JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

تقدم هذه المقالة طريقتين تعتمدان على التهجين الفلوري في الموقع لتحديد محتوى كروموسومات X لخلايا المبيض في أنسجة قشرة المبيض غير المطعمة والمطعمة من الإناث المصابات بانحرافات كروموسومات X.

Abstract

يتعامل ملايين الأشخاص في جميع أنحاء العالم مع القضايا المتعلقة بالخصوبة. قد يكون انخفاض الخصوبة ، أو حتى العقم ، بسبب العديد من الأسباب المختلفة ، بما في ذلك الاضطرابات الوراثية ، والتي تعد تشوهات الكروموسومات هي الأكثر شيوعا. التهجين الفلوري في الموقع (FISH) هو طريقة معروفة ومستخدمة بشكل متكرر للكشف عن انحرافات الكروموسومات في البشر. يستخدم FISH بشكل رئيسي لتحليل تشوهات الكروموسومات في الحيوانات المنوية للذكور مع انحرافات الكروموسومات العددية أو الهيكلية. علاوة على ذلك ، يتم تطبيق هذه التقنية بشكل متكرر على الإناث للكشف عن انحرافات كروموسومات X المعروفة بأنها تسبب خلل تكوين المبيض. ومع ذلك ، لا تزال المعلومات حول محتوى الكروموسومات X لخلايا المبيض من الإناث المصابات بانحرافات كروموسومية X في الخلايا الليمفاوية و / أو الخلايا الشدقية غير متوفرة.

الهدف من هذه الدراسة هو تطوير الأبحاث الأساسية المتعلقة بانحرافات كروموسومات X في الإناث ، من خلال تقديم طريقتين تعتمدان على FISH لتحديد محتوى كروموسومات X لخلايا المبيض. أولا ، يتم وصف طريقة لتحديد محتوى الكروموسومات X لخلايا المبيض المعزولة (البويضات والخلايا الحبيبية والخلايا اللحمية) في أنسجة قشرة المبيض غير المطعمة من الإناث المصابات بانحرافات كروموسومات X. الطريقة الثانية موجهة إلى تقييم تأثير انحرافات الكروموسومات على تكوين الجريبات من خلال تحديد محتوى الكروموسومات X لخلايا المبيض من الجريبات الثانوية والغارية المشكلة حديثا في أنسجة المبيض ، من الإناث المصابات بانحرافات كروموسومية X بعد التطعيم طويل الأمد في الفئران التي تعاني من نقص المناعة. يمكن أن تكون كلتا الطريقتين مفيدتين في الأبحاث المستقبلية لاكتساب نظرة ثاقبة على القدرة الإنجابية للإناث المصابات بانحرافات كروموسومات X.

Introduction

العقم هو مشكلة صحية في الجهاز التناسلي الذكري أو الأنثوي ، ويؤثر على ما يقرب من 186 مليون فرد في سن الإنجابفي جميع أنحاء العالم 1. في ما لا يقل عن 35 ٪ من الأزواج المصابين بالعقم ، يحدث العقم بسبب اضطراب في الجهاز التناسلي للأنثى2. هناك العديد من العوامل التي يمكن أن تسبب العقم عند النساء ، مثل العوامل الوراثية ، وتشوهات الجهاز التناسلي ، وضعف الغدد الصماء ، والأمراض الالتهابية ، والعلاج علاجي المنشأ3.

توجد تشوهات وراثية في حوالي 10٪ من الإناث المصابات بالعقم 4,5. من بين جميع التشوهات الوراثية ، تعد انحرافات كروموسوم X السبب الأكثر شيوعا لخلل تكوين المبيض2. أفادت العديد من الدراسات أن انحرافات كروموسومات X لدى الإناث المصابات بمتلازمة تيرنر (TS) أو متلازمة ثلاثية إكس ترتبط بفشل المبيض المبكر بسبب الفقدان المتسارع للخلايا الجرثومية أو ضعف تكوين البويضة6،7،8.

