Farelerde Tümör Baskılayıcıları Arid1a ve Pten'in Pax8'e Yönelik Delesyonunda Endometriyal Kanser Progresyonunun Non-İnvaziv Ultrason Değerlendirmesi

Özet

Bu protokol, endometriyal kanserin indüklenebilir bir fare modelinde, brüt ve histolojik değişikliklerle korelasyonlu ultrason görüntüleme kullanarak uterusta morfolojik değişikliklerin zaman içindeki ilerlemesini izlemek için bir yöntem açıklamaktadır.

Özet

Rahim kanserleri, bu modellerde kullanım kolaylığı ve genetik manipülasyon nedeniyle farelerde incelenebilir. Bununla birlikte, bu çalışmalar genellikle farklı kohortlarda birden fazla zaman noktasında ötenazi yapılan hayvanlarda ölüm sonrası patolojiyi değerlendirmekle sınırlıdır, bu da bir çalışma için gereken fare sayısını arttırır. Uzunlamasına çalışmalarda fareleri görüntülemek, bireysel hayvanlarda hastalığın ilerlemesini izleyebilir ve ihtiyaç duyulan fare sayısını azaltabilir. Ultrason teknolojisindeki ilerlemeler, dokulardaki mikrometre seviyesindeki değişikliklerin tespit edilmesini sağlamıştır. Ultrason, yumurtalıklarda folikül olgunlaşmasını ve ksenogreft büyümesini incelemek için kullanılmıştır, ancak fare uterusundaki morfolojik değişikliklere uygulanmamıştır. Bu protokol, indüklenmiş endometriyal kanser fare modelinde patolojinin in vivo görüntüleme karşılaştırmaları ile yan yana gelmesini inceler. Ultrason ile gözlenen özellikler, brüt patoloji ve histoloji tarafından görülen değişim derecesi ile tutarlıydı. Ultrasonografinin, gözlenen patolojinin oldukça prediktif olduğu ve ultrasonografinin farelerde kanser gibi uterus hastalıklarının uzunlamasına çalışmalarına dahil edilmesini desteklediği bulunmuştur.

Giriş

Fareler üreme bozuklukları için en önemli hayvan modellerinden biri olmaya devam etmektedir ^1,2,3. Yumurtalık ve rahim kanserlerinin genetiği değiştirilmiş veya indüklenmiş birkaç kemirgen modeli vardır. Bu çalışmalar tipik olarak, morfolojik ve patolojik değişikliklerdeki uzunlamasına eğilimleri yakalamak için farklı zaman noktalarında ötenazi yapılan çoklu kohortlara dayanmaktadır. Bu, tek bir farede kanser gelişimi hakkında sürekli veri elde etme yeteneğini önler. Ek olarak, bireysel fare hastalığı ilerleme durumunu bilmeden, müdahale çalışmaları, belirli bir hayvanda ilerlemenin tespiti için bireysel eşiklerden ziyade, önceden belirlenmiş zaman noktalarına ve önceki kohortların ortalama bulgularına dayanmaktadır ^4,5. Bu nedenle, canlı hayvanlarda uzunlamasına değerlendirmeye izin veren görüntüleme yaklaşımları, yeni ilaçların veya bileşiklerin test edilmesi için preklinik modelleri kolaylaştırmak ve patobiyolojinin anlaşılmasını hızlandırmak ve aynı zamanda titizliği ve tekrarlanabilirliği arttırmak için gereklidir⁶.

