Valutazione ecografica non invasiva della progressione del cancro dell'endometrio nella delezione diretta da Pax8 dei soppressori tumorali Arid1a e Pten nei topi

Riepilogo

Questo protocollo descrive un metodo per monitorare la progressione dei cambiamenti morfologici nel tempo nell'utero in un modello murino inducibile di cancro dell'endometrio utilizzando l'imaging ad ultrasuoni con correlazione ai cambiamenti grossolani e istologici.

Abstract

I tumori uterini possono essere studiati nei topi a causa della facilità di manipolazione e manipolazione genetica in questi modelli. Tuttavia, questi studi sono spesso limitati a valutare la patologia post-mortem negli animali sottoposti a eutanasia in più punti temporali in diverse coorti, il che aumenta il numero di topi necessari per uno studio. L'imaging dei topi negli studi longitudinali può monitorare la progressione della malattia nei singoli animali, riducendo il numero di topi necessari. I progressi nella tecnologia a ultrasuoni hanno permesso di rilevare cambiamenti a livello micrometrico nei tessuti. L'ecografia è stata utilizzata per studiare la maturazione del follicolo nelle ovaie e la crescita dello xenotrapianto, ma non è stata applicata ai cambiamenti morfologici nell'utero del topo. Questo protocollo esamina la giustapposizione della patologia con confronti di imaging in vivo in un modello murino di cancro dell'endometrio indotto. Le caratteristiche osservate dagli ultrasuoni erano coerenti con il grado di cambiamento osservato dalla patologia grossolana e dall'istologia. L'ecografia è risultata altamente predittiva della patologia osservata, supportando l'incorporazione dell'ecografia negli studi longitudinali delle malattie uterine come il cancro nei topi.

Introduzione

I topi rimangono uno dei modelli animali più importanti per i disturbi riproduttivi ^1,2,3. Esistono diversi modelli di roditori geneticamente modificati o indotti di tumori ovarici e uterini. Questi studi in genere si basano su più coorti eutanasiche in diversi punti temporali per catturare le tendenze longitudinali nei cambiamenti morfologici e patologici. Ciò impedisce la capacità di acquisire dati continui sullo sviluppo del cancro in un singolo topo. Inoltre, senza conoscere lo stato di progressione della malattia del singolo topo, gli studi di intervento si basano su punti temporali predeterminati e risultati medi di coorti precedenti piuttosto che soglie individuali per il rilevamento della progressione in un animale specifico ^4,5. Pertanto, sono necessari approcci di imaging che consentano la valutazione longitudinale negli animali vivi per facilitare i modelli preclinici per testare nuovi farmaci o composti e accelerare la comprensione della patobiologia, aumentando al contempo il rigore e la riproducibilità⁶.

L'ecografia (US) è un metodo interessante per il monitoraggio longitudinale della progressione del cancro uterino del topo perché è relativamente facile e poco costoso rispetto ad altri metodi di imaging, è facile da eseguire e può avere una notevole risoluzione ^6,7. Questa modalità non invasiva può catturare caratteristiche su scala micron in topi svegli o con topi sotto breve sedazione utilizzando un esame di 5-10 minuti. La microscopia ecografica è stata validata come metodo per misurare lo sviluppo del follicolo ovarico di topo ⁸ e la crescita di neoplasie impiantate o indotte 9,10,11. L'US ad alta frequenza è stata utilizzata anche per iniezioni intrauterine percutanee¹² e per osservare il cambiamento uterino del ratto durante il ciclo di estro¹³. Gli US ad alta frequenza possono essere utilizzati con mouse tenuti su piattaforme fisse specializzate utilizzando un sistema di binari per tenere il trasduttore / sonda per catturare immagini ad alta risoluzione con posizione e pressione standardizzate; Tuttavia, questa apparecchiatura non è disponibile in tutte le istituzioni. I metodi di scansione dei trasduttori portatili possono essere adottati con apparecchiature meno dedicate e utilizzati sia per la diagnostica clinica che per le applicazioni di ricerca nei topi.