يمكن تقسيم انحرافات كروموسوم X إلى: 1) انحرافات عددية ، حيث يختلف عدد الكروموسومات X ولكن الكروموسومات X سليمة. و 2) الانحرافات الهيكلية ، حيث اكتسب كروموسوم X أو فقد المادة الوراثية 3,9. الانحرافات العددية للكروموسوم X أكثر شيوعا من التشوهات الهيكلية وغالبا ما تكون ناجمة عن أخطاء تلقائية أثناء انقسام الخلايا 3,9. عندما يحدث مثل هذا الخطأ أثناء الانقسام الميوزي، فقد يؤدي إلى نشوء جاميتات اختلال الصيغة الصبغية، وفي النهاية إلى نسل به انحرافات كروموسومية في جميع الخلايا. عندما تنشأ عيوب الكروموسوم في الخلايا الجسدية نتيجة للأخطاء التي تحدث أثناء الانقسام في المراحل المبكرة من التولد ، فقد يؤدي ذلك إلى الفسيفساء. في هؤلاء الأفراد ، توجد كل من الخلايا ذات المحتوى الكروموسومي X الطبيعي والخلايا ذات الانحرافات الكروموسومية X.

في ثمانينيات القرن العشرين ، تم تطوير تقنية وراثية خلوية تسمى التهجين الفلوري في الموقع (FISH) لتصور وتحديد تسلسلات الحمض النووي المحددة على الطور الطوري والطور البينيالكروموسومات 10،11. تستخدم هذه التقنية مجسات الحمض النووي الموسومة بالفلورسنت للارتباط بتسلسل معين في الكروموسوم ، والذي يمكن تصوره بعد ذلك باستخدام مجهر مضان.

في الوقت الحاضر ، يستخدم FISH على نطاق واسع كأداة تشخيصية سريرية ويعتبر المعيار الذهبي في الكشف عن انحرافات الكروموسومات10. في مجال الطب التناسلي ، تم استخدام تحليل FISH على الحيوانات المنوية لاكتساب نظرة ثاقبة على محتوى الكروموسومات X للحيوانات المنوية في الذكور مع انحرافات كروموسومية عددية أو هيكلية في الخلايا الجسدية12،13،14. أظهرت هذه الدراسات أن الذكور الذين يعانون من انحرافات كروموسومية كانوا أكثر عرضة لتكرار أعلى من الحيوانات المنوية اختلال الصيغة الصبغية الموجودة في السائل المنوي مقارنة بالذكور الذين لديهم أنماط نووية طبيعية12،13،14.

على عكس الحيوانات المنوية ، لا يعرف سوى القليل جدا عن المحتوى الكروموسومي X لخلايا المبيض (بما في ذلك البويضات والخلايا الحبيبية / الثيكا والخلايا اللحمية) لدى الأفراد الذين يعانون من انحراف كروموسومي ، وكذلك العواقب المحتملة لاختلال الصيغة الصبغية لهذه الخلايا على إمكاناتها الإنجابية. أحد الأسباب المهمة لندرة المعلومات حول النمط النووي لخلايا المبيض مقارنة بالحيوانات المنوية هو حقيقة أن النساء يجب أن يخضعن لإجراء جراحي مثل ثقب الجريب أو الجراحة للحصول على البويضات أو أنسجة قشرة المبيض. لذلك ، يصعب الحصول على الأمشاج الأنثوية لأغراض البحث.

حاليا ، يتم إجراء دراسة تدخل قائمة على الملاحظة في هولندا لاستكشاف فعالية حفظ أنسجة المبيض بالتبريد لدى الإناث الشابات المصابات ب TS15. كان جزء واحد من نسيج قشرة المبيض للمريض متاحا لتحديد محتوى كروموسومات X لخلايا المبيض16,17. كجزء من الدراسة ، تم تطوير طريقة جديدة تعتمد على FISH لأنسجة قشرة المبيض المنفصلة لتحديد ما إذا كانت الانحرافات الكروموسومية موجودة في خلايا المبيض في الإناث اللائي يحملن انحرافا كروموسوميا في الخلايا الجسدية غير المبيضية ، مثل الخلايا الليمفاوية أو الخلايا الشدقية. بالإضافة إلى ذلك ، تم تحديد تأثير اختلال الصيغة الصبغية في خلايا المبيض على تكوين الجريبات أيضا. تحقيقا لهذه الغاية ، تم تعديل بروتوكول FISH المعمول به والذي يمكن من تحليل الأقسام النسيجية لأنسجة قشرة المبيض بعد تكوين الجريبات المستحث بشكل مصطنع أثناء زراعة الأجانب على المدى الطويل في الفئران التي تعاني من نقص المناعة. في هذه الدراسة ، نقدم طريقتين تعتمدان على FISH لتحديد محتوى الكروموسومات X في خلايا المبيض في أنسجة قشرة المبيض غير المطعمة والمطعمة في الإناث المصابات بانحرافات كروموسوم X ، بهدف تحسين العلوم الأساسية حول هذا الموضوع.