Ultrason görüntüleme (US), fare rahim kanseri progresyonunun uzunlamasına izlenmesi için çekici bir yöntemdir, çünkü diğer görüntüleme yöntemlerine kıyasla nispeten kolay ve ucuzdur, gerçekleştirilmesi kolaydır ve dikkate değer bir çözünürlüğe sahip olabilir ^6,7. Bu non-invaziv modalite, uyanık farelerde veya 5-10 dakikalık bir muayene kullanarak kısa sedasyon altındaki farelerde mikron ölçeğindeki özellikleri yakalayabilir. Ultrason mikroskopisi, fare yumurtalık folikülü gelişimini ölçmek için bir yöntem olarak doğrulanmıştır ⁸ ve implante edilmiş veya indüklenmiş neoplazinin büyümesi 9,10,11. Yüksek frekanslı US ayrıca perkütan intrauterin enjeksiyonlar¹² ve östrus döngüsü¹³ boyunca sıçan uterus değişimini gözlemlemek için de kullanılmıştır. Yüksek frekanslı US, standartlaştırılmış konum ve basınçla yüksek çözünürlüklü görüntüler yakalamak için dönüştürücüyü/probu tutmak için bir ray sistemi kullanan özel sabit platformlarda tutulan farelerle kullanılabilir; ancak, bu ekipman tüm kurumlarda mevcut değildir. El tipi transdüser tarama yöntemleri, daha az özel ekipmanla benimsenebilir ve farelerde hem klinik teşhis hem de araştırma uygulamaları için kullanılabilir.

Soru, elde tutulan, yüksek frekanslı problarla ABD görüntülemenin birkaç hafta boyunca uterus kanseri gelişimini izlemek için kullanılıp kullanılamayacağı sorusudur. Bağırsaklara benzer şekilde, kemirgen uterusu, karın içinde çok hareketli olan ve çoklu doku derinlikleri boyunca bitişik olan ince duvarlı, ince bir yapıdır ve görüntülemeyi böbrekler gibi nispeten hareketsiz organlardan daha zor hale getirir. Bu çalışma, ultrason ve histopatoloji ile gözlenen dokular arasındaki korelasyonu belirlemeyi, fare rahminin yerini belirlemek için işaretleri tanımlamayı ve endometriyal kanserin uzunlamasına değerlendirmesinin fizibilitesini belirlemeyi amaçlamıştır. Bu çalışma, US tarafından görüntülenen uterusun görünümü ile histopatoloji arasında kalitatif bir yazışma olduğunu gösteren verilerin yanı sıra farelerin birkaç hafta boyunca seri görüntülemesini sunmaktadır. Bu sonuçlar, elde tutulan US'nin farelerde endometriyal kanser gelişimini izlemek için kullanılabileceğini ve böylece özel ekipmana ihtiyaç duymadan rahim kanserini incelemek için bireysel fare uzunlamasına verilerini toplamak için bir fırsat yarattığını göstermektedir.

Protokol

Fareleri içeren tüm prosedürler ve deneyler, Johns Hopkins Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylanan protokollere göre gerçekleştirildi. Tüm prosedürler için, eldivenler ve tek kullanımlık izolasyon önlükleri de dahil olmak üzere uygun KKD giyildi. Kullanımdan hemen sonra kırmızı kutu keskin kaplara uygun şekilde atılan keskinleri kullanırken önlemler alındı. Bu protokolde kullanılan tüm malzemeler ve ekipmanlar hakkında ayrıntılar için Malzeme Tablosuna bakınız.

1. Doksisiklin ile iPAD (indüklenebilir Pten, Arid1a çift delesyon) farelerde endometriyal kanserin indüksiyonu

1. Daha önce tarif edildiği gibi karışık bir genetik arka plan (129S, BALB / C, C57BL / 6) üzerinde 10 Pax8-Cre-Arid1a-Pten çift delesyonlu (iPAD) transgenik fareyi (Şekil 1) koruyun¹⁴.
2. Doksisiklin tedavisinden önce her farenin yumurtalıklarının, yumurtalıklarının ve uteruslarının temel ultrason (2D) görüntülerini toplayın.
3. Gen delesyonunu indüklemek için dişi iPAD farelerine 7-8 haftalıktan başlayarak en az 2 hafta boyunca sadece doksisiklin içeren fare chow diyetleri (625 mg / kg yemde doksisiklin hiplat) sağlayın.

