利用荧光 原位 杂交探索卵巢细胞中的X染色体畸变

摘要

本文提出了两种基于荧光 原位 杂交的方法，以确定X染色体畸变女性非移植和移植卵巢皮层组织中卵巢细胞的X染色体含量。

摘要

全世界有数百万人处理有关生育的问题。生育能力下降，甚至不孕症，可能是由于许多不同的原因，包括遗传性疾病，其中染色体异常是最常见的。荧光 原 位杂交（FISH）是检测人类染色体畸变的众所周知且常用的方法。FISH主要用于分析具有数值或结构染色体畸变的雄性精子中的染色体异常。此外，该技术也经常应用于女性，以检测已知会导致卵巢发育不良的X染色体畸变。然而，仍然缺乏关于淋巴细胞和/或颊细胞中X染色体畸变的女性卵巢细胞的X染色体含量的信息。

本研究的目的是通过提出两种基于FISH的方法来鉴定卵巢细胞的X染色体含量，从而推进有关女性X染色体畸变的基础研究。首先，描述了一种测定X染色体畸变女性非移植卵巢皮层组织中分离的卵巢细胞（卵母细胞，颗粒细胞和基质细胞）的X染色体含量的方法。第二种方法旨在通过确定卵巢组织中新形成的二级和窦卵泡的卵巢细胞的X染色体含量来评估染色体畸变对卵泡发生的影响，这些卵巢组织中来自长期移植到免疫功能低下小鼠后具有X染色体畸变的雌性。这两种方法都可能有助于未来的研究，以深入了解具有X染色体畸变的女性的生殖潜力。

引言

不孕症是男性或女性生殖系统的健康问题，影响全世界约1.86亿育龄人¹。在至少35%的不孕夫妇中，不孕症是由女性生殖系统疾病引起的²。导致女性不孕的因素很多，如遗传因素、生殖道异常、内分泌功能障碍、炎症性疾病、医源^性治疗等3。

遗传异常存在于大约 10% 的不育女性中^4，5。在所有遗传异常中，X染色体畸变是卵巢发育不全的最常见原因²。一些研究报告，患有特纳综合征 （TS） 或三重 X 综合征的女性的 X 染色体畸变与生殖细胞加速丢失或卵子生成受损导致的卵巢早衰有关⁶，^7，8。

X染色体畸变可分为:1）数值畸变，其中X染色体数量不同但X染色体完整;2）结构畸变，其中X染色体获得或失去遗传物质^3，9。X染色体的数值畸变比结构异常更常见，通常是由^{细胞分裂过程中}的自发错误引起的3^，9。当减数分裂期间发生这种错误时，可能会导致非整倍体配子，并最终导致所有细胞中染色体畸变的后代。当体细胞中由于个体发生早期有丝分裂过程中发生的错误而导致体细胞中出现染色体缺陷时，可能会导致嵌合体。在这些个体中，存在具有正常X染色体含量的细胞和具有X染色体畸变的细胞。

在 1980 年代，开发了一种称为荧光 原位 杂交 （FISH） 的细胞遗传学技术，用于可视化和定位中期和间期染色体^10，11 上的特定核酸序列。该技术使用荧光标记的DNA探针与染色体中的特定序列结合，然后可以使用荧光显微镜将其可视化。

如今，FISH被广泛用作临床诊断工具，被认为是检测染色体畸变的金标准¹⁰。在生殖医学领域，对精子的FISH分析已被用于深入了解体细胞中具有数字或结构染色体畸变的男性精子的X染色体含量¹²，^13，14。这些研究表明，与具有正常核型^12，13，14的男性相比，染色体畸变的男性更有可能在其精液中出现更高的非整倍体精子的频率。

与精子相反，对染色体畸变个体卵巢细胞（包括卵母细胞、颗粒/膜细胞和基质细胞）的 X 染色体含量知之甚少，以及这些细胞的非整倍性对其生殖潜力的可能后果。与精子相比，卵巢细胞核型信息稀缺的一个重要原因是女性必须接受侵入性手术，例如卵泡穿刺或手术以获得卵母细胞或卵巢皮层组织。因此，很难获得用于研究目的的雌配子。