Protocol

تمت الموافقة على بروتوكول دراسة TurnerFertility من قبل اللجنة المركزية للبحوث التي تشمل البشر (NL57738.000.16). في هذه الدراسة ، تم الحصول على أنسجة قشرة المبيض ل 93 أنثى مصابة ب TS. المواد التي تتطلب احتياطات السلامة مدرجة في الجدول 1.

الجدول 1: احتياطات السلامة.

ماديخطر
حمض الخليكحروق جلدية شديدة وتهيج في الجهاز التنفسي
كولاجينازتهيج العينين والجهاز التنفسي والجلد
دابيتهيج العينين والجهاز التنفسي والجلد
دناز Iتهيج العينين والجهاز التنفسي والجلد
ايثانولشديد الاشتعال
فورمالدهيدسامة بعد الاستنشاق والابتلاع وملامسة الجلد
فورماميد
(في مجسات مضانة)		قد يضر الطفل الذي لم يولد بعد
ليبرازتهيج العينين والجهاز التنفسي والجلد
ميثانولشديدة الاشتعال وسامة عن طريق الاستنشاق والابتلاع وملامسة الجلد
نونيديت P40تهيج الجلد أو العينين
البيبسينتهيج العينين والجهاز التنفسي والجلد
بروتيناز كصعوبات في التنفس بعد الاستنشاق
زيلينشديدة الاشتعال ، سامة بعد الاستنشاق وملامسة الجلد. تجنب ملامسة العينين.

الجدول 1: المواد التي تتطلب احتياطات السلامة.

