Exploración de las aberraciones cromosómicas X en células ováricas mediante el uso de hibridación fluorescente in situ

Resumen

Este artículo presenta dos métodos basados en la hibridación fluorescente in situ para determinar el contenido cromosómico X de las células ováricas en tejido de la corteza ovárica no injertado e injertado de mujeres con aberraciones cromosómicas X.

Resumen

Millones de personas en todo el mundo se ocupan de cuestiones relacionadas con la fertilidad. La reducción de la fertilidad, o incluso la infertilidad, puede deberse a muchas causas diferentes, incluidos los trastornos genéticos, de los cuales las anomalías cromosómicas son las más comunes. La hibridación fluorescente in situ (FISH) es un método bien conocido y utilizado con frecuencia para detectar aberraciones cromosómicas en humanos. FISH se utiliza principalmente para el análisis de anomalías cromosómicas en los espermatozoides de varones con aberraciones cromosómicas numéricas o estructurales. Además, esta técnica también se aplica con frecuencia en mujeres para detectar aberraciones cromosómicas X que se sabe que causan disgenesia ovárica. Sin embargo, todavía falta información sobre el contenido cromosómico X de las células ováricas de mujeres con aberraciones cromosómicas X en linfocitos y/o células bucales.

El objetivo de este estudio es avanzar en la investigación básica sobre las aberraciones cromosómicas X en mujeres, mediante la presentación de dos métodos basados en FISH para identificar el contenido cromosómico X de las células ováricas. Primero, se describe un método para determinar el contenido cromosómico X de células ováricas aisladas (ovocitos, células de la granulosa y células del estroma) en tejido de corteza ovárica no injertado de mujeres con aberraciones cromosómicas X. El segundo método está dirigido a evaluar el efecto de las aberraciones cromosómicas en la foliculogénesis mediante la determinación del contenido cromosómico X de las células ováricas de los folículos secundarios y antrales recién formados en el tejido ovárico, de hembras con aberraciones cromosómicas X después de un injerto a largo plazo en ratones inmunocomprometidos. Ambos métodos podrían ser útiles en futuras investigaciones para obtener información sobre el potencial reproductivo de las mujeres con aberraciones cromosómicas X.

Introducción

La infertilidad es un problema de salud del sistema reproductor masculino o femenino, que afecta a aproximadamente 186 millones de personas en edad reproductiva en todo el mundo¹. En al menos el 35% de las parejas infértiles, la infertilidad es causada por un trastorno del sistema reproductor femenino². Hay muchos factores que pueden causar infertilidad femenina, como factores genéticos, anomalías del tracto genital, disfunción endocrina, enfermedades inflamatorias y tratamiento iatrogénico³.

Las anomalías genéticas están presentes en aproximadamente 10% de las hembras infértiles ^4,5. De todas las anomalías genéticas, las aberraciones del cromosoma X son la causa más común de disgenesia ovárica². Varios estudios han reportado que las aberraciones cromosómicas X en mujeres con síndrome de Turner (ST) o síndrome Triple X están asociadas con insuficiencia ovárica prematura debido a una pérdida acelerada de células germinales o alteración de la ovogénesis ^6,7,8.

Las aberraciones del cromosoma X se pueden dividir en: 1) aberraciones numéricas, en las que el número de cromosomas X es diferente pero los cromosomas X están intactos; y 2) aberraciones estructurales, en las que el cromosoma X ha ganado o perdido material genético ^3,9. Las aberraciones numéricas del cromosoma X son más comunes que las anomalías estructurales y a menudo son causadas por errores espontáneos durante la división celular ^3,9. Cuando tal error ocurre durante la meiosis, puede conducir a gametos aneuploides y, en última instancia, a descendencia con aberraciones cromosómicas en todas las células. Cuando surgen defectos cromosómicos en las células somáticas como resultado de errores que ocurren durante la mitosis en las primeras etapas de la ontogénesis, puede conducir al mosaicismo. En estos individuos, tanto las células con contenido cromosómico X normal como las células con aberraciones cromosómicas X están presentes.

En la década de 1980, se desarrolló una técnica citogenética llamada hibridación fluorescente in situ (FISH) para visualizar y localizar secuencias específicas de ácidos nucleicos en los cromosomas de metafase e interfase^10,11. Esta técnica utiliza sondas de ADN marcadas con fluorescencia para unirse a una secuencia específica en el cromosoma, que luego se puede visualizar mediante el uso de un microscopio de fluorescencia.