2. Ekipman kurulumu

1. Isıtma yastığını açın ve temiz bir emici ped ile örtün (hedef sıcaklık: 38 ° C).
2. İzofluran buharlaştırıcının ve_O2 tankının yeterince doldurulduğunu onaylayın. İçeriği düşükse yeniden doldurun ve değiştirin.
3. İndüksiyon odasını, burun konisini ve süpürme sistemini buharlaştırıcıya bağlayın.
4. Ultrason makinesini kurun.
   1. Rahim veya yumurtalık görüntülemesi için sırasıyla 32-56 MHz veya 70 MHz'e kadar aralıkta bir dönüştürücü (prob) seçin.
   2. Probu takın ve makineyi açın.
   3. Sistem önyüklendikten sonra, kullanıcı kimlik bilgileriyle oturum açmak ve giriş ekranına erişmek için kontrol panelini kullanın.
   4. Ana ekrandan, Uygulamalar sekmesine gidin ve Fare (küçük) karın modunu seçin.
   5. Ana ekrana dönmek için Tara'ya tıklayın ve canlı bir görüntünün görüntülenmesini bekleyin.
   6. Sol araç çubuğundaki seçeneklerden B-Modu'nu seçin.
   7. Görüntü kazancı ve derinliği gibi görüntü iyileştirmeye yönelik ek araçları görüntülemek veya saniyedeki kare sayısı gibi klip alma ayarlarını yapmak için Diğer Denetimler'e tıklayın.
   8. Görüntü ayarları seçildikten sonra, Tara'ya tıklayarak ana ekrana dönün.
5. O2 tankını açın, akışı indüksiyon odasına yönlendirin ve akış hızını 1 L / dak olarak ayarlayın.

3. Epilasyon da dahil olmak üzere ultrason taraması için farelerin hazırlanması

1. İndüksiyon odasına bir fare yerleştirin. Anestezi indüksiyonu için izofluran buharlaştırıcıyı %2-3 vol/vol değerine ayarlayın.
2. Uygun anestezi derinliğini, ayak parmağının sıkışmasına yanıt eksikliği ve 1-2 nefes / s civarında bir solunum hızı ile belirleyin.
3. Her göze steril oftalmik kayganlaştırıcı uygulayın. Kürkü dorsumdan çıkarın ve son kaburga ile pelvis arasındaki ventrumu uygun boyutta makaslarla çıkarın.
4. Görüntülenecek ventral ve dorsal bölgelere ince bir tüy dökücü krem tabakası uygulayın (gerekirse).
5. Uygun anestezi derinliğini korumak için fareyi yaklaşık 3-5 dakika boyunca indüksiyon odasına geri yerleştirin, tüy dökücü krem saçları çıkarmak için çalışır. ≤4 dakika sonra, kremayı temiz ve nemli bir kağıt havluyla nazikçe silin.
   NOT: Tüy dökücü kremaya daha uzun süre maruz kalmak tahriş edicidir ve cilt lezyonlarına neden olabilir.

4. Organlar arasındaki kontrastı arttırmak için intraperitoneal sıvı enjeksiyonu

1. Steril izotonik sıvı çözeltisi (örneğin, steril% 0.9 NaCl veya Laktasyonlu Zil Çözeltisi) ile doldurulmuş 3-10 mL'lik bir şırıngayı, birkaç dakika boyunca bir ısıtma yastığı ile emici bir ped arasına yerleştirerek 35-40 ° C'ye ısıtın. Makinenin ısıtıcısı yoksa, ısıtma yastığına bir şişe ultrason jeli yerleştirin.
2. 20-25 g'lık bir fare için, periton boşluğuna 1-2 mL çözelti enjekte edin.
   1. Fareyi bir elinizle tırnağıyla sabitleyerek ventrumu açığa çıkarın.
   2. Fareyi ~ 20 ° 'lik bir açıyla tutun, burun yerçekimi nedeniyle organları kafatasına yönlendirmek için yere işaret etti.
   3. Küçük bir ölçü iğnesi (25 G, 5/8 uzunluğunda, tüberkülin şırıngası) kullanarak, karın kaudal sağ kadranının derisinden ve karın duvarından delin.
   4. Sıvı enjeksiyonundan önce, vaskülatür veya GI kanalına enjeksiyondan kaçınmak için, minimum basınçla geri çekin. Şırıngaya kan veya başka bir malzeme girerse, iğneyi çıkarın. Yeni bir iğne ve şırınga kullanın ve biraz farklı bir pozisyonda tekrar deneyin.
3. Fare enjeksiyonlar sırasında uyanırsa,% 2 -% 3 hacim / hacim izofluran ile anestezi için küçük indüksiyon odasına geri yerleştirin.