1. FISH على خلايا قشرة المبيض الفردية المعزولة

  1. تفكك أنسجة قشرة المبيض للحصول على خلايا فردية
    1. قطع أنسجة قشرة المبيض المحفوظة بالتبريد / المذابة إلى قطع صغيرة تبلغ حوالي 1 مم × 1 مم × 1 مم باستخدام مشرط.
    2. هضم شظايا الأنسجة إنزيميا في 4 مل من وسط L15 المسخن مسبقا (37 درجة مئوية) الذي يحتوي على مزيج إنزيم تفكك الأنسجة 0.1 مجم / مل ، و 10 ميكروغرام / مل DNase I ، و 1 مجم / مل كولاجيناز I من C. histolyticum لمدة أقصاها 75 دقيقة عند 37 درجة مئوية. ماصة مزيج الهضم صعودا وهبوطا كل 15 دقيقة.
    3. أوقف الهضم الأنزيمي بإضافة 4 مل من L15 البارد المكمل بمصل بقري جنيني بنسبة 10٪ (FBS). اغسل الأنسجة المنفصلة مرة واحدة باستخدام 8 مل من وسط L15 البارد عن طريق الطرد المركزي عند 500 × جم وأعد تعليقها في 500 ميكرولتر من وسط L15 دون دوامة لتجنب تلف الخلايا.
    4. انقل معلق الخلية الذي يحتوي إلى حد كبير على خلايا انسجة فردية وبصيلات صغيرة (بويضات محاطة بطبقة واحدة من الخلايا الحبيبية) إلى طبق بتري بلاستيكي وافحص تعليق الخلية تحت مجهر مجسم (تكبير 100x).
    5. التقط البصيلات الصغيرة (<50 ميكرومتر) يدويا باستخدام ماصة بلاستيكية 75 ميكرومتر وانقل البصيلات إلى قطرة من وسط L15 مع 10٪ FBS عند 4 درجات مئوية لمنع تجمع البصيلات. قم بإجراء التقاط الجريب لمدة أقصاها 30 دقيقة. لتحسين انتشار الخلايا المسامية قبل تحليل FISH ، انقل البصيلات المنقاة إلى محلول يحتوي على 0.06٪ تربسين ، 1 مجم / مل من حمض الإيثيلين ديامينيترايتيك (EDTA) ، و 1 مجم / مل من الجلوكوز واحتضان لمدة 20 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
    6. الحصول على خلايا انسجة المبيض من تعليق خلايا القشرة باستخدام ماصة بلاستيكية 75 ميكرومتر ، مع الحرص بشكل خاص على تجنب التلوث ببصيلات صغيرة.
  2. تحليل FISH لخلية المبيض الفردية
    1. نقل جريبات المبيض المعالجة (موصى بها n = 5-20) مع التربسين / EDTA / الجلوكوز أو الخلايا اللحمية (n > 1000) إلى قطرات من 5 ميكرولتر من 0.15 mM KCl / 15 μL من محلول ملحي مخزن بالفوسفات من Dulbecco (DPBS) على شريحة واحتضانها لمدة 20 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
    2. قم بتجفيف الشرائح وتثبيتها مسبقا في 300 ميكرولتر من 0.05 مللي مول KCl / 7.5٪ حمض الخليك / 22.5٪ ميثانول لمدة دقيقتين في درجة حرارة الغرفة (RT). قم بتغطية الشرائح بالميثانول / حمض الأسيتيك (3: 1) لمدة دقيقتين في RT لإنهاء التثبيت.
    3. اصنع 20 ضعفا من سترات الصوديوم القياسية (SSC) بإضافة 876 جم من كلوريد الصوديوم و 441 جم من ثنائي هيدرات سترات الصوديوم ثلاثي الصوديوم في 5 لتر من الماء المقطر. بعد ذلك ، أضف 100 مل من 20x SSC إلى 900 مل من الماء منزوع المعادن (ديمي) للحصول على 2x SSC. اغسل العينة في 2x SSC عند 73 درجة مئوية ، وقم بتغطيتها ب 100 ميكرولتر من 2٪ بروتيناز K ، وأغلقها بغطاء غطاء. احتضان الشرائح لمدة 10 دقائق عند 37 درجة مئوية في محطة التهجين.
    4. قم بإزالة غطاء الغطاء واغسل الشرائح لمدة 5 دقائق في DPBS في RT. ثبت العينة لمدة 5 دقائق مع 1٪ فورمالديهايد في RT. في هذه المرحلة ، لم يتم ربط المادة بالكامل بالشرائح الزجاجية وبالتالي لا ينبغي وضعها على منصة اهتزاز.
