écran d’accueil, accédez à l’onglet Applications et sélectionnez Mode abdomen (petit) de la souris.
   5. Cliquez sur Numériser pour revenir à l’écran d’accueil et attendez qu’une image en direct s’affiche.
   6. Sélectionnez B-Mode dans les options de la barre d’outils de gauche.
   7. Cliquez sur Plus de commandes pour afficher des outils supplémentaires pour affiner l’image, tels que le gain et la profondeur de l’image, ou pour ajuster les paramètres d’acquisition de clip, tels que le nombre d’images par seconde.
   8. Une fois les paramètres d’image sélectionnés, revenez à l’écran d’accueil en cliquant sur Scan.
5. Allumez le réservoir O₂ , dirigez le débit vers la chambre d’induction et réglez le débit à 1 L/min.

3. Préparation des souris pour le dépistage par ultrasons, y compris l’épilation

1. Placez une souris dans la chambre à induction. Réglez le vaporisateur d’isoflurane à 2%-3% vol/vol pour l’induction de l’anesthésie.
2. Déterminer la profondeur appropriée de l’anesthésie par une absence de réponse au pincement des orteils et une fréquence respiratoire d’environ 1-2 respirations / s.
3. Appliquez un lubrifiant ophtalmique stérile sur chaque œil. Retirez la fourrure du dos et du ventre entre la dernière côte et le bassin à l’aide d’une tondeuse de taille appropriée.
4. Appliquez une fine couche de crème dépilatoire sur les régions ventrale et dorsale à imager (si nécessaire).
5. Replacez la souris dans la chambre d’induction pendant environ 3 à 5 minutes pour maintenir la profondeur appropriée de l’anesthésie pendant que la crème dépilatoire élimine les poils. Après ≤4 minutes, essuyez doucement la crème avec une serviette en papier propre et humide.
   REMARQUE: Une exposition prolongée à la crème dépilatoire est irritante et peut causer des lésions cutanées.

4. Injection intrapéritonéale de liquide pour augmenter le contraste entre les organes

1. Réchauffer une seringue de 3 à 10 mL remplie d’une solution isotonique stérile (p. ex. NaCl stérile à 0,9 % ou solution de sonneurs lactatés) à 35-40 °C en la plaçant entre un coussin chauffant et un tampon absorbant pendant plusieurs minutes. Placez un flacon de gel à ultrasons sur le coussin chauffant si la machine n’a pas de chauffe-eau.
2. Pour une souris de 20 à 25 g, injecter 1 à 2 mL de solution dans la cavité péritonéale.
   1. Fixez la souris par la peau dans une main, exposant le ventre.
   2. Tenez la souris à un angle de ~20°, avec le nez pointé vers le sol pour diriger les organes crâniennes en raison de la gravité.
   3. À l’aide d’une aiguille de petit calibre (25 G, 5/8 de longueur, seringue à tuberculine), ponctionner à travers la peau et la paroi abdominale du quadrant caudale droit de l’abdomen.
   4. Avant l’injection de liquides, pour éviter l’injection dans le système vasculaire ou le tractus gastro-intestinal, retirez avec une pression minimale. Si du sang ou un autre matériau pénètre dans la seringue, retirez l’aiguille. Utilisez une nouvelle aiguille et une nouvelle seringue, puis réessayez dans une position légèrement différente.
3. Si la souris se réveille pendant les injections, replacez-la dans la petite chambre d’induction pour l’anesthésie avec 2% -3% vol/vol isoflurane.

