Explorer les aberrations chromosomiques X dans les cellules ovariennes en utilisant l’hybridation in situ par fluorescence

Résumé

Cet article présente deux méthodes basées sur l’hybridation in situ par fluorescence pour déterminer le contenu chromosomique X des cellules ovariennes dans le tissu du cortex ovarien non greffé et greffé de femelles présentant des aberrations chromosomiques X.

Résumé

Des millions de personnes dans le monde sont confrontées à des problèmes de fertilité. La baisse de la fertilité, voire l’infertilité, peut être due à de nombreuses causes différentes, y compris des troubles génétiques, dont les anomalies chromosomiques sont les plus courantes. L’hybridation in situ par fluorescence (FISH) est une méthode bien connue et fréquemment utilisée pour détecter les aberrations chromosomiques chez l’homme. FISH est principalement utilisé pour l’analyse des anomalies chromosomiques dans les spermatozoïdes des mâles présentant des aberrations chromosomiques numériques ou structurelles. En outre, cette technique est également fréquemment appliquée chez les femmes pour détecter les aberrations chromosomiques X connues pour causer la dysgénésie ovarienne. Cependant, les informations sur le contenu chromosomique X des cellules ovariennes de femelles présentant des aberrations chromosomiques X dans les lymphocytes et / ou les cellules buccales font encore défaut.

Le but de cette étude est de faire progresser la recherche fondamentale sur les aberrations chromosomiques X chez les femelles, en présentant deux méthodes basées sur FISH pour identifier le contenu chromosomique X des cellules ovariennes. Tout d’abord, une méthode est décrite pour déterminer le contenu chromosomique X de cellules ovariennes isolées (ovocytes, cellules de la granulosa et cellules stromales) dans le tissu du cortex ovarien non greffé de femelles présentant des aberrations chromosomiques X. La deuxième méthode vise à évaluer l’effet des aberrations chromosomiques sur la folliculogenèse en déterminant le contenu chromosomique X des cellules ovariennes des follicules secondaires et antraux nouvellement formés dans le tissu ovarien, à partir de femelles présentant des aberrations chromosomiques X après greffe à long terme chez des souris immunodéprimées. Les deux méthodes pourraient être utiles dans les recherches futures pour mieux comprendre le potentiel de reproduction des femelles présentant des aberrations chromosomiques X.

Introduction

L’infertilité est un problème de santé du système reproducteur masculin ou féminin, affectant environ 186 millions de personnes en âge de procréer dans le monde¹. Chez au moins 35% des couples infertiles, l’infertilité est causée par un trouble du système reproducteur féminin². De nombreux facteurs peuvent causer l’infertilité féminine, tels que des facteurs génétiques, des anomalies des voies génitales, un dysfonctionnement endocrinien, des maladies inflammatoires^{et un traitement} iatrogène3.

Des anomalies génétiques sont présentes chez environ 10 % des femelles infertiles ^4,5. De toutes les anomalies génétiques, les aberrations du chromosome X sont la cause la plus fréquente de dysgénésie ovarienne². Plusieurs études ont rapporté que les aberrations chromosomiques X chez les femmes atteintes du syndrome de Turner (TS) ou du syndrome Triple X sont associées à une insuffisance ovarienne prématurée due à une perte accélérée de cellules germinales ou à une altération de l’oogenèse ^6,7,8.

Les aberrations du chromosome X peuvent être divisées en: 1) aberrations numériques, dans lesquelles le nombre de chromosomes X est différent mais les chromosomes X sont intacts; et 2) les aberrations structurelles, dans lesquelles le chromosome X a gagné ou perdu du matériel génétique ^3,9. Les aberrations numériques du chromosome X sont plus fréquentes que les anomalies structurelles et sont souvent causées par des erreurs spontanées lors de la division cellulaire ^3,9. Lorsqu’une telle erreur se produit pendant la méiose, elle peut conduire à des gamètes aneuploïdes et finalement à une progéniture avec des aberrations chromosomiques dans toutes les cellules. Lorsque des défauts chromosomiques apparaissent dans les cellules somatiques à la suite d’erreurs survenant pendant la mitose dans les premiers stades de l’ontogenèse, cela peut conduire au mosaïcisme. Chez ces individus, les cellules ayant un contenu chromosomique X normal et les cellules présentant des aberrations chromosomiques X sont présentes.

Dans les années 1980, une technique cytogénétique appelée hybridation in situ par fluorescence (FISH) a été développée pour visualiser et localiser des séquences d’acides nucléiques spécifiques sur les chromosomes métaphasiques et interphasiques^10,11. Cette technique utilise des sondes d’ADN marquées par fluorescence pour se lier à une séquence spécifique du chromosome, qui peut ensuite être visualisée à l’aide d’un microscope à fluorescence.

