Fluorescence In Situ Hybridization을 사용한 난소 세포의 X 염색체 이상 탐색

요약

이 기사는 X 염색체 이상이 있는 여성의 비이식 및 이식된 난소 피질 조직에서 난소 세포의 X 염색체 함량을 결정하기 위한 형광 제자리 혼성화를 기반으로 하는 두 가지 방법을 제시합니다.

초록

전 세계 수백만 명의 사람들이 다산과 관련된 문제를 다루고 있습니다. 생식력 감소 또는 불임은 염색체 이상이 가장 흔한 유전 질환을 비롯한 다양한 원인으로 인해 발생할 수 있습니다. FISH(Fluorescence in situ hybridization)는 인간의 염색체 이상을 감지하기 위해 잘 알려져 있고 자주 사용되는 방법입니다. FISH는 주로 수치적 또는 구조적 염색체 이상이 있는 남성의 정자에서 염색체 이상을 분석하는 데 사용됩니다. 또한, 이 기술은 난소 이형성을 유발하는 것으로 알려진 X 염색체 이상을 감지하기 위해 여성에게도 자주 적용됩니다. 그러나 림프구 및/또는 협측 세포에서 X 염색체 이상이 있는 여성의 난소 세포의 X 염색체 함량에 대한 정보는 여전히 부족합니다.

이 연구의 목적은 난소 세포의 X 염색체 함량을 확인하기 위해 FISH를 기반으로 한 두 가지 방법을 제시함으로써 여성의 X 염색체 이상에 관한 기초 연구를 발전시키는 것입니다. 먼저, X 염색체 이상을 갖는 여성으로부터 이식되지 않은 난소 피질 조직에서 단리된 난소 세포(난모세포, 과립구 세포 및 기질 세포)의 X 염색체 함량을 측정하는 방법이 설명된다. 두 번째 방법은 면역 저하 마우스에 장기간 이식 한 후 X 염색체 이상을 가진 여성으로부터 난소 조직에서 새로 형성된 2 차 및 전방 난포의 난소 세포의 X 염색체 함량을 결정함으로써 모낭 형성에 대한 염색체 이상의 영향을 평가하는 것입니다. 두 방법 모두 X 염색체 이상을 가진 여성의 생식 가능성에 대한 통찰력을 얻기 위한 향후 연구에 도움이 될 수 있습니다.

서문

불임은 남성 또는 여성의 생식 기관의 건강 문제로, 전 세계적으로 약 1억 8,600만 명의 가임기 개인에게 영향을 미칩니다¹. 불임 부부의 35% 이상에서 불임은 여성 생식 기관의 장애로 인해 발생한다². 여성 불임의 원인은 유전적 요인, 생식기 이상, 내분비 기능 장애, 염증성 질환, 의원성 치료 등 여러 가지가 있다³.

유전적 이상은 불임 여성의 약 10%에서 나타난다 ^4,5. 모든 유전적 이상 중에서 X 염색체 이상은 난소 이형성증의 가장 흔한 원인이다². 여러 연구에서 터너 증후군(Turner syndrome, TS) 또는 트리플 X 증후군(Triple X syndrome)이 있는 여성의 X 염색체 이상은 생식 세포의 가속화된 손실 또는 난소 형성 장애로 인한 조기 난소 부전과 관련이 있다고 보고되었다 ^6,7,8.<....

프로토콜

TurnerFertility 연구 프로토콜은 인간 피험자와 관련된 중앙 연구 위원회(NL57738.000.16)의 승인을 받았습니다. 이 연구에서는 TS를 가진 93명의 여성의 난소 피질 조직을 얻었습니다. 안전 예방 조치가 필요한 재료는 표 1에 나열되어 있습니다.

표 1: 안전 예방 조치.

재료	위험
아세트산	심한 피부 화상과 호흡기 자극
콜라게나제	눈, 호흡기 및 피부에 자극적입니다
증권 시세 표시기	눈, 호흡기 및 피부에 자극적입니다
DNase I	눈, 호흡기 및 피부에 자....