5. Dorsal yaklaşımdan ultrason görüntüleme

1. Fareyi ventral yatışta emici ped üzerinde bir ısıtma yastığının üzerine yerleştirin (Şekil 2A-C).
2. Bir kemirgen burun konisini farenin burnuna ve namlusuna güvenli bir şekilde yerleştirin. Burun konisinden verilen izofluran ile anestezik derinliği %100_O2'de %1-%2 vol/vol aralığında koruyun. Her göze gerektiğinde steril oftalmik yağlayıcı uygulayın.
3. Anestezinin ayarlanması gerekip gerekmediğini belirtmek için fareyi düzenli bir solunum hızı (1-2 / s) ve ayak parmağı sıkışma yanıtı eksikliği açısından izleyin.
4. Anestezi uygulanan farenin her iki tarafındaki omurgaya, son kaburga ve pelvis arasına az miktarda (~ 0.5-1 mL) önceden ısıtılmış ultrason jeli abaksiyel (lateral) yerleştirin.
5. Ultrason probu üzerine az miktarda jel koyun.
6. Probu omurlara paralel olarak, probun önü kraniyal tarafa gelecek şekilde yerleştirin. Doğru prob yönünü göstermek için prob kafasında bir gösterge işareti bulunur. Toplanan her yeni görüntü kümesi için günü, saati, hayvan kimliğini, prob yönünü ve hayvan tarafını (sağ, sol, dorsal, ventral) kaydedin.
7. Ventral yatışta bir fare ile (dorsum derisi proba dokunuyor), böbrek dönüm noktası için bölgeyi yavaşça tarayın (Şekil 2B ve Şekil 3). Böbrek görünürken, böbrek tarafından kraniyo-ventral olarak ve dorso-lateral olarak dorsal karın duvarı tarafından sınırlanan çok hiperekoik bir yumurtalık yağ yastığı içinde yumurtalık - hafif hiperekoik oval ila yuvarlak bir yapıyı (Şekil 4A, B) bulmak için prob kaudalını çekin.
   NOT: Yumurtalık kaudal ve lateral basınç, yumurtalığı karın duvarına yaklaştırabilir ve bağırsağın halkalarından uzağa yönlendirebilir. Yumurtalık anatomik olarak dorsal karın duvarına karşı, sadece ventral ve lateral epaxial kaslara ve kaudal böbreğe doğru konumlandırılmıştır.
8. Görüntü kontrastını iyileştirmek için kontrol ekranının altındaki kaydırıcıyı kullanarak sinyal kazancını ayarlayın.
9. Böbreğin görüntülenmesini iyileştirmek için, kontralateral karın bölgesine parmağınızla basınç uygulayın. Basıncı ve açıyı omurgaya doğrudan paralelden ~ 20 ° ventral'e değiştirin.
10. İlgilendiğiniz organ görüntülendikten sonra, Klibi Kaydet veya Kaydı Başlat'a tıklayarak bir video toplayın ve ardından görüntüleri önceden ayarlanmış sayıda karede tutmak için bittiğinde Kaydı Durdurun .
11. Canlı bir görüntüden veya kayıttan tek kareleri Kareyi Kaydet düğmesiyle kaydedin.
12. Uterusu görüntülemek için, yumurtalık görüş alanının en kafatası yönünde olana kadar probu kaudal olarak çekin. Rahim görünene kadar prob basıncını ve açısını değiştirin.
13. İlgilendiğiniz her organ için video ve kare koleksiyonunu tekrarlayın.
14. Dorsal karın duvarı boyunca uzunlamasına uzanan uterusu, lateral bacak kas sistemi de görünümde olacak şekilde bulun (Şekil 4B).
    NOT: Rahim büyüklüğü ve lümen çapı östrusun evresine ve hastalık durumuna göre değişebilir.
15. Bağırsak halkalarını uterus sabit boynuzlarından ayırt etmek için dokuyu peristaltik hareket için izleyin.