De nos jours, FISH est largement utilisé comme outil de diagnostic clinique et est considéré comme l’étalon-or dans la détection des aberrations chromosomiques¹⁰. Dans le domaine de la médecine de la reproduction, l’analyse FISH sur le sperme a été utilisée pour mieux comprendre le contenu chromosomique X des spermatozoïdes chez les mâles présentant des aberrations chromosomiques numériques ou structurelles dans les cellules somatiques^12,13,14. Ces études ont montré que les hommes présentant des aberrations chromosomiques étaient plus susceptibles d’avoir une fréquence plus élevée de spermatozoïdes aneuploïdes présents dans leur sperme par rapport aux hommes ayant des caryotypes^{normaux 12,13,14}.

Contrairement aux spermatozoïdes, on sait très peu de choses sur le contenu chromosomique X des cellules ovariennes (y compris les ovocytes, les cellules granulosa / thèques et les cellules stromales) chez les individus présentant une aberration chromosomique, ainsi que sur les conséquences possibles de l’aneuploïdie de ces cellules sur leur potentiel de reproduction. Une raison importante pour le peu d’informations sur le caryotype des cellules ovariennes par rapport aux spermatozoïdes est le fait que les femmes doivent subir une procédure invasive telle qu’une ponction de follicule ou une intervention chirurgicale pour obtenir des ovocytes ou du tissu du cortex ovarien. Les gamètes femelles sont donc difficiles à obtenir à des fins de recherche.

Actuellement, une étude d’intervention observationnelle est en cours aux Pays-Bas pour explorer l’efficacité de la cryoconservation du tissu ovarien chez les jeunes femmes atteintes de TS¹⁵. Un fragment du tissu du cortex ovarien de la patiente était disponible pour identifier le contenu chromosomique X des cellules ovariennes^16,17. Dans le cadre de l’étude, une nouvelle méthode a été développée basée sur FISH du tissu dissocié du cortex ovarien pour déterminer si des aberrations chromosomiques sont présentes dans les cellules ovariennes chez les femelles porteuses d’une aberration chromosomique dans les cellules somatiques non ovariennes, telles que les lymphocytes ou les cellules buccales. En outre, l’effet de l’aneuploïdie dans les cellules ovariennes sur la folliculogenèse a également été déterminé. À cette fin, un protocole FISH établi a été modifié qui permet l’analyse de coupes histologiques de tissu du cortex ovarien après folliculogenèse induite artificiellement pendant la xénotransplantation à long terme chez des souris immunodéprimées. Dans cette étude, nous présentons deux méthodes basées sur FISH pour déterminer le contenu chromosomique X dans les cellules ovariennes dans le tissu du cortex ovarien non greffé et greffé chez les femmes présentant des aberrations chromosomiques X, dans le but d’améliorer la science fondamentale sur ce sujet.

Protocole

Le protocole de l’étude TurnerFertility a été approuvé par le Comité central de recherche sur des sujets humains (NL57738.000.16). Dans cette étude, le tissu du cortex ovarien de 93 femmes atteintes de SGT a été obtenu. Les matériaux qui nécessitent des précautions de sécurité sont énumérés dans le tableau 1.

Tableau 1 : Précautions de sécurité.

Matériel	Danger
Acide acétique	Brûlures graves de la peau et irritation du système respiratoire
Collagènase	Irritant pour les yeux, le système respiratoire et la peau
Le	Irritant pour les yeux, le système respiratoire et la peau
DNase I	Irritant pour les yeux, le système respiratoire et la peau
Éthanol	Facilement inflammable
Formaldéhyde	Toxique après inhalation, ingestion et contact cutané
Formamide (dans les sondes de fluorescence)	Peut nuire à l’enfant à naître
Liberase	Irritant pour les yeux, le système respiratoire et la peau
Méthanol	Facilement inflammable, toxique par inhalation, ingestion et contact cutané
Nonidet P40	Irritant pour la peau ou les yeux
Pepsine	Irritant pour les yeux, le système respiratoire et la peau
Protéinase K	Difficultés respiratoires après inhalation
Xylène	Hautement inflammable, toxique après inhalation et contact cutané. Évitez tout contact avec les yeux.

Tableau 1 : Matériaux nécessitant des mesures de sécurité.