    5. اغسل الشرائح لمدة 5 دقائق في DPBS في RT ، متبوعا بالجفاف في 70٪ و 80٪ و 90٪ و 100٪ إيثانول لمدة 2 دقيقة لكل منهما. جفف العينة المجففة بالهواء وقم بتهجينها باستخدام مجسات تحمل علامات الفلورسنت.
    6. حدد مسبارا خاصا بالسنترومير للكروموسوم X ومسبارا مركزيا آخر خاصا بالكروموسوم كعنصر تحكم لتحديد محتوى الكروموسومات X لخلايا المبيض. في هذه الحالة ، يتم استخدام مجسات خاصة بالسنترومير للكروموسوم X (CEP X [DXZ1]) المسمى مباشرة ب Spectrum Green الفلوروكروم والكروموسوم 18 (CEP 18 [D18Z1]) المسمى مباشرة بالفلوروكروم SpectrumOrange.
    7. أضف 1 ميكرولتر من CEP X ، و 1 ميكرولتر من CEP 18 ، و 18 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتهجين إلى العينة وأغلقها بغطاء يتم لصقه على الشرائح لمنع تبخر المسبار أثناء التهجين. نقل الشرائح إلى محطة التهجين للتمسخ عند 73 درجة مئوية لمدة 3 دقائق ، تليها التهجين خلال الحضانة الليلية عند 37 درجة مئوية.
    8. قم بإزالة غطاء الغطاء وأي غراء متبقي من الشريحة بعد التهجين. اغسل الشرائح في 0.4x SSC / 0.3٪ Tween-20 عند 72 درجة مئوية لمدة دقيقتين ، تليها الحضانة لمدة دقيقة واحدة في 2x SSC / 0.1٪ Tween-20 في RT.
    9. قم بتجفيف الشرائح عن طريق الحضانة اللاحقة لمدة 2 دقيقة في 70٪ و 80٪ و 90٪ و 100٪ من الإيثانول وجفف الهواء في الظلام. قم بتغطية الشرائح بوسيط تثبيت يحتوي على 4 ′،6-دياميدينو -2-فينيليندول (DAPI). يحفظ عند -20 درجة مئوية لمدة 10 دقائق على الأقل قبل التحليل بواسطة المجهر الفلوري.
  3. التصوير
    1. افحص الإشارة (الإشارات) للكروموسوم X باستخدام مجهر مضان مرتبط ببرنامج معالجة الصور.
      1. أولا ، حدد الفلوروكروم DAPI.
        1. احصل على صورة عن طريق تحديد خلية جديدة > Live > Capture بتكبير 630x. ستظهر نافذة جديدة مع العتبة. اضبط الشريط الأزرق للعتبة على 0 لتقليل الخلفية والشريط الأحمر على الحد الأقصى (255) لجعل الإشارات أكثر إشراقا. انقر فوق قبول.
        2. ستظهر نافذة جديدة مع تحسين مع اقتراح أغمق / أكثر إشراقا (12) ونصف قطر (3) وعمق (1). استخدم القيم المقترحة أو اضبطها إذا لم تكن راضيا.
      2. ثانيا ، حدد الفلوروكروم SpectrumOrange وانقر فوق التقاط.
        1. اضبط الشريط الأزرق للعتبة على 0 لتقليل الخلفية والشريط الأحمر على الحد الأقصى (255) لجعل الإشارات أكثر إشراقا. انقر فوق قبول.
        2. ستظهر النافذة مع التحسين مع اقتراح أغمق / أكثر إشراقا (-11) ونصف قطر (2.7) وعمق (0.6). استخدم القيم المقترحة أو اضبطها إذا لم تكن راضيا.
      3. أخيرا ، حدد الفلوروكروم SpectrumGreen وانقر فوق التقاط.
        1. اضبط الشريط الأزرق للعتبة على 0 لتقليل الخلفية والشريط الأحمر على الحد الأقصى (255) لجعل الإشارات أكثر إشراقا. انقر فوق قبول.
        2. ستظهر النافذة مع التحسين مع اقتراح أغمق / أكثر إشراقا (0) ونصف قطر (3) وعمق (0). استخدم القيم المقترحة أو اضبطها إذا لم تكن راضيا. احفظ الصورة في ملف تم إنشاؤه حديثا.
          ملاحظة: تم تقييم الخلايا الجسدية فقط عندما كانت إشارتان من كروموسوم التحكم 18 مرئيتين. في معظم البويضات ، يمكن اكتشاف إشارة واحدة فقط لكل كروموسوم.
    2. قم بتخزين الشرائح في الظلام عند 4 درجات مئوية بعد التحليل لمنع فقدان الإشارات.