目前，荷兰正在进行一项观察性干预研究，以探索卵巢组织冷冻保存对TS¹⁵年轻女性的疗效。患者的卵巢皮层组织的一个片段可用于鉴定卵巢细胞的X染色体含量^16，17。作为研究的一部分，开发了一种基于解离卵巢皮层组织的FISH的新方法，以确定在非卵巢体细胞（如淋巴细胞或颊细胞）中携带染色体畸变的女性卵巢细胞中是否存在染色体畸变。此外，还确定了卵巢细胞中非整倍性对卵泡生成的影响。为此，修改了一个已建立的FISH方案，以便在免疫功能低下的小鼠长期异种移植期间人工诱导的卵泡生成后分析卵巢皮层组织的组织学切片。在这项研究中，我们提出了两种基于FISH的方法来确定X染色体畸变女性非移植和移植卵巢皮层组织中卵巢细胞中的X染色体含量，旨在提高该主题的基础科学。

研究方案

特纳生育研究方案已获得涉及人类受试者研究的中央委员会（NL57738.000.16）的批准。本研究共获取93例TS女性卵巢皮层组织。需要安全预防措施的材料列于 表1中。

表 1:安全预防措施。

材料	危险
醋酸	严重的皮肤灼伤和呼吸系统刺激
胶原 酶	刺激眼睛、呼吸系统和皮肤
达皮	刺激眼睛、呼吸系统和皮肤
脱氧核糖核酸酶 I	刺激眼睛、呼吸系统和皮肤
乙醇	高度易燃
甲醛	吸入、摄入和皮肤接触后有毒
甲酰胺 （在荧光探针中）	可能会伤害未出生的孩子
解放酶	刺激眼睛、呼吸系统和皮肤
甲醇	高度易燃，吸入、摄入和皮肤接触有毒
诺尼德 P40	刺激皮肤或眼睛
胃蛋白酶	刺激眼睛、呼吸系统和皮肤
蛋白酶K	吸入后呼吸困难
二甲苯	高度易燃，吸入和皮肤接触后有毒。避免接触眼睛。