6. Ventral yaklaşımdan görüntüler toplayın

1. Fareyi sırt yassılığına yerleştirin ve göz yağlamasının yeterli olduğunu ve namlunun burun konisinde güvenli bir şekilde durduğunu kontrol edin (Şekil 2A).
2. Ventral karın bölgesine az miktarda (~ 0.5-1 mL) önceden ısıtılmış ultrason jeli uygulayın ve mesaneyi hipoekoik bir dönüm noktası olarak bulmak için probu pubisin sadece kraniyalinin orta hattına uygulayın (Şekil 5).
   NOT: Mesane çok büyükse ve uterus görüntülemesini gizliyorsa, idrarı ifade etmek için alt karın bölgesine hafif basınç uygulanabilir.
3. Uterus boynuzlarını bulmak için probu lateral mesaneye çekin. Boynuzları görüş alanına getirmek için farenin her iki tarafından veya her iki tarafından hafif dijital basınç uygulayın. Probu fareye dik tutun ve her iki boynuzun enine görünümlerini (enine kesitleri) yakalamak için karnın her iki tarafını tarayın. Sagital görünümleri yakalamak için probu döndürün.
4. Ultrasondan sonra, fareyi bir kağıt havluyla jelden temizleyin ve iyileşmek için kafesine geri koyun. Fareler 2-5 dakika içinde tamamen uyanıktır. Tamamen uyanık ve ayakta durduğunda, fareyi hayvan odasına geri getirin.
   NOT: Geri kazanım için kafesi ısıtmak üzere kafesin altına düşük ısıda bir ısıtma yastığı yerleştirilebilir.
5. Deneysel veya insancıl bitiş noktasında, fareyi ötenazi yapın. İdeal olarak, stresi azaltmak için fareyi ev kafesinde ötenazi yapın; Alternatif olarak, fareyi temiz bir odaya yerleştirin. Basınçlı CO_2'yi , dakikada oda hacminin% 10-30'u arasında bir yer değiştirme hızında teslim edin. Görünür solunum olmadan yaklaşık 5 dakika sonra, servikal çıkık ile ölümü doğrulayın. Tümör hasadı için abdominal nekropsi ile devam edin.

Sonuçlar

Pax8-Cre-Arid1a-Pten çift delesyonlu (iPAD) transgenik fareler, daha önce tarif edildiği gibi karışık bir genetik arka plan (129S, BALB / C, C57BL / 6) üzerinde tutuldu¹⁴. Farelerin hepsi, Cre rekombinazını indüklemek için 2 hafta boyunca bir doksisiklin yemi ile beslendi. Grubumuz tarafından yapılan önceki çalışmalarda, doksisiklin gavage¹⁴ ile dozlandı; Bununla birlikte, bu güncel çalışmada, doksisiklin yem indüksiyon yöntemi veri...