Rimane la domanda se l'imaging statunitense con sonde portatili ad alta frequenza possa essere utilizzato per monitorare lo sviluppo del cancro uterino per più settimane. Simile all'intestino, l'utero del roditore è una struttura sottile e sottile che è molto mobile all'interno dell'addome ed è contigua attraverso più profondità di tessuto, rendendo l'imaging più difficile rispetto a organi relativamente immobili come i reni. Questo studio ha cercato di stabilire la correlazione tra i tessuti osservati dagli ultrasuoni e dall'istopatologia, definire i punti di riferimento per localizzare l'utero del topo e determinare la fattibilità della valutazione longitudinale del cancro dell'endometrio. Questo studio presenta dati che mostrano una corrispondenza qualitativa tra l'aspetto dell'utero ripreso da US e l'istopatologia, nonché l'imaging seriale dei topi per diverse settimane. Questi risultati indicano che gli US portatili possono essere utilizzati per monitorare lo sviluppo del cancro dell'endometrio nei topi, creando così un'opportunità per raccogliere dati longitudinali sui singoli topi per studiare il cancro uterino senza la necessità di attrezzature dedicate.

Protocollo

Tutte le procedure e gli esperimenti che coinvolgono i topi sono stati eseguiti secondo i protocolli approvati dal Johns Hopkins Animal Care and Use Committee. Per tutte le procedure, sono stati indossati DPI appropriati, compresi guanti e camici isolanti monouso. Sono state prese precauzioni durante la manipolazione di oggetti taglienti, che sono stati smaltiti correttamente in contenitori di taglienti a scatola rossa immediatamente dopo l'uso. Vedere la tabella dei materiali per i dettagli su tutti i materiali e le attrezzature utilizzati in questo protocollo.

1. Induzione del cancro dell'endometrio in topi iPAD ( Pten inducibile, doppia delezione Arid1a ) con doxiciclina

1. Mantenere 10 topi transgenici a doppia delezione (iPAD) Pax8-Cre-Arid1a-Pten (Figura 1) su un background genetico misto (129S, BALB/C, C57BL/6), come descritto in precedenza¹⁴.
2. Raccogliere immagini ecografiche di base (2D) delle ovaie, dell'ovidotto e dell'utero di ciascun topo prima del trattamento con doxiciclina.
3. Fornire esclusivamente diete di topo contenenti doxiciclina (doxiciclina iclato a 625 mg/kg di mangime) ai topi femmina iPAD per un minimo di 2 settimane a partire da 7-8 settimane di età per indurre la delezione genica.

2. Configurazione dell'attrezzatura

1. Accendere il termoforo e coprire con un tampone assorbente pulito (temperatura target: 38 °C).
2. Verificare che il vaporizzatore isoflurano e il serbatoio O₂ siano adeguatamente riempiti. Riempire e sostituire se il contenuto è basso.
3. Collegare la camera di induzione, il cono del naso e il sistema di scavenging al vaporizzatore.
4. Configurare la macchina ad ultrasuoni.
   1. Selezionare un trasduttore (sonda) con un intervallo di 32-56 MHz o fino a 70 MHz per l'imaging dell'utero o dell'ovaio, rispettivamente.
   2. Collegare la sonda e accendere la macchina.
   3. Dopo l'avvio del sistema, utilizzare il pannello di controllo per accedere con le credenziali utente e accedere alla schermata iniziale.
   4. Dalla schermata iniziale, vai alla scheda Applicazioni e seleziona Modalità addome (piccolo) del mouse.
   5. Fare clic su Scansione per tornare alla schermata iniziale e attendere che venga visualizzata un'immagine dal vivo.
   6. Seleziona B-Mode dalle opzioni sulla barra degli strumenti a sinistra.
   7. Fare clic su Altri controlli per visualizzare strumenti aggiuntivi per il perfezionamento dell'immagine, come il guadagno e la profondità dell'immagine, o per regolare le impostazioni di acquisizione della clip, ad esempio il numero di fotogrammi al secondo.
   8. Una volta selezionate le impostazioni dell'immagine, tornare alla schermata iniziale facendo clic su Scansione.
5. Accendere il serbatoio O₂ , dirigere il flusso verso la camera di induzione e impostare la portata su 1 L/min.

3. Preparazione di topi per lo screening ecografico, compresa la depilazione

1. Posizionare un mouse nella camera di induzione. Impostare il vaporizzatore isoflurano al 2%-3% vol/vol per l'induzione dell'anestesia.
2. Determinare la profondità appropriata dell'anestesia da una mancanza di risposta al pizzicamento delle dita dei piedi e una frequenza respiratoria intorno a 1-2 respiri / s.
3. Applicare lubrificante oftalmico sterile su ciascun occhio. Rimuovere la pelliccia dal dorso e dal ventrum tra l'ultima costola e il bacino con tosatrici di dimensioni appropriate.
4. Applicare un sottile strato di crema depilatoria sulle regioni ventrale e dorsale da visualizzare (se necessario).
5. Rimettere il mouse nella camera di induzione per circa 3-5 minuti per mantenere la profondità appropriata dell'anestesia mentre la crema depilatoria lavora per rimuovere i capelli. Dopo ≤4 minuti, pulire delicatamente la crema con un tovagliolo di carta umido pulito.
   NOTA: L'esposizione prolungata alla crema depilatoria è irritante e può causare lesioni cutanee.

4. Iniezione intraperitoneale di liquido per aumentare il contrasto tra gli organi

1. Riscaldare a 35-40 °C una siringa da 3-10 mL riempita con una soluzione di liquido isotonico sterile (ad es. soluzione sterile di NaCl allo 0,9% o di suonerie lattate) posizionandola tra una piastra riscaldante e un tampone assorbente per diversi minuti. Posizionare una bottiglia di gel per ultrasuoni sulla piastra riscaldante se la macchina non ha uno scaldavivande.
2. Per un topo da 20-25 g, iniettare 1-2 ml di soluzione nella cavità peritoneale.
   1. Fissare il mouse per la collottola in una mano, esponendo lo sventro.
   2. Tenere il mouse con un angolo di ~ 20 °, con il naso puntato verso il pavimento per dirigere gli organi cranialmente a causa della gravità.
   3. Utilizzando un ago di piccolo calibro (25 G, 5/8 di lunghezza, siringa di tubercolina), perforare la pelle e la parete addominale del quadrante caudale destro dell'addome.
   4. Prima dell'iniezione di liquidi, per evitare l'iniezione nel sistema vascolare o nel tratto gastrointestinale, tirare indietro con una pressione minima. Se sangue o altro materiale entra nella siringa, rimuovere l'ago. Usi un ago e una siringa nuovi e riprovi in una posizione leggermente diversa.
3. Se il topo si sveglia durante le iniezioni, rimetterlo nella piccola camera di induzione per l'anestesia con isoflurano 2% -3% vol/vol.

5. Imaging ecografico da un approccio dorsale

1. Posizionare il mouse in posizione ventrale sdraiata sul tampone assorbente sopra una piastra riscaldante (Figura 2A-C).
2. Posizionare un cono del naso del roditore in modo sicuro sul naso e sul muso del topo. Mantenere la profondità dell'anestetico con isoflurano erogato attraverso il cono del naso a 1% -2% vol / vol in 100% O₂. Applicare lubrificante oftalmico sterile, se necessario, su ciascun occhio.
3. Monitorare il mouse per una frequenza respiratoria regolare (1-2 / s) e una mancanza di risposta al pizzicamento delle dita dei piedi per indicare se l'anestesia deve essere regolata.
4. Posizionare una piccola quantità (~ 0,5-1 ml) di gel abassiale ad ultrasuoni preriscaldato (laterale) sulla colonna vertebrale su entrambi i lati del topo anestetizzato, tra l'ultima costola e il bacino.
5. Metti una piccola quantità di gel sulla sonda ad ultrasuoni.
6. Posizionare la sonda parallelamente alle vertebre con la parte anteriore della sonda sul lato cranico. Un segno indicatore è presente sulla testa della sonda per indicare il corretto orientamento della sonda. Registrare il giorno, l'ora, l'ID dell'animale, l'orientamento della sonda e il lato dell'animale (destro, sinistro, dorsale, ventrale) per ogni nuova serie di immagini raccolte.
7. Con un topo in posizione reclinata ventrale (pelle dorsale che tocca la sonda), scansionare lentamente l'area per il punto di riferimento del rene (Figura 2B e Figura 3). Con il rene in vista, tirare la sonda caudale per trovare l'ovaio, una struttura ovale o rotonda leggermente iperecogena (Figura 4A, B) all'interno di un cuscinetto di grasso ovarico molto iperecogeno che è delimitato cranio-ventralmente dal rene e dorso-lateralmente dalla parete addominale dorsale.
   NOTA: La pressione caudale e laterale all'ovaio può dirigere l'ovaio più vicino alla parete addominale e lontano dalle anse dell'intestino. L'ovaio è anatomicamente posizionato contro la parete addominale dorsale, appena ventrale e laterale ai muscoli epaxiali e caudale al rene.
8. Regola il guadagno del segnale utilizzando il cursore nella parte inferiore dello schermo di controllo per migliorare il contrasto dell'immagine.
9. Per migliorare l'imaging del rene, applicare pressione con un dito sull'addome controlaterale. Variare la pressione e l'angolo da direttamente parallelo alla colonna vertebrale a ~ 20 ° ventrale.
10. Una volta che l'organo di interesse è in vista, raccogli un video facendo clic su Salva clip o Avvia registrazione e quindi Interrompi registrazione al termine per conservare le immagini a un numero preimpostato di fotogrammi.
11. Salva singoli fotogrammi da un'immagine live o da una registrazione con il pulsante Salva fotogramma .
12. Per visualizzare l'utero, tirare la sonda caudalmente fino a quando l'ovaio è nell'aspetto più cranico del campo visivo. Variare la pressione e l'angolo della sonda fino a quando l'utero è in vista.
13. Ripeti la raccolta di video e fotogrammi per ogni organo di interesse.
14. Trova l'utero che corre longitudinale lungo la parete addominale dorsale con la muscolatura laterale della gamba anche in vista (Figura 4B).
    NOTA: La dimensione dell'utero e il diametro del lume possono variare con la fase di estro e lo stato di malattia.
15. Monitorare il tessuto per il movimento peristaltico per differenziare le anse intestinali dalle corna stazionarie uterine.

6. Raccogli immagini da un approccio ventrale

1. Posizionare il topo in posizione dorsale sdraiata e verificare che la lubrificazione oculare sia sufficiente e che il muso sia saldamente nel cono del naso (Figura 2A).
2. Applicare una piccola quantità (~ 0,5-1 ml) di gel ecografico preriscaldato sull'addome ventrale e applicare la sonda sulla linea mediana appena craniale del pube per individuare la vescica come punto di riferimento ipoecogeno (Figura 5).
   NOTA: Se la vescica è troppo grande e oscura l'imaging dell'utero, è possibile esercitare una leggera pressione sull'addome inferiore per esprimere l'urina.
3. Tirare la sonda lateralmente alla vescica per trovare le corna uterine. Applicare una leggera pressione digitale da uno o entrambi i lati del mouse per portare le trombe nel campo visivo. Tenere la sonda perpendicolare al mouse e scansionare entrambi i lati dell'addome per catturare viste trasversali (sezioni trasversali) di entrambe le corna. Ruotare la sonda per acquisire viste sagittali.
4. Dopo l'ecografia, pulire il mouse dal gel con un tovagliolo di carta e riportarlo nella sua gabbia per recuperare. I topi sono completamente svegli in 2-5 minuti. Una volta che è completamente sveglio e deambulante, riporta il topo nella stanza degli animali.
   NOTA: Una piastra riscaldante a fuoco basso può essere posizionata sotto la gabbia per riscaldare la gabbia per il recupero.
5. Al punto finale sperimentale o umano, eutanasia del topo. Idealmente, eutanasia il topo nella gabbia di casa per ridurre lo stress; In alternativa, posizionare il mouse in una camera pulita. Erogare CO₂ pressurizzato a una velocità di spostamento del 10%-30% del volume della camera al minuto. Dopo circa 5 minuti di assenza di respirazione visibile, verificare la morte per lussazione cervicale. Procedere con l'autopsia addominale per la raccolta del tumore.

Risultati

I topi transgenici a doppia delezione (iPAD) Pax8-Cre-Arid1a-Pten sono stati mantenuti su un background genetico misto (129S, BALB/C, C57BL/6), come descritto in precedenza¹⁴. I topi sono stati tutti alimentati con doxiciclina per 2 settimane per indurre Cre ricombinasi. In precedenti lavori del nostro gruppo, la doxiciclina è stata dosata con sonda gastrica¹⁴; Tuttavia, in questo studio, il metodo di induzione del mangime per doxiciclina ha funzionato in...