表 1:需要安全预防措施的材料。

1. 对分离的单个卵巢皮层细胞进行 FISH

1. 解离卵巢皮层组织以获得单个细胞
   1. 使用手术刀将冷冻保存/解冻的卵巢皮层组织切成大约 1 mm x 1 mm x 1 mm 的小块。
   2. 在含有 0.1 mg/mL 组织解离酶混合物、10 μg/mL DNase I 和 1 mg/mL 溶 组织梭菌 胶原酶 I 的 4 mL 预热 （37 °C） L15 培养基中酶消化组织碎片，在 37 °C 下最多 75 分钟。 每 15 分钟上下移取消化混合物。
   3. 通过添加 4 mL 补充有 10% 胎牛血清 （FBS） 的冷 L15 来停止酶消化。用 8 mL 冷 L15 培养基以 500 x g 离心洗涤解离的组织一次，并在不涡旋的情况下重悬于 500 μL L15 培养基中以避免损坏细胞。
   4. 将含有大部分单个基质细胞和小卵泡（被单层颗粒细胞包围的卵母细胞）的细胞悬液转移到塑料培养皿中，并在体视显微镜（100倍放大）下检查细胞悬液。
   5. 使用75μm塑料移液管手动拾取小卵泡（<50μm），并将卵泡转移到4°C下补充有10%FBS的L15培养基液滴中，以防止卵泡聚集。进行卵泡拾取最多30分钟。为了在FISH分析之前改善滤泡细胞扩散，将纯化的卵泡转移到0.06%胰蛋白酶，1mg / mL乙二胺四乙酸（EDTA）和1mg / mL葡萄糖的溶液中，并在37°C下孵育20分钟。
   6. 使用75μm塑料移液管从皮层细胞悬液中获取卵巢基质细胞，特别注意避免被小卵泡污染。
2. 单个卵巢细胞的FISH分析
   1. 将处理过的卵巢卵泡（推荐n = 5-20）与胰蛋白酶/ EDTA /葡萄糖或基质细胞（n > 1，000）转移到5μL的0.15mM KCl / 15μLDulbecco磷酸盐缓冲盐水（DPBS）的液滴上载玻片上，并在37°C下孵育20分钟。
   2. 在室温（RT）下干燥并将载玻片预固定在300μL的0.05mM KCl/7.5%乙酸/22.5%甲醇中2分钟。在室温下用甲醇/乙酸（3:1）覆盖载玻片2分钟以完成固定。
   3. 通过在 5 L 蒸馏水中加入 876 克氯化钠和 441 克柠檬酸三钠二水合物制成 20 倍标准柠檬酸钠 （SSC）。接下来，将 100 mL 的 20x SSC 加入 900 mL 软化 （demi） 水中以获得 2x SSC。在73°C下用2x SSC洗涤样品，用100μL的2%蛋白酶K覆盖，并用盖玻片密封。将载玻片在37°C下在杂交站中孵育10分钟。
   4. 取下盖玻片并在室温下在DPBS中清洗载玻片5分钟。 在室温下用1%甲醛固定样品5分钟。在此阶段，材料尚未完全附着在载玻片上，因此不应放置在摇晃的平台上。
   5. 在室温下在DPBS中洗涤载玻片5分钟，然后在随后的70%，80%，90%和100%乙醇中脱水2分钟。风干脱水样品，并与荧光标记的探针杂交。
   6. 选择一种X染色体着丝粒特异性探针和另一种染色体特异性着丝粒探针作为对照，以确定卵巢细胞的X染色体含量。在这种情况下，使用直接用荧光染料SpectrumGreen标记的X染色体（CEP X [DXZ1]）和直接用荧光染料SpectrumOrange标记的18号染色体（CEP 18 [D18Z1]）的着丝粒特异性探针。
   7. 向样品中加入 1 μL CEP X、1 μL CEP 18 和 18 μL 杂交缓冲液，并用粘在载玻片上的盖玻片密封，以防止探针在杂交过程中蒸发。将载玻片转移到杂交站，在73°C下变性3分钟，然后在37°C孵育过夜期间杂交。
   8. 杂交后，从载玻片上取下盖玻片和任何剩余的胶水。在72°C下在0.4x SSC / 0.3%吐温-20中洗涤载玻片2分钟，然后在室温下在2x SSC / 0.1%吐温-20中孵育1分钟。
   9. 随后在70%、80%、90%和100%乙醇中孵育2分钟，并在黑暗中风干，使载玻片脱水。用含有 4′，6-二脒基-2-苯基吲哚 （DAPI） 的封片剂覆盖载玻片。在通过荧光显微镜分析之前，在-20°C下保持至少10分钟。
3. 成像
   1. 使用链接到图像处理软件的荧光显微镜检查X染色体的信号。
      1. 首先，选择荧光染料DAPI。
         1. 通过选择"新细胞"> 在 630 倍放大倍率下实时>捕获来获取图像。将出现一个带有阈值的新窗口。将阈值的蓝色条设置为 0 以最小化背景，将红色条设置为最大值 （255） 以使信号更亮。单击接受。
         2. 将出现一个带有增强功能的新窗口，其中包含更暗/更亮 （12）、半径 （3） 和深度 （1） 的建议。使用建议的值，如果不满意，请进行调整。
      2. 其次，选择荧光染料光谱橙色，然后单击捕获。
         1. 将阈值的蓝色条设置为 0 以最小化背景，将红色条设置为最大值 （255） 以使信号更亮。单击接受。
         2. 将显示具有增强功能的窗口，并建议显示更暗/更亮 （-11）、半径 （2.7） 和深度 （0.6）。使用建议的值，如果不满意，请进行调整。
      3. 最后，选择 荧光染料光谱绿 ，然后单击 捕获。
         1. 将阈值的蓝色条设置为 0 以最小化背景，将红色条设置为最大值 （255） 以使信号更亮。单击接受。
         2. 将显示具有增强功能的窗口，并显示更暗/更亮 （0）、半径 （3） 和深度 （0） 的建议。使用建议的值，如果不满意，请进行调整。将图像保存在新创建的文件中。
            注意:仅当对照染色体18的两个信号可见时，才评估体细胞。在大多数卵母细胞中，每条染色体只能检测到一个信号。
   2. 分析后将载玻片储存在4°C的黑暗中，以防止信号丢失。