Hoy en día, el FISH es ampliamente utilizado como herramienta de diagnóstico clínico y es considerado el estándar de oro en la detección de aberraciones cromosómicas¹⁰. En el campo de la medicina reproductiva, el análisis FISH en espermatozoides se ha utilizado para obtener información sobre el contenido cromosómico X de los espermatozoides en varones con aberraciones cromosómicas numéricas o estructurales en células somáticas^12,13,14. Estos estudios mostraron que los varones con aberraciones cromosómicas tenían más probabilidades de tener una mayor frecuencia de espermatozoides aneuploides presentes en su semen en comparación con los hombres con cariotipos normales^12,13,14.

A diferencia de los espermatozoides, se sabe muy poco sobre el contenido cromosómico X de las células ováricas (incluidos los ovocitos, las células granulosa/teca y las células del estroma) en individuos con una aberración cromosómica, así como las posibles consecuencias de la aneuploidía de estas células en su potencial reproductivo. Una razón importante para la escasa información sobre el cariotipo de las células ováricas en comparación con los espermatozoides es el hecho de que las mujeres tienen que someterse a un procedimiento invasivo como una punción del folículo o una cirugía para obtener ovocitos o tejido de la corteza ovárica. Los gametos femeninos son, por lo tanto, difíciles de obtener con fines de investigación.

Actualmente, se está realizando un estudio de intervención observacional en los Países Bajos para explorar la eficacia de la criopreservación del tejido ovárico en mujeres jóvenes con ST¹⁵. Un fragmento del tejido de la corteza ovárica de la paciente estaba disponible para identificar el contenido cromosómico X de las células ováricas^16,17. Como parte del estudio, se desarrolló un nuevo método basado en FISH de tejido de corteza ovárica disociado para determinar si las aberraciones cromosómicas están presentes en las células ováricas en mujeres portadoras de una aberración cromosómica en células somáticas no ováricas, como linfocitos o células bucales. Además, también se determinó el efecto de la aneuploidía en las células ováricas sobre la foliculogénesis. Con este fin, se modificó un protocolo FISH establecido que permite el análisis de secciones histológicas de tejido de la corteza ovárica después de la foliculogénesis inducida artificialmente durante el xenotrasplante a largo plazo en ratones inmunocomprometidos. En este estudio, presentamos dos métodos basados en FISH para determinar el contenido cromosómico X en células ováricas en tejido de corteza ovárica no injertado e injertado en mujeres con aberraciones cromosómicas X, con el objetivo de mejorar la ciencia básica sobre este tema.

Protocolo

El protocolo del estudio TurnerFertility ha sido aprobado por el Comité Central de Investigación con Seres Humanos (NL57738.000.16). En este estudio, se obtuvo el tejido de la corteza ovárica de 93 mujeres con ST. Los materiales que requieren precauciones de seguridad se enumeran en la Tabla 1.

Tabla 1: Precauciones de seguridad.

Material	Peligro
Ácido acético	Quemaduras graves en la piel e irritación del sistema respiratorio
Colagenasa	Irritante para los ojos, el sistema respiratorio y la piel
DAPI	Irritante para los ojos, el sistema respiratorio y la piel
DNasa I	Irritante para los ojos, el sistema respiratorio y la piel
Etanol	Altamente inflamable
Formaldehído	Tóxico después de la inhalación, ingestión y contacto con la piel
Formamida (en sondas de fluorescencia)	Puede dañar al feto
Liberase	Irritante para los ojos, el sistema respiratorio y la piel
Metanol	Altamente inflamable, tóxico por inhalación, ingestión y contacto con la piel
Nonidet P40	Irritante para la piel o los ojos
Pepsina	Irritante para los ojos, el sistema respiratorio y la piel
Proteinasa K	Dificultades respiratorias después de la inhalación
Xileno	Altamente inflamable, tóxico después de la inhalación y el contacto con la piel. Evite el contacto con los ojos.

Tabla 1: Materiales que requieren precauciones de seguridad.