Discussione

Questo protocollo esamina l'utilità degli ultrasuoni per valutare i cambiamenti morfologici uterini nella progressione dell'adenocarcinoma nell'utero nei topi. In questo studio, seguendo l'induzione del cancro dell'endometrio nei topi longitudinalmente, i dettagli anatomici rilevati dagli ultrasuoni sono risultati essere indicatori di patologia grossolana e istologica. Questo apre la porta all'uso di studi longitudinali con un numero minore di topi monitorati mediante ultrasuoni in più punti temporali per seguire la pr...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents and Equipment Used for Animal Care
Rodent Diet (2018, 625 Doxycycline)	Envigio	TD.01306	Mouse Feed
Reagents and Equipment Used for Ultrasound Imaging
10 mL injectable 0.9% NaCl	Hospira, Inc	RL-7302	Isotonic Fluid
Absorbent Pad with Plastic Backing	Daigger	EF8313	Absorbant Pads
Anesthesia Induction Chambers	Harvard Apparatus	75-2029	Induction Chamber
Anesthetic absorber kit with absorber canister, holder, tubing, & adapters	CWE, Inc	13-20000	Nose Cone and Tubing
Aquasonic Clear Ultrasound Gel (0.25 Liter)	Parker Laboratoies	08-03	Ultrasound Gel
BD Plastipak 3 mL Syringe	BD Biosciences	309657	Syringe
F/Air Scavenger Charcoal Canister	OMNICON	80120	Scavenging System for Anesthesia
Isoflurane, USP	Vet One	502017	Anesthesia Agent
M1050 Non-Rebreathing Mobile Anesthesia Machine	Scivena Scientific	M1050	Anestheic Vaporizer
MX550S, 25-55 MHz Transducer, 15mm, Linear	VisualSonics	MX550S	Ultrasound Transducer (Probe)
Nair Hair Aloe & Lanolin Hair Removal Lotion - 9.0 oz	Nair		Depilliating Cream
Philips Norelco Multigroomer All-in-One Trimmer Series 7000	Philips North America	MG7750	Clippers
PrecisionGlide 25 G 1" Needle	BD Biosciences	305125	Needle
Puralube Ophthalmic Ointment	Dechra	17033-211-38	Lubricating Eye Drops
Vevo 3100 Imaging System	VisualSonics	Vevo 3100	Ultrasound Machine
Vevo LAB 5.6.1	VisualSonics	Vevo LAB 5.6.1	Ultrasound Analysis Software
Vinyl Heating Pad with cover, 12 x 15"	Sunbeam	731-500-000R	Heating Pad
Wd Elements 2TB Basic Storage	Western Digital Elements	WDBU6Y0020BBK-WESN	Data Storage
Reagents and Equipment Used for Immunohistochemistry
10% w/v Formalin	Fischer Scientific	SF98-4	Tissue Fixation Buffer
Animal-Free Blocker and Diluent, R.T.U.	Vector Laboratories Inc.	SP5035	Antibody Blocker
Charged Super Frost Plus Glass Slides	VWR	4831-703	Tissue Mounting Slides
Citrate Buffer	MilliporeSigma	C9999-1000ML	Epitope Retrival Buffer (pTEN)
Cytoseal – 60	Thermo Scientific	8310-4	Resin for Slide Sealing
Gold Seal Cover Glass	Thermo Scientific	3322	Coverslide
Harris Modified Hematoxylin	MilliporeSigma	HHS32-1L	Counterstain Buffer
Hybridization Incubator (Dual Chamber)	Fischer Scientific	13-247-30Q	Oven to Melt Parraffin
ImmPACT DAB Substrate, Peroxidase (HRP)	Vector Laboratories Inc.	SK-4105	Signal Development Substrate
ImmPRESS HRP Goat Anti-Rabbit IgG Polymer Detection Kit, Peroxidase	Vector Laboratories Inc.	MP-7451	Secondary IHC Antibody
Oster 5712 Digital Food Steamer	Oster	5712	Vegetable Steamer for Epitope Retrival
rabbit mAB anti-ARID1a	abcam	ab182560	Primary IHC Antibody (1:1,000)
rabbit mAB anti-PTEN	Cell Signaling	9559	Primary IHC Antibody (1:100)
Scotts Tap Water Substitute	MilliporeSigma	S5134-100ML	"Blueing" Buffer
Tissue Path IV Cassette	Fischer Scientific	22272416	Tissue Fixation Cassette
Trilogy Buffer	Cell Marque	920P-10	Epitope Retrival Buffer (ARID1a)