5. Imagerie échographique à partir d’une approche dorsale

1. Placez la souris en position couchée ventrale sur le tampon absorbant au-dessus d’un coussin chauffant (Figure 2A-C).
2. Placez solidement un cône de nez de rongeur sur le nez et le museau de la souris. Maintenir la profondeur anesthésique avec de l’isoflurane délivré à travers le cône nasal à 1%-2% vol/vol dans 100% O₂. Appliquez un lubrifiant ophtalmique stérile, au besoin, sur chaque œil.
3. Surveillez la souris pour une fréquence respiratoire régulière (1-2 / s) et un manque de réponse de pincement des orteils pour indiquer si l’anesthésie doit être ajustée.
4. Placez une petite quantité (~0,5-1 mL) de gel à ultrasons préchauffé abaxial (latéral) sur la colonne vertébrale de chaque côté de la souris anesthésiée, entre la dernière côte et le bassin.
5. Mettez une petite quantité de gel sur la sonde à ultrasons.
6. Placez la sonde parallèlement aux vertèbres avec l’avant de la sonde du côté crânien. Une marque indicatrice est présente sur la tête de sonde pour indiquer l’orientation correcte de la sonde. Notez le jour, l’heure, l’identification de l’animal, l’orientation de la sonde et le côté animal (droite, gauche, dorsale, ventrale) pour chaque nouvel ensemble d’images collectées.
7. Avec une souris en position couchée ventrale (peau dorsale touchant la sonde), balayez lentement la zone à la recherche du repère rénal (Figure 2B et Figure 3). Avec le rein en vue, tirez la sonde caudale pour trouver l’ovaire - une structure ovale à ronde légèrement hyperéchogène (Figure 4A, B) dans un coussinet adipeux ovarien très hyperéchogène bordé crânio-ventralement par le rein et dorso-latéralement par la paroi abdominale dorsale.
   REMARQUE: La pression caudale et latérale à l’ovaire peut diriger l’ovaire plus près de la paroi abdominale et loin des anses de l’intestin. L’ovaire est anatomiquement positionné contre la paroi abdominale dorsale, juste ventrale et latérale aux muscles épaxiaux et caudale au rein.
8. Ajustez le gain du signal à l’aide du curseur situé en bas de l’écran de contrôle pour améliorer le contraste de l’image.
9. Pour améliorer l’imagerie du rein, appliquez une pression avec un doigt sur l’abdomen controlatéral. Variez la pression et l’angle directement parallèle à la colonne vertébrale à ~20° ventral.
10. Une fois que l’organe d’intérêt est visible, collectez une vidéo en cliquant sur Enregistrer le clip ou Démarrer l’enregistrement, puis Arrêter l’enregistrement lorsque vous avez terminé pour conserver les images à un nombre prédéfini d’images.
11. Enregistrez des images uniques à partir d’une image en direct ou d’un enregistrement à l’aide du bouton Enregistrer l’image .
12. Pour imager l’utérus, tirez la sonde caudale jusqu’à ce que l’ovaire soit dans l’aspect le plus crânien du champ de vision. Faites varier la pression et l’angle de la sonde jusqu’à ce que l’utérus soit en vue.
13. Répétez la collecte de vidéos et d’images pour chaque organe d’intérêt.
14. Trouvez l’utérus longitudinal le long de la paroi abdominale dorsale avec la musculature latérale de la jambe également visible (Figure 4B).
    REMARQUE: La taille de l’utérus et le diamètre de la lumière peuvent varier avec la phase d’oestrus et l’état de la maladie.
15. Surveillez le mouvement péristaltique du tissu pour différencier les anses intestinales des cornes stationnaires utérines.

6. Collectez des images à partir d’une approche ventrale

1. Placez la souris en position couchée dorsale et vérifiez que la lubrification des yeux est suffisante et que le museau est bien ancré dans le cône nasal (Figure 2A).
2. Appliquez une petite quantité (~0,5-1 mL) de gel à ultrasons préchauffé sur l’abdomen ventral et appliquez la sonde à la ligne médiane juste crânienne du pubis pour localiser la vessie comme point de repère hypoéchogène (Figure 5).
   REMARQUE: Si la vessie est trop grande et obscurcit l’imagerie utérine, une légère pression peut être exercée sur le bas-ventre pour exprimer l’urine.
3. Tirez la sonde latéralement vers la vessie pour trouver les cornes utérines. Appliquez une légère pression numérique de l’un ou des deux côtés de la souris pour amener les cornes dans le champ de vision. Tenez la sonde perpendiculairement à la souris et balayez les deux côtés de l’abdomen pour capturer des vues transversales (coupes transversales) des deux cornes. Faites pivoter la sonde pour capturer des vues sagittales.
4. Après l’échographie, essuyez la souris du gel avec une serviette en papier et remettez-la dans sa cage pour récupérer. Les souris sont complètement éveillées en 2-5 min. Une fois qu’elle est complètement éveillée et ambulatoire, ramenez la souris dans la salle des animaux.
   REMARQUE: Un coussin chauffant à feu doux peut être placé sous la cage pour réchauffer la cage pour la récupération.
5. Au point final expérimental ou humain, euthanasier la souris. Idéalement, euthanasier la souris dans la cage domestique pour réduire le stress; Sinon, placez la souris dans une chambre propre. Délivrer du CO₂ sous pression à un taux de déplacement de 10% à 30% du volume de la chambre par minute. Après environ 5 minutes sans respiration visible, vérifier la mort par luxation cervicale. Procéder à une nécropsie abdominale pour la récolte de tumeurs.

Résultats

Les souris transgéniques Pax8-Cre-Arid1a-Pten à double délétion (iPAD) ont été maintenues sur un fond génétique mixte (129S, BALB/C, C57BL/6), comme décrit précédemment¹⁴. Les souris ont toutes été nourries avec une alimentation en doxycycline pendant 2 semaines pour induire la Cre recombinase. Dans des travaux antérieurs de notre groupe, la doxycycline a été administrée par gavage¹⁴; Cependant, dans cette étude, la méthode d’induction...

Discussion

Ce protocole examine l’utilité de l’échographie pour évaluer les changements morphologiques utérins dans la progression de l’adénocarcinome dans l’utérus chez la souris. Dans cette étude, en suivant longitudinalement l’induction du cancer de l’endomètre chez la souris, les détails anatomiques détectés par échographie se sont révélés être des indicateurs de pathologie macroscopique et histologique. Cela ouvre la porte à l’utilisation d’études longitudinales avec un plus petit nombre de so...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents and Equipment Used for Animal Care
Rodent Diet (2018, 625 Doxycycline)	Envigio	TD.01306	Mouse Feed
Reagents and Equipment Used for Ultrasound Imaging
10 mL injectable 0.9% NaCl	Hospira, Inc	RL-7302	Isotonic Fluid
Absorbent Pad with Plastic Backing	Daigger	EF8313	Absorbant Pads
Anesthesia Induction Chambers	Harvard Apparatus	75-2029	Induction Chamber
Anesthetic absorber kit with absorber canister, holder, tubing, & adapters	CWE, Inc	13-20000	Nose Cone and Tubing
Aquasonic Clear Ultrasound Gel (0.25 Liter)	Parker Laboratoies	08-03	Ultrasound Gel
BD Plastipak 3 mL Syringe	BD Biosciences	309657	Syringe
F/Air Scavenger Charcoal Canister	OMNICON	80120	Scavenging System for Anesthesia
Isoflurane, USP	Vet One	502017	Anesthesia Agent
M1050 Non-Rebreathing Mobile Anesthesia Machine	Scivena Scientific	M1050	Anestheic Vaporizer
MX550S, 25-55 MHz Transducer, 15mm, Linear	VisualSonics	MX550S	Ultrasound Transducer (Probe)
Nair Hair Aloe & Lanolin Hair Removal Lotion - 9.0 oz	Nair		Depilliating Cream
Philips Norelco Multigroomer All-in-One Trimmer Series 7000	Philips North America	MG7750	Clippers
PrecisionGlide 25 G 1" Needle	BD Biosciences	305125	Needle
Puralube Ophthalmic Ointment	Dechra	17033-211-38	Lubricating Eye Drops
Vevo 3100 Imaging System	VisualSonics	Vevo 3100	Ultrasound Machine
Vevo LAB 5.6.1	VisualSonics	Vevo LAB 5.6.1	Ultrasound Analysis Software
Vinyl Heating Pad with cover, 12 x 15"	Sunbeam	731-500-000R	Heating Pad
Wd Elements 2TB Basic Storage	Western Digital Elements	WDBU6Y0020BBK-WESN	Data Storage
Reagents and Equipment Used for Immunohistochemistry
10% w/v Formalin	Fischer Scientific	SF98-4	Tissue Fixation Buffer
Animal-Free Blocker and Diluent, R.T.U.	Vector Laboratories Inc.	SP5035	Antibody Blocker
Charged Super Frost Plus Glass Slides	VWR	4831-703	Tissue Mounting Slides
Citrate Buffer	MilliporeSigma	C9999-1000ML	Epitope Retrival Buffer (pTEN)
Cytoseal – 60	Thermo Scientific	8310-4	Resin for Slide Sealing
Gold Seal Cover Glass	Thermo Scientific	3322	Coverslide
Harris Modified Hematoxylin	MilliporeSigma	HHS32-1L	Counterstain Buffer
Hybridization Incubator (Dual Chamber)	Fischer Scientific	13-247-30Q	Oven to Melt Parraffin
ImmPACT DAB Substrate, Peroxidase (HRP)	Vector Laboratories Inc.	SK-4105	Signal Development Substrate
ImmPRESS HRP Goat Anti-Rabbit IgG Polymer Detection Kit, Peroxidase	Vector Laboratories Inc.	MP-7451	Secondary IHC Antibody
Oster 5712 Digital Food Steamer	Oster	5712	Vegetable Steamer for Epitope Retrival
rabbit mAB anti-ARID1a	abcam	ab182560	Primary IHC Antibody (1:1,000)
rabbit mAB anti-PTEN	Cell Signaling	9559	Primary IHC Antibody (1:100)
Scotts Tap Water Substitute	MilliporeSigma	S5134-100ML	"Blueing" Buffer
Tissue Path IV Cassette	Fischer Scientific	22272416	Tissue Fixation Cassette
Trilogy Buffer	Cell Marque	920P-10	Epitope Retrival Buffer (ARID1a)