결과

이식 전 분리된 난소 세포에 대한 FISH
45,X/46,XX(환자 A) 또는 45,X/46,XX/47,XXX(환자 B) TS를 가진 여성의 냉동 보존된 난소 피질 조직을 사용하여 이 프로토콜을 사용한 결과를 설명했습니다. 환자 A에서 림프구의 50 %는 45,X 핵형을 가졌고 50 %는 46,XX를 가졌다. 환자 B에서 림프구의 38 %는 45,X, 28 %는 46,XX, 34 %는 47,XXX였다. 대조군인 X 염색체(녹색) 및 18번 염색체(빨간색)에 대한 중심체 특이적 ?.......

토론

FISH 분석은 남성과 여성 모두의 림프구 또는 협측 세포에서 X 염색체 이상을 검출하는 잘 알려진 기술이다¹⁰. 여러 연구에서 X 염색체 이상을 가진 남성의 배우자에 대해 FISH를 설명했지만 X 염색체 이상을 가진 여성의 난소 세포에 대해 FISH가 얻은 자세한 정보는 여전히^{부족합니다 14}. 이 기사는 X 염색체 이상이 있는 여성의 이식되지 않은 난소 피질 조직의 난소 .......

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetic acid	Biosolve BV	0001070602BS
Centrifuge 1200	Hettich Universal	4140
Collagenase I	Sigma	131470
Coverslip	VWR	0631-0146
DAPI	Vector	H-1200
DNase I	Roche	10104159001
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline	Lonza	BE17-513Q
EDTA	Merck	108421
Eosin-Y	Sigma	1159350100
Ethanol	EMSURE	1009832500
Fetal Bovine Serum (FBS)	Life technology	10100147
Fluorescence microscope for sections DM4 B	Leica Microsystems
Fluorescence microscope scope A1	Zeiss AXIO
Fluorescent labeled probes for dissociated cells	Abbott Diagnostics	CEPX (DXZ1) 05J1023 CEP18 (D18Z1) 05J0818
Fluorescent labeled probes for tissue sections	Abbott Diagnostics	CEP X (DXZ1 05J08-023 CEP 18 (D18Z1)  05J10-028
Formaldehyde	Sigma	252549
Glucose	Merck	108337
Glue (Fixogum)	Leica Microsystems	LK071A
Hematoxylin	Sigma	1159380025
Hybridization buffer	Abott Diagnostics	32-804826/06J67-001
Hybridization Station	Dako	S2451
Hydrochloric acid	Merck	1003171000
Image processing software individual ovarian cortex cells (Cytovision 7.7)	Leica Biosystems
Image processing software on paraffine sections	Leica Application Suitex (3.7.5.24914)
Immunohitochemistry microscope slides	Dako	K802021-2
L15	Lonza	12-700Q
Liberase DH	Roche	05 401 151 001
Light microscope	Zeiss West Germany
Magnesium sulphate	Merck	A335586
Methanol	Honeywell	14262-1L
Mounting medium	Vectashield, Vector	H-1000
Nonidet P40	Sigma	7385-1L
Paraffin	Poth Hile	2712.20.10
Pepsin	Sigma	P7000-25G
Phosphate-Buffered Saline (PBS)	Gibco	11530546
Plastic pipette	CooperSurgical	7-72-4075/1
Potassium chloride	Merck	1049361000
Proteinase K	Qiagen	19131
Rotation microtome HM 355S	Thermo sceintific
Scalpel	Dahlhausen	11.000.00.515
Slide for FISH on dissociated cells	Thermo scientific	J1810AM1JZ
Sodium bicarbonate	Sigma	55761-500G
Standard Sodium Citrate (SSC)	Fisher Scientific, Invitrogen	10515203
Stereomicroscope IX 70	Olympus
Target Retrieval Solution	Dako	GV80511-2
Trypsin	Sigma	T4799
Tween-20	ThermoFisher	85113
Xylene	BOOM	760518191000