2. FISH على أقسام البارافين من أنسجة قشرة المبيض المطعمة

ملاحظة: تم تطعيم جزء واحد من أنسجة قشرة المبيض المحفوظة بالتبريد / المذابة ل 18 أنثى مصابة ب TS في الفئران التي تعاني من نقص المناعة المشترك الشديد (SCID) لمدة 5 أشهر. تم وصف إجراء التطعيم بالأجانب سابقا وتم إجراؤه في الجامعة الكاثوليكية في لوفان (بروكسل ، بلجيكا) باتباع الإرشادات المحلية للجنة البحوث الحيوانية فيما يتعلق برعاية الحيوان (المرجع 2014 / UCL / MD / 007) 18،19.

  1. اختيار أقسام من أنسجة قشرة المبيض المطعمة بالأشعة الخارجية التي تحتوي على بصيلات
    1. تثبيت أنسجة قشرة المبيض المطعمة بالأجانب في 4٪ فورمالديهايد وتضمين الأنسجة في البارافين. تقليم الكتل بمشرط لإزالة البارافين الزائد وقطع كتلة البارافين إلى سمك 4 ميكرومتر على ميكروتوم دوراني.
    2. حدد كل قسم سابع من شريط البارافين لتلطيخ الهيماتوكسيلين ويوزين (HE) لتحديد الأقسام التي تحتوي على بصيلات. ضع القسم في حمام مائي عند 40-45 درجة مئوية وقم بتركيبه على شرائح مجهر الكيمياء المناعية.
  2. إزالة البارافين وتلطيخ HE
    1. ضع الشرائح على موقد لمدة 10 دقائق عند 60 درجة مئوية ، وبعد ذلك اغمر الشرائح في 100٪ زيلين لمدة 5 دقائق. ليس من الضروري وضع الشرائح مباشرة على الموقد. رطب المقاطع لمدة 15 ثانية في الإيثانول بنسبة 100٪ ، متبوعا ب 2 × 15 ثانية في الإيثانول بنسبة 96٪. شطف الشرائح في ماء الصنبور لمدة 2 دقيقة.
    2. تلطيخ الشرائح في الهيماتوكسيلين لمدة 10 دقائق وبعد ذلك شطف الشرائح لفترة وجيزة في ماء الصنبور. اغمر الشرائح لفترة وجيزة في محلول بيكربونات (100 غرام من كبريتات المغنيسيوم و 10 غرام من بيكربونات الصوديوم في 5 لتر من الماء المقطر). شطف الشرائح في ماء الصنبور لمدة 5 دقائق.
    3. قم بتلطيخ الشرائح باستخدام eosin لمدة 4 دقائق وقم بتجفيف الشرائح ثلاث مرات باستخدام الإيثانول بنسبة 100٪ ، متبوعا بالزيلين. قم بتغطية بقع HE على الشرائح وقم بتقييم أقسام HE تحت المجهر الضوئي لتحديد الأقسام ذات البصيلات (تكبير 100x).
  3. المعالجة المسبقة والتهجين لأقسام البارافين ل DNA FISH
    1. حدد مقاطع جديدة تقع قبل أو بعد القسم الذي يحتوي على بصيلات من شريط البارافين. قم بتركيب قسم واحد على شريحة زجاجية. جفف أقسام البارافين لمدة 45 دقيقة على الأقل على موقد على حرارة 56 درجة مئوية. ليس من الضروري وضع الشرائح مباشرة على الموقد.
    2. قم بإزالة المقاطع في الزيلين لمدة 10 دقائق. اغمر الشرائح في 99.5٪ إيثانول واشطفها لمدة 5 دقائق في ماء الصنبور. قم بمعالجة الشرائح مسبقا بمحلول استرجاع الهدف (درجة حموضة منخفضة) لمدة 10 دقائق عند 96 درجة مئوية. بعد التبريد ، شطف الشرائح في الماء المقطر.
    3. عالج الشرائح لمدة 5 دقائق بحمض الهيدروكلوريك 0.01 M ، متبوعا بهضم البيبسين (200 وحدة / مل) لمدة 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية. شطف الشرائح مرة أخرى في 0.01 M حمض الهيدروكلوريك وبعد ذلك في برنامج تلفزيوني.
    4. ثبت الشرائح في 1٪ فورمالديهايد / برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق. شطف الشرائح لفترة وجيزة في برنامج تلفزيوني ، ثم مرة أخرى في الماء ديمي. جفف الشرائح بنسبة 99.5٪ من الإيثانول واتركها تجف في الهواء.
    5. حدد مسبارا خاصا بالسنترومير للكروموسوم X ومسبارا مركزيا آخر خاصا بالكروموسوم كعنصر تحكم لتحديد محتوى الكروموسومات X للخلايا الحبيبية. هنا ، يتم استخدام الكروموسوم 18 كعنصر تحكم.
    6. ضع 5 ميكرولتر من المسبار CEP 18 (D18Z1) المسمى مباشرة ب SpectrumGreen الفلوروكرومي والمسبار CEP X (DXZ1) المسمى مباشرة ب SpectrumRed الفلوروكروم على الشرائح المعالجة مسبقا. ضع غطاء وأغلق المنطقة بغراء الصور. ضع الشرائح في جهاز هجين للتمسخ عند 80 درجة مئوية لمدة 10 دقائق والتهجين طوال الليل عند 37 درجة مئوية.
    7. في اليوم التالي ، اشطف الشرائح لمدة 5 دقائق في 2x SSC عند 42 درجة مئوية ، تليها دقيقتان و 1 دقيقة شطف في 0.3٪ Nonidet P40 عند 73 درجة مئوية. قم بتحديث 2x SSC وشطف الشرائح مرة أخرى لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. قم بتغطية الكوفيت بحيث يتم الاحتفاظ بالأقسام في الظلام.
    8. شطف الشرائح لفترة وجيزة في الماء المقطر. جفف الشرائح بنسبة 99.5٪ من الإيثانول واتركها تجف في الهواء مرة أخرى. أخيرا ، قم بتركيب الشرائح بمحلول يحتوي على DAPI ووسيط التركيب.
  4. التصوير
    1. تحليل النتائج تحت المجهر الفلوري عند تكبير 630x. افتح برنامج معالجة الصور على الكمبيوتر. حدد FISH كملف تعريف.
    2. تحقق مما إذا كان انبعاث DAPI مضبوطا على 431 نانومتر والإثارة عند 359 نانومتر ، وانبعاث تكساس الأحمر عند 613 نانومتر والإثارة عند 595 نانومتر ، وانبعاث FITC عند 519 نانومتر والإثارة عند 495 نانومتر.
    3. احصل على صورة عن طريق تحديد Live > Capture Single Image. قم بتحسين جودة الصورة عن طريق ضبط التعريض والكسب عن طريق تحريك منزلق التعريض ومنزلق الكسب في قائمة الصورة على اليسار (على سبيل المثال، التعريض الضوئي: 212 مللي ثانية، والكسب: 7.9). يمكن أن يختلف التعرض والكسب المطلوبان لكل صورة ؛ راقب التغييرات أثناء هذه العملية للحصول على صورة محسنة. احفظ الصورة في ملف تم إنشاؤه حديثا.
    4. قم بتخزين الشرائح في الظلام عند 4 درجات مئوية بعد التحليل لمنع فقدان الإشارات.