2. 移植卵巢皮层组织石蜡切片上的 FISH

注意:将18名患有TS的女性的冷冻保存/解冻卵巢皮层组织的一个片段异种移植到严重联合免疫缺陷（SCID）小鼠中5个月。异种移植程序之前已经描述过，并在鲁汶天主教大学（比利时布鲁塞尔）按照动物研究委员会关于动物福利的当地指导方针（参考2014/UCL/MD/007）进行^18，19。

1. 选择含有卵泡的异种移植卵巢皮层组织切片
   1. 将异种移植的卵巢皮层组织固定在4%甲醛中，并将组织嵌入石蜡中。用手术刀修剪块以去除多余的石蜡，并在旋转切片机上将石蜡块切割成 4 μm 厚。
   2. 选择石蜡带的每七个切片进行苏木精和伊红 （HE） 染色，以确定哪些切片含有卵泡。将该切片置于40-45°C的水浴中，并将它们安装在免疫组织化学显微镜载玻片上。
2. 脱蜡和HE染色
   1. 将载玻片放在60°C的炉子上10分钟，然后将载玻片浸入100%二甲苯中5分钟。没有必要将滑梯直接放在炉子上。在100%乙醇中水合切片15秒，然后在96%乙醇中水合2 x 15秒。用自来水冲洗载玻片2分钟。
   2. 将载玻片用苏木精染色10分钟，然后在自来水中短暂冲洗载玻片。将载玻片短暂浸入碳酸氢盐溶液（100g硫酸镁和10g碳酸氢钠在5L蒸馏水中）。用自来水冲洗载玻片5分钟。
   3. 用伊红对载玻片复染4分钟，并用100%乙醇脱水载玻片三次，然后用二甲苯脱水。盖玻片上的HE染色剂，并在光学显微镜下评估HE切片，以选择具有卵泡的切片（100倍放大）。
3. DNA鱼石蜡切片的预处理和杂交
   1. 从石蜡色带中选择位于包含卵泡的切片之前或之后的新切片。在载玻片上安装一个部分。在56°C的炉子上干燥石蜡部分至少45分钟。 没有必要将滑梯直接放在炉子上。
   2. 将切片在二甲苯中脱蜡10分钟。将载玻片浸入99.5%乙醇中，并在自来水中冲洗5分钟。用目标检索溶液（低pH）在96°C下预处理载玻片10分钟。 冷却后，用蒸馏水冲洗载玻片。
   3. 用0.01M盐酸处理载玻片5分钟，然后在37°C下消化胃蛋白酶消化（200U / mL）15分钟。 再次用0.01M盐酸冲洗载玻片，随后在PBS中冲洗载玻片。
   4. 将载玻片固定在1%甲醛/ PBS中5分钟。在PBS中短暂冲洗载玻片，然后在半水中再次冲洗。将载玻片在99.5%乙醇中脱水，并使其风干。
   5. 选择一个X染色体着丝粒特异性探针和另一个染色体特异性着丝粒探针作为对照，以确定颗粒细胞的X染色体含量。在这里，18号染色体被用作对照。
   6. 在预处理的载玻片上应用 5 μL 直接用荧光染料光谱绿标记的探针 CEP 18 （D18Z1） 和直接用荧光染料光谱红色标记的探针 CEP X （DXZ1）。应用盖玻片并用照片胶密封该区域。将载玻片放入杂交器中，在80°C下变性10分钟，并在37°C下杂交过夜。
   7. 第二天，在42°C下在2x SSC中冲洗载玻片5分钟，然后在73°C下用0.3%Nonidet P40冲洗2分钟和1分钟。 刷新2x SSC并在室温下再次冲洗载玻片5分钟。盖上比色皿，使切片保持在黑暗中。
   8. 用蒸馏水短暂冲洗载玻片。将载玻片在99.5%乙醇中脱水，然后再次风干。最后，用含有DAPI和安装介质的溶液安装载玻片。
4. 成像
   1. 在630倍放大倍率的荧光显微镜下分析结果。打开计算机上的图像处理软件。选择 FISH 作为配置文件。
   2. 检查DAPI发射是否设置为431 nm，激发设置为359 nm，德克萨斯红发射设置为613 nm，激发设置为595 nm，FITC发射是否设置为519 nm，激发是否设置为495 nm。
   3. 通过选择实时>捕获单个图像来获取图像。通过移动左侧"图像"菜单中的"曝光滑块"和"增益滑块"来调整曝光和增益，从而优化图像质量（例如，曝光:212 ms，增益:7.9）。所需的曝光和增益可能因图像而异;观察此过程期间的变化以获得优化的图像。将图像保存在新创建的文件中。
   4. 分析后将载玻片储存在4°C的黑暗中，以防止信号丢失。

结果

移植前分离卵巢细胞上的 FISH
使用具有45，X / 46，XX（患者A）或45，X / 46，XX / 47，XXX（患者B）TS的女性冷冻保存的卵巢皮层组织来说明使用该协议的结果。在患者A中，50%的淋巴细胞具有45，X核型，50%具有46，XX。在患者B中，38%的淋巴细胞为45，X，28%为46，XX，34%为47，XXX。X号染色体（绿色）和18号染色体的着丝粒特异性探针作为对照（红色）用于确定从未接受异种移植的TS患者的卵巢?...

讨论

FISH 分析是一种众所周知的技术，用于检测男性和女性淋巴细胞或颊细胞中的 X 染色体畸变¹⁰.一些研究已经描述了FISH对X染色体畸变的男性配子的影响，但FISH获得的关于X染色体畸变女性卵巢细胞的详细信息仍然缺乏¹⁴。本文提出了基于FISH的新方法，以确定X染色体畸变女性的非移植和移植卵巢皮层组织的卵巢细胞中是否存在非整倍性。

在非?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetic acid	Biosolve BV	0001070602BS
Centrifuge 1200	Hettich Universal	4140
Collagenase I	Sigma	131470
Coverslip	VWR	0631-0146
DAPI	Vector	H-1200
DNase I	Roche	10104159001
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline	Lonza	BE17-513Q
EDTA	Merck	108421
Eosin-Y	Sigma	1159350100
Ethanol	EMSURE	1009832500
Fetal Bovine Serum (FBS)	Life technology	10100147
Fluorescence microscope for sections DM4 B	Leica Microsystems
Fluorescence microscope scope A1	Zeiss AXIO
Fluorescent labeled probes for dissociated cells	Abbott Diagnostics	CEPX (DXZ1) 05J1023 CEP18 (D18Z1) 05J0818
Fluorescent labeled probes for tissue sections	Abbott Diagnostics	CEP X (DXZ1 05J08-023 CEP 18 (D18Z1)  05J10-028
Formaldehyde	Sigma	252549
Glucose	Merck	108337
Glue (Fixogum)	Leica Microsystems	LK071A
Hematoxylin	Sigma	1159380025
Hybridization buffer	Abott Diagnostics	32-804826/06J67-001
Hybridization Station	Dako	S2451
Hydrochloric acid	Merck	1003171000
Image processing software individual ovarian cortex cells (Cytovision 7.7)	Leica Biosystems
Image processing software on paraffine sections	Leica Application Suitex (3.7.5.24914)
Immunohitochemistry microscope slides	Dako	K802021-2
L15	Lonza	12-700Q
Liberase DH	Roche	05 401 151 001
Light microscope	Zeiss West Germany
Magnesium sulphate	Merck	A335586
Methanol	Honeywell	14262-1L
Mounting medium	Vectashield, Vector	H-1000
Nonidet P40	Sigma	7385-1L
Paraffin	Poth Hile	2712.20.10
Pepsin	Sigma	P7000-25G
Phosphate-Buffered Saline (PBS)	Gibco	11530546
Plastic pipette	CooperSurgical	7-72-4075/1
Potassium chloride	Merck	1049361000
Proteinase K	Qiagen	19131
Rotation microtome HM 355S	Thermo sceintific
Scalpel	Dahlhausen	11.000.00.515
Slide for FISH on dissociated cells	Thermo scientific	J1810AM1JZ
Sodium bicarbonate	Sigma	55761-500G
Standard Sodium Citrate (SSC)	Fisher Scientific, Invitrogen	10515203
Stereomicroscope IX 70	Olympus
Target Retrieval Solution	Dako	GV80511-2
Trypsin	Sigma	T4799
Tween-20	ThermoFisher	85113
Xylene	BOOM	760518191000