Tartışmalar

Bu protokol, farelerde uterusta adenokarsinomun ilerlemesindeki uterus morfolojik değişikliklerini değerlendirmek için ultrasonun yararlılığını incelemektedir. Bu çalışmada, farelerde endometriyal kanser indüksiyonunu uzunlamasına takip ederek, ultrasonografi ile saptanan anatomik detayların kaba ve histolojik patolojinin göstergeleri olduğu bulunmuştur. Bu, farelerde rahim kanserlerinin ilerlemesini takip etmek için birden fazla zaman noktasında ultrason tarafından izlenen daha az sayıda fare ile u...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents and Equipment Used for Animal Care
Rodent Diet (2018, 625 Doxycycline)	Envigio	TD.01306	Mouse Feed
Reagents and Equipment Used for Ultrasound Imaging
10 mL injectable 0.9% NaCl	Hospira, Inc	RL-7302	Isotonic Fluid
Absorbent Pad with Plastic Backing	Daigger	EF8313	Absorbant Pads
Anesthesia Induction Chambers	Harvard Apparatus	75-2029	Induction Chamber
Anesthetic absorber kit with absorber canister, holder, tubing, & adapters	CWE, Inc	13-20000	Nose Cone and Tubing
Aquasonic Clear Ultrasound Gel (0.25 Liter)	Parker Laboratoies	08-03	Ultrasound Gel
BD Plastipak 3 mL Syringe	BD Biosciences	309657	Syringe
F/Air Scavenger Charcoal Canister	OMNICON	80120	Scavenging System for Anesthesia
Isoflurane, USP	Vet One	502017	Anesthesia Agent
M1050 Non-Rebreathing Mobile Anesthesia Machine	Scivena Scientific	M1050	Anestheic Vaporizer
MX550S, 25-55 MHz Transducer, 15mm, Linear	VisualSonics	MX550S	Ultrasound Transducer (Probe)
Nair Hair Aloe & Lanolin Hair Removal Lotion - 9.0 oz	Nair		Depilliating Cream
Philips Norelco Multigroomer All-in-One Trimmer Series 7000	Philips North America	MG7750	Clippers
PrecisionGlide 25 G 1" Needle	BD Biosciences	305125	Needle
Puralube Ophthalmic Ointment	Dechra	17033-211-38	Lubricating Eye Drops
Vevo 3100 Imaging System	VisualSonics	Vevo 3100	Ultrasound Machine
Vevo LAB 5.6.1	VisualSonics	Vevo LAB 5.6.1	Ultrasound Analysis Software
Vinyl Heating Pad with cover, 12 x 15"	Sunbeam	731-500-000R	Heating Pad
Wd Elements 2TB Basic Storage	Western Digital Elements	WDBU6Y0020BBK-WESN	Data Storage
Reagents and Equipment Used for Immunohistochemistry
10% w/v Formalin	Fischer Scientific	SF98-4	Tissue Fixation Buffer
Animal-Free Blocker and Diluent, R.T.U.	Vector Laboratories Inc.	SP5035	Antibody Blocker
Charged Super Frost Plus Glass Slides	VWR	4831-703	Tissue Mounting Slides
Citrate Buffer	MilliporeSigma	C9999-1000ML	Epitope Retrival Buffer (pTEN)
Cytoseal – 60	Thermo Scientific	8310-4	Resin for Slide Sealing
Gold Seal Cover Glass	Thermo Scientific	3322	Coverslide
Harris Modified Hematoxylin	MilliporeSigma	HHS32-1L	Counterstain Buffer
Hybridization Incubator (Dual Chamber)	Fischer Scientific	13-247-30Q	Oven to Melt Parraffin
ImmPACT DAB Substrate, Peroxidase (HRP)	Vector Laboratories Inc.	SK-4105	Signal Development Substrate
ImmPRESS HRP Goat Anti-Rabbit IgG Polymer Detection Kit, Peroxidase	Vector Laboratories Inc.	MP-7451	Secondary IHC Antibody
Oster 5712 Digital Food Steamer	Oster	5712	Vegetable Steamer for Epitope Retrival
rabbit mAB anti-ARID1a	abcam	ab182560	Primary IHC Antibody (1:1,000)
rabbit mAB anti-PTEN	Cell Signaling	9559	Primary IHC Antibody (1:100)
Scotts Tap Water Substitute	MilliporeSigma	S5134-100ML	"Blueing" Buffer
Tissue Path IV Cassette	Fischer Scientific	22272416	Tissue Fixation Cassette
Trilogy Buffer	Cell Marque	920P-10	Epitope Retrival Buffer (ARID1a)