النتائج

FISH على خلايا المبيض المعزولة قبل التطعيم
تم استخدام أنسجة قشرة المبيض المحفوظة بالتبريد من الإناث مع 45،X / 46،XX (المريض A) أو 45،X / 46،XX / 47،XXX (المريض B) TS لتوضيح النتائج باستخدام هذا البروتوكول. في المريض A ، كان لدى 50٪ من الخلايا الليمفاوية نمط نووي 45,X و 50٪ 46,XX. في المريض B ، كانت 38 ٪ من ا?...

Discussion

تحليل FISH هو تقنية معروفة للكشف عن انحرافات كروموسومات X في الخلايا الليمفاوية أو الخلايا الشدقية لكل من الذكور والإناث10. وصفت العديد من الدراسات FISH على الأمشاج للذكور الذين يعانون من انحرافات كروموسومية X ، ولكن المعلومات التفصيلية التي حصلت عليها FISH على خلايا المبيض من الإن?...

Disclosures

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

وينوه المؤلفون بمارجو فان براكيل ودومينيك سميتس وغيوم فان دي زاندي وباتريشيا فان كليف وميلان إنتزار على خبرتهم ومساعدتهم التقنية. مصادر التمويل: ميرك سيرونو (A16-1395) ، جودلايف ، وفيرينج.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Acetic acidBiosolve BV0001070602BS
Centrifuge 1200Hettich Universal4140
Collagenase ISigma131470
CoverslipVWR0631-0146
DAPIVectorH-1200
DNase IRoche10104159001
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline LonzaBE17-513Q
EDTAMerck108421
Eosin-YSigma1159350100
EthanolEMSURE1009832500
Fetal Bovine Serum (FBS)Life technology10100147
Fluorescence microscope for sections DM4 BLeica Microsystems 
Fluorescence microscope scope A1Zeiss AXIO
Fluorescent labeled probes for dissociated cellsAbbott DiagnosticsCEPX (DXZ1) 05J1023
CEP18 (D18Z1) 05J0818
Fluorescent labeled probes for tissue sectionsAbbott DiagnosticsCEP X (DXZ1 05J08-023
CEP 18 (D18Z1)  05J10-028
FormaldehydeSigma252549
GlucoseMerck108337
Glue (Fixogum)Leica MicrosystemsLK071A
HematoxylinSigma1159380025
Hybridization bufferAbott Diagnostics32-804826/06J67-001
Hybridization Station DakoS2451
Hydrochloric acidMerck1003171000
Image processing software individual ovarian cortex cells (Cytovision 7.7)Leica Biosystems
Image processing software on paraffine sections Leica Application Suitex (3.7.5.24914)
Immunohitochemistry microscope slidesDakoK802021-2
L15Lonza12-700Q
Liberase DHRoche05 401 151 001
Light microscopeZeiss West Germany
Magnesium sulphateMerckA335586
MethanolHoneywell14262-1L
Mounting mediumVectashield, VectorH-1000
Nonidet P40Sigma7385-1L
ParaffinPoth Hile2712.20.10
PepsinSigmaP7000-25G
Phosphate-Buffered Saline (PBS)Gibco11530546
Plastic pipetteCooperSurgical7-72-4075/1
Potassium chloride Merck1049361000
Proteinase KQiagen19131
Rotation microtome HM 355SThermo sceintific
ScalpelDahlhausen11.000.00.515
Slide for FISH on dissociated cellsThermo scientificJ1810AM1JZ
Sodium bicarbonateSigma55761-500G
Standard Sodium Citrate (SSC)Fisher Scientific, Invitrogen10515203
Stereomicroscope IX 70Olympus
Target Retrieval Solution   DakoGV80511-2
TrypsinSigmaT4799
Tween-20ThermoFisher85113
XyleneBOOM760518191000