1. FISH sur des cellules isolées du cortex ovarien

1. Dissociation du tissu du cortex ovarien pour obtenir des cellules individuelles
   1. Couper le tissu du cortex ovarien cryoconservé/décongelé en petits morceaux d’environ 1 mm x 1 mm x 1 mm à l’aide d’un scalpel.
   2. Digérer par voie enzymatique les fragments de tissu dans 4 mL de milieu L15 préchauffé (37 °C) contenant 0,1 mg/mL de mélange d’enzymes de dissociation tissulaire, 10 μg/mL de DNase I et 1 mg/mL de collagénase I de C. histolyticum pendant un maximum de 75 minutes à 37 °C. Pipeter le mélange de digestion de haut en bas toutes les 15 minutes.
   3. Arrêtez la digestion enzymatique en ajoutant 4 mL de L15 froide additionnée de sérum fœtal bovin (FBS) à 10%. Laver le tissu dissocié une fois avec 8 mL de milieu L15 froid par centrifugation à 500 x g et remettre en suspension dans 500 μL de milieu L15 sans vortex pour éviter d’endommager les cellules.
   4. Transférer la suspension cellulaire contenant en grande partie des cellules stromales individuelles et de petits follicules (ovocytes entourés d’une seule couche de cellules de la granulosa) dans une boîte de Petri en plastique et examiner la suspension cellulaire au stéréomicroscope (grossissement 100x).
   5. Ramasser les petits follicules (<50 μm) manuellement à l’aide d’une pipette en plastique de 75 μm et transférer les follicules dans une gouttelette de milieu L15 supplémentée avec 10% FBS à 4 °C pour empêcher l’agrégation des follicules. Effectuer le ramassage des follicules pendant un maximum de 30 min. Pour améliorer la propagation des cellules folliculaires avant l’analyse FISH, transférer les follicules purifiés dans une solution de trypsine à 0,06 %, 1 mg/mL d’acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) et 1 mg/mL de glucose et incuber pendant 20 minutes à 37 °C.
   6. Obtenir des cellules stromales ovariennes à partir de la suspension de cellules du cortex à l’aide d’une pipette en plastique de 75 μm, en prenant soin d’éviter la contamination par de petits follicules.
2. Analyse FISH de cellules ovariennes individuelles
   1. Transférer les follicules ovariens traités (n recommandé = 5-20) avec de la trypsine/EDTA/glucose ou des cellules stromales (n > 1 000) à des gouttelettes de 5 μL de 0,15 mM KCl/15 μL de solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco (DPBS) sur une lame et incuber pendant 20 min à 37 °C.
   2. Sécher et préfixer les lames dans 300 μL de 0,05 mM KCl/7,5 % d’acide acétique/22,5 % de méthanol pendant 2 min à température ambiante (RT). Couvrir les lames de méthanol/acide acétique (3:1) pendant 2 min à TA pour finaliser la fixation.
   3. Faire 20x le citrate de sodium standard (SSC) en ajoutant 876 g de chlorure de sodium et 441 g de citrate de tri-sodium dihydraté dans 5 L d’eau distillée. Ensuite, ajoutez 100 mL de 20x SSC à 900 mL d’eau déminéralisée (demi) pour obtenir 2x SSC. Lavez l’échantillon dans 2x SSC à 73 °C, recouvrez-le de 100 μL de protéinase K à 2 % et scellez-le avec une lamelle de couverture. Incuber les lames pendant 10 min à 37 °C dans la station d’hybridation.
   4. Retirer la lame-couverture et laver les lames pendant 5 min dans DPBS at RT. Fixer l’échantillon pendant 5 min avec 1% de formaldéhyde à TA. À ce stade, le matériau n’est pas encore complètement fixé aux lames de verre et ne doit donc pas être placé sur une plate-forme tremblante.
   5. Laver les lames pendant 5 minutes dans DPBS à TA, suivies d’une déshydratation dans 70%, 80%, 90% et 100% d’éthanol pendant 2 minutes chacune. Sécher à l’air libre l’échantillon déshydraté et l’hybrider avec des sondes marquées par fluorescence.
   6. Sélectionnez une sonde spécifique du centromère pour le chromosome X et une autre sonde centromérique spécifique au chromosome comme témoin pour déterminer le contenu chromosomique X des cellules ovariennes. Dans ce cas, des sondes spécifiques aux centromères pour le chromosome X (CEP X [DXZ1]) directement marquées avec du fluorochrome SpectrumGreen et le chromosome 18 (CEP 18 [D18Z1]) directement marquées avec du fluorochrome SpectrumOrange sont utilisées.
   7. Ajouter 1 μL de CEP X, 1 μL de CEP 18 et 18 μL du tampon d’hybridation à l’échantillon et sceller avec un couvercle collé sur les lames pour empêcher l’évaporation de la sonde pendant l’hybridation. Transférer les lames à la station d’hybridation pour une dénaturation à 73 °C pendant 3 min, suivie d’une hybridation pendant une nuit d’incubation à 37 °C.
   8. Retirez la lamelle de couverture et toute colle restante de la lame après hybridation. Laver les lames dans 0,4x SSC/0,3% Tween-20 à 72 °C pendant 2 min, puis les incuber pendant 1 min dans 2x SSC/0,1% Tween-20 à TA.
   9. Déshydrater les lames par des incubations ultérieures de 2 minutes dans 70%, 80%, 90% et 100% d’éthanol et sécher à l’air libre dans l’obscurité. Couvrir les lames avec un support de montage contenant du 4′,6-diamidino-2-phénylindole (DAPI). Conserver à -20 °C pendant au moins 10 min avant analyse par microscopie à fluorescence.
3. Imagerie
   1. Examinez le(s) signal(s) pour le chromosome X avec un microscope à fluorescence relié à un logiciel de traitement d’image.
      1. Tout d’abord, sélectionnez le DAPI fluorochrome.
         1. Obtenez une image en sélectionnant Nouvelle cellule > Capture > Live à un grossissement de 630x. Une nouvelle