1. FISH en células aisladas individuales de la corteza ovárica

1. Disociación del tejido de la corteza ovárica para obtener células individuales
   1. Cortar el tejido de la corteza ovárica criopreservado/descongelado en trozos pequeños de aproximadamente 1 mm x 1 mm x 1 mm con un bisturí.
   2. Digerir enzimáticamente los fragmentos de tejido en 4 ml de medio L15 precalentado (37 °C) que contiene 0,1 mg/ml de mezcla enzimática de disociación tisular, 10 μg/ml de DNasa I y 1 mg/ml de colagenasa I de C. histolyticum durante un máximo de 75 min a 37 °C. Pipet la digestión se mezcla arriba y abajo cada 15 min.
   3. Detenga la digestión enzimática agregando 4 ml de L15 frío suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS). Lavar el tejido disociado una vez con 8 mL de medio L15 frío por centrifugación a 500 x g y resuspender en 500 μL de medio L15 sin vórtice para evitar daños en las células.
   4. Transfiera la suspensión celular que contiene células estromales en gran parte individuales y folículos pequeños (ovocitos rodeados por una sola capa de células de granulosa) a una placa de Petri de plástico y examine la suspensión celular bajo un microscopio estereoscópico (aumento de 100x).
   5. Recoger los folículos pequeños (<50 μm) manualmente utilizando una pipeta de plástico de 75 μm y transferir los folículos a una gota de medio L15 suplementada con FBS al 10% a 4 °C para evitar la agregación de folículos. Realice la recogida del folículo durante un máximo de 30 min. Para mejorar la diseminación de las células foliculares antes del análisis de FISH, transfiera los folículos purificados a una solución de tripsina al 0,06%, 1 mg/ml de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) y 1 mg/ml de glucosa e incubar durante 20 min a 37 °C.
   6. Obtener células del estroma ovárico de la suspensión de células cortex utilizando una pipeta de plástico de 75 μm, teniendo especial cuidado para evitar la contaminación con folículos pequeños.
2. Análisis FISH de células ováricas individuales
   1. Transfiera los folículos ováricos tratados (recomendado n = 5-20) con tripsina/EDTA/glucosa o células estromales (n > 1.000) a gotitas de 5 μL de 0,15 mM KCl/15 μL de solución salina tamponada con fosfato (DPBS) de Dulbecco en un portaobjetos e incubar durante 20 min a 37 °C.
   2. Secar y prefijar los portaobjetos en 300 μL de 0,05 mM de KCl/7,5% de ácido acético/22,5% de metanol durante 2 min a temperatura ambiente (RT). Cubra los portaobjetos con metanol/ácido acético (3:1) durante 2 minutos en RT para finalizar la fijación.
   3. Hacer 20 veces citrato de sodio estándar (SSC) añadiendo 876 g de cloruro de sodio y 441 g de citrato trisódico dihidratado en 5 L de agua destilada. Luego, agregue 100 ml de 20x SSC a 900 mL de agua desmineralizada (demi) para obtener 2x SSC. Lavar la muestra en 2x SSC a 73 °C, cubrirla con 100 μL de proteinasa K al 2% y sellarla con un cubreobjetos. Incubar los portaobjetos durante 10 min a 37 °C en la estación de hibridación.
   4. Retire el cubreobjetos y lave los portaobjetos durante 5 minutos en DPBS a RT. Fije la muestra durante 5 minutos con formaldehído al 1% en RT. En esta etapa, el material aún no está completamente unido a los portaobjetos de vidrio y, por lo tanto, no debe colocarse en una plataforma de agitación.
   5. Lave los portaobjetos durante 5 minutos en DPBS a RT, seguido de deshidratación en 70%, 80%, 90% y 100% de etanol durante 2 minutos cada uno. Seque al aire la muestra deshidratada e hibridarla con sondas marcadas con fluorescencia.
   6. Seleccione una sonda específica del centrómero para el cromosoma X y otra sonda centromérica específica del cromosoma como control para determinar el contenido cromosómico X de las células ováricas. En este caso, se utilizan sondas específicas del centrómero para el cromosoma X (CEP X [DXZ1]) marcado directamente con fluorocromo SpectrumGreen y el cromosoma 18 (CEP 18 [D18Z1]) marcado directamente con fluorocromo SpectrumOrange.
   7. Agregue 1 μL de CEP X, 1 μL de CEP 18 y 18 μL del tampón de hibridación a la muestra y selle con un cubreobjetos pegado a los portaobjetos para evitar la evaporación de la sonda durante la hibridación. Transfiera los portaobjetos a la estación de hibridación para su desnaturalización a 73 °C durante 3 min, seguida de hibridación durante una incubación nocturna a 37 °C.
   8. Retire el cubreobjetos y cualquier pegamento restante del portaobjetos después de la hibridación. Lavar los portaobjetos en 0,4x SSC/0,3% Tween-20 a 72 °C durante 2 min, seguido de la incubación durante 1 min en 2x SSC/0,1% Tween-20 en RT.
   9. Deshidratar los portaobjetos mediante incubaciones posteriores de 2 minutos en etanol al 70%, 80%, 90% y 100% y secar al aire en la oscuridad. Cubra los portaobjetos con un medio de montaje que contenga 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI). Conservar a -20 °C durante al menos 10 min antes del análisis por microscopía de fluorescencia.
3. Imagenológico
   1. Examine la(s) señal(es) del cromosoma X con un microscopio de fluorescencia conectado a un software de procesamiento de imágenes.
      1. Primero, seleccione fluorocromo DAPI.
         1. Adquiera una imagen seleccionando Nueva celda > Captura de > en vivo con un aumento de 630x. Aparecerá una nueva ventana con el umbral. Establezca la barra azul del umbral en 0 para minimizar el fondo y la barra roja en el máximo (255) para que las señales sean más brillantes. Haga clic en Aceptar.
         2. Aparecerá una nueva ventana con mejoras con una sugerencia para más oscuro/más brillante (12), radio (3) y profundidad (1). Utilice los valores sugeridos o ajústelos si no está satisfecho.
      2. En segundo lugar, seleccione fluorochrome SpectrumOrange y haga clic en Capturar.
         1. Establezca la barra azul del umbral en 0 para minimizar el fondo y la barra roja en el máximo (255) para que las señales sean más brillantes. Haga clic en Aceptar.
         2. La ventana con mejora aparecerá con una sugerencia para más oscuro/más brillante (-11), radio (2.7) y profundidad (0.6). Utilice los valores sugeridos o ajústelos si no está satisfecho.
      3. Finalmente, seleccione fluorochrome SpectrumGreen y haga clic en Capturar.
         1. Establezca la barra azul del umbral en 0 para minimizar el fondo y la barra roja en el máximo (255) para que las señales sean más brillantes. Haga clic en Aceptar.
         2. La ventana con mejora aparecerá con una sugerencia para más oscuro/más brillante (0), radio (3) y profundidad (0). Utilice los valores sugeridos o ajústelos si no está satisfecho. Guarde la imagen en un archivo recién creado.
            NOTA: Las células somáticas solo se evaluaron cuando dos señales del cromosoma control 18 eran visibles. En la mayoría de los ovocitos, solo se pudo detectar una señal para cada cromosoma.
   2. Conservar los portaobjetos en la oscuridad a 4 °C después del análisis para evitar la pérdida de señales.

2. FISH en secciones de parafina de tejido injertado de la corteza ovárica

NOTA: Un fragmento de tejido de la corteza ovárica criopreservado/descongelado de 18 hembras con ST fue xenoinjertado en ratones inmunodeficientes combinados severos (SCID) durante 5 meses. El procedimiento de xenoinjerto ha sido descrito previamente y se llevó a cabo en la Université Catholique de Louvain (Bruselas, Bélgica) siguiendo las directrices locales del Comité de Investigación Animal con respecto al bienestar animal (referencia 2014/UCL/MD/007)^18,19.

1. Selección de secciones de tejido de la corteza ovárica xenoinjertado que contienen folículos
   1. Fijar el tejido de la corteza ovárica xenoinjertado en formaldehído al 4% e incrustar el tejido en parafina. Recorte los bloques con un bisturí para eliminar la parafina adicional y corte el bloque de parafina a 4 μm de espesor en un micrótomo de rotación.
   2. Seleccione cada séptima sección de la cinta de parafina para la tinción de hematoxilina y eosina (HE) para determinar qué secciones contienen folículos. Poner la sección en un baño maría a 40-45 °C y montarla en portaobjetos de microscopio inmunohistoquímico.
2. Desparafinización y tinción HE
   1. Coloque los toboganes en una estufa durante 10 minutos a 60 ° C, y luego sumerja los toboganes en 100% de xileno durante 5 minutos. No es necesario colocar los toboganes directamente sobre la estufa. Hidratar las secciones durante 15 s en etanol al 100%, seguido de 2 x 15 s en etanol al 96%. Enjuague los toboganes con agua del grifo durante 2 minutos.
   2. Manche los portaobjetos con hematoxilina durante 10 minutos y luego enjuague brevemente los portaobjetos con agua del grifo. Sumerja brevemente los portaobjetos en una solución de bicarbonato (100 g de sulfato de magnesio y 10 g de bicarbonato de sodio en 5 L de agua destilada). Enjuague los toboganes con agua del grifo durante 5 minutos.
   3. Contramanche los portaobjetos con eosina durante 4 minutos y deshidrate los portaobjetos tres veces con etanol al 100%, seguido de xileno. Cubra las tinciones de HE en los portaobjetos y evalúe las secciones de HE bajo un microscopio óptico para seleccionar las secciones con folículos (aumento de 100x).
3. Pretratamiento e hibridación de secciones de parafina para DNA FISH
   1. Seleccione nuevas secciones que se encuentren antes o después de la sección que contenía folículos de la cinta de parafina. Monte una sección en una diapositiva de vidrio. Secar las secciones de parafina durante al menos 45 minutos en una estufa a 56 °C. No es necesario colocar los toboganes directamente sobre la estufa.
   2. Desparafinar las secciones en xileno durante 10 min. Sumerja los portaobjetos en etanol al 99,5% y enjuáguelos durante 5 minutos en agua del grifo. Pretratar los portaobjetos con la solución de recuperación del objetivo (pH bajo) durante 10 min a 96 °C. Después de enfriar, enjuague los portaobjetos con agua destilada.
   3. Tratar los portaobjetos durante 5 min con ácido clorhídrico 0,01 M, seguido de digestión de pepsina (200 U/ml) durante 15 min a 37 °C. Enjuagar de nuevo los portaobjetos en ácido clorhídrico 0,01 M y posteriormente en PBS.
   4. Fijar los portaobjetos en formaldehído/PBS al 1% durante 5 min. Enjuague los portaobjetos brevemente en PBS, y luego nuevamente en agua demi. Deshidrate los portaobjetos en etanol al 99,5% y déjelos secar al aire.
   5. Seleccione una sonda específica del centrómero para el cromosoma X y otra sonda centromérica específica del cromosoma como control para determinar el contenido cromosómico X de las células de la granulosa. Aquí, el cromosoma 18 se utiliza como control.
   6. Aplique 5 μL de sonda CEP 18 (D18Z1) directamente marcada con fluorocromo SpectrumGreen y sonda CEP X (DXZ1) directamente marcada con fluorocromo SpectrumRed en los portaobjetos pretratados. Aplique un cubreobjetos y selle el área con pegamento fotográfico. Colocar los portaobjetos en un hibridador para su desnaturalización a 80 °C durante 10 min y hibridación durante la noche a 37 °C.
   7. Al día siguiente, enjuague los portaobjetos durante 5 minutos en 2x SSC a 42 °C, seguido de un enjuague de 2 minutos y 1 minuto en Nonidet P40 al 0,3% a 73 °C. Actualice el 2x SSC y enjuague las diapositivas nuevamente durante 5 minutos a temperatura ambiente. Cubra la cubeta para que las secciones se mantengan en la oscuridad.
   8. Enjuague brevemente los portaobjetos con agua destilada. Deshidrate los portaobjetos en etanol al 99,5% y déjelos secar al aire nuevamente. Finalmente, monte las guías con una solución que contenga DAPI y medio de montaje.
4. Imagenológico
   1. Analice los resultados bajo un microscopio de fluorescencia con un aumento de 630x. Abra el software de procesamiento de imágenes en la computadora. Seleccione FISH como perfil.
   2. Compruebe si la emisión DAPI se establece en 431 nm y la excitación en 359 nm, la emisión roja de Texas en 613 nm y la excitación en 595 nm, y la emisión FITC en 519 nm y la excitación en 495 nm.
   3. Adquiera una imagen seleccionando Live > Capture Single Image (Capturar imagen única). Optimice la calidad de la imagen ajustando la exposición y la ganancia moviendo el control deslizante Exposición y el control deslizante Ganancia en el menú Imagen de la izquierda (por ejemplo, exposición: 212 ms y ganancia: 7,9). La exposición y ganancia requeridas pueden variar según la imagen; Observe los cambios durante este proceso para obtener una imagen optimizada. Guarde la imagen en un archivo recién creado.
   4. Conservar los portaobjetos en la oscuridad a 4 °C después del análisis para evitar la pérdida de señales.

Resultados

FISH en células ováricas aisladas antes del injerto
Se utilizó tejido criopreservado de la corteza ovárica de mujeres con TS 45,X/46,XX (paciente A) o 45,X/46,XX/47,XXX (paciente B) para ilustrar los resultados utilizando este protocolo. En el paciente A, el 50% de los linfocitos tenían un cariotipo 45,X y el 50% tenían 46,XX. En el paciente B, el 38% de los linfocitos fueron 45,X, el 28% 46,XX y el 34% 47,XXX. Se utilizaron sondas específicas del centrómero para el cromosoma X (verde) y el cr...

Discusión

El análisis FISH es una técnica bien conocida para detectar aberraciones cromosómicas X en linfocitos o células bucales tanto de hombres como de mujeres¹⁰. Varios estudios han descrito FISH en gametos de varones con aberraciones cromosómicas X, pero todavía falta información detallada obtenida por FISH en células ováricas de mujeres con aberraciones cromosómicas X¹⁴. Este artículo presenta nuevos métodos basados en FISH para determinar si la aneuploidía está p...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetic acid	Biosolve BV	0001070602BS
Centrifuge 1200	Hettich Universal	4140
Collagenase I	Sigma	131470
Coverslip	VWR	0631-0146
DAPI	Vector	H-1200
DNase I	Roche	10104159001
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline	Lonza	BE17-513Q
EDTA	Merck	108421
Eosin-Y	Sigma	1159350100
Ethanol	EMSURE	1009832500
Fetal Bovine Serum (FBS)	Life technology	10100147
Fluorescence microscope for sections DM4 B	Leica Microsystems
Fluorescence microscope scope A1	Zeiss AXIO
Fluorescent labeled probes for dissociated cells	Abbott Diagnostics	CEPX (DXZ1) 05J1023 CEP18 (D18Z1) 05J0818
Fluorescent labeled probes for tissue sections	Abbott Diagnostics	CEP X (DXZ1 05J08-023 CEP 18 (D18Z1)  05J10-028
Formaldehyde	Sigma	252549
Glucose	Merck	108337
Glue (Fixogum)	Leica Microsystems	LK071A
Hematoxylin	Sigma	1159380025
Hybridization buffer	Abott Diagnostics	32-804826/06J67-001
Hybridization Station	Dako	S2451
Hydrochloric acid	Merck	1003171000
Image processing software individual ovarian cortex cells (Cytovision 7.7)	Leica Biosystems
Image processing software on paraffine sections	Leica Application Suitex (3.7.5.24914)
Immunohitochemistry microscope slides	Dako	K802021-2
L15	Lonza	12-700Q
Liberase DH	Roche	05 401 151 001
Light microscope	Zeiss West Germany
Magnesium sulphate	Merck	A335586
Methanol	Honeywell	14262-1L
Mounting medium	Vectashield, Vector	H-1000
Nonidet P40	Sigma	7385-1L
Paraffin	Poth Hile	2712.20.10
Pepsin	Sigma	P7000-25G
Phosphate-Buffered Saline (PBS)	Gibco	11530546
Plastic pipette	CooperSurgical	7-72-4075/1
Potassium chloride	Merck	1049361000
Proteinase K	Qiagen	19131
Rotation microtome HM 355S	Thermo sceintific
Scalpel	Dahlhausen	11.000.00.515
Slide for FISH on dissociated cells	Thermo scientific	J1810AM1JZ
Sodium bicarbonate	Sigma	55761-500G
Standard Sodium Citrate (SSC)	Fisher Scientific, Invitrogen	10515203
Stereomicroscope IX 70	Olympus
Target Retrieval Solution	Dako	GV80511-2
Trypsin	Sigma	T4799
Tween-20	ThermoFisher	85113
Xylene	BOOM	760518191000