References

  1. Vander Borght, M., Wyns, C. Fertility and infertility: Definition and epidemiology. Clinical Biochemistry. 62, 2-10 (2018).
  2. Yatsenko, S. A., Rajkovic, A. Genetics of human female infertility. Biology of Reproduction. 101 (3), 549-566 (2019).
  3. Yahaya, T. O., et al. Chromosomal abnormalities predisposing to infertility, testing, and management: a narrative review. Bulletin of the National Research Centre. 45 (1), 65 (2021).
  4. Foresta, C., Ferlin, A., Gianaroli, L., Dallapiccola, B. Guidelines for the appropriate use of genetic tests in infertile couples. European Journal of Human Genetics. 10 (5), 303-312 (2002).
  5. Heard, E., Turner, J. Function of the sex chromosomes in mammalian fertility. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (10), 002675 (2011).
  6. Reynaud, K., et al. Number of ovarian follicles in human fetuses with the 45,X karyotype. Fertility and Sterility. 81 (4), 1112-1119 (2004).
  7. Otter, M., Schrander-Stumpel, C. T., Curfs, L. M. Triple X syndrome: a review of the literature. European Journal of Human Genetics. 18 (3), 265-271 (2010).
  8. Modi, D. N., Sane, S., Bhartiya, D. Accelerated germ cell apoptosis in sex chromosome aneuploid fetal human gonads. Molecular Human Reproduction. 9 (4), 219-225 (2003).
  9. Hassold, T., Hunt, P. To err (meiotically) is human: the genesis of human aneuploidy. Nature Reviews Genetics. 2 (4), 280-291 (2001).
  10. Huber, D., von Voithenberg, L. V., Kaigala, G. V. Fluorescence in situ hybridization (FISH): History, limitations and what to expect from micro-scale FISH. Micro and Nano Engineering. 1, 15-24 (2018).
  11. Hu, L., et al. Fluorescence in situ hybridization (FISH): an increasingly demanded tool for biomarker research and personalized medicine. Biomarker Research. 2 (1), 3 (2014).
  12. Hwang, K., Weedin, J. W., Lamb, D. J. The use of fluorescent in situ hybridization in male infertility. Therapeutic Advances in Urology. 2 (4), 157-169 (2010).
  13. Ramasamy, R., Besada, S., Lamb, D. J. Fluorescent in situ hybridization of human sperm: diagnostics, indications, and therapeutic implications. Fertility and Sterility. 102 (6), 1534-1539 (2014).
  14. Chatziparasidou, A., Christoforidis, N., Samolada, G., Nijs, M. Sperm aneuploidy in infertile male patients: a systematic review of the literature. Andrologia. 47 (8), 847-860 (2015).
  15. Schleedoorn, M., et al. TurnerFertility trial: PROTOCOL for an observational cohort study to describe the efficacy of ovarian tissue cryopreservation for fertility preservation in females with Turner syndrome. BMJ Open. 9 (12), 030855 (2019).
  16. Peek, R., et al. Ovarian follicles of young patients with Turner's syndrome contain normal oocytes but monosomic 45,X granulosa cells. Human Reproduction. 34 (9), 1686-1696 (2019).
  17. Nadesapillai, S., et al. Why are some patients with 45,X Turner syndrome fertile? A young girl with classical 45,X Turner syndrome and a cryptic mosaicism in the ovary. Fertility and Sterility. 115 (5), 1280-1287 (2021).
  18. Dolmans, M. M., et al. Reimplantation of cryopreserved ovarian tissue from patients with acute lymphoblastic leukemia is potentially unsafe. Blood. 116 (16), 2908-2914 (2010).
  19. Dath, C., et al. Xenotransplantation of human ovarian tissue to nude mice: comparison between four grafting sites. Human Reproduction. 25 (7), 1734-1743 (2010).
  20. Cacciottola, L., Donnez, J., Dolmans, M. M. Ovarian tissue damage after grafting: systematic review of strategies to improve follicle outcomes. Reproductive BioMedicine Online. 43 (3), 351-369 (2021).
  21. Bishop, R. Applications of fluorescence in situ hybridization (FISH) in detecting genetic aberrations of medical significance. Bioscience Horizons. 3 (1), 85-95 (2010).
  22. Burgoyne, P. S., Mahadevaiah, S. K., Turner, J. M. The consequences of asynapsis for mammalian meiosis. Nature Reviews Genetics. 10 (3), 207-216 (2009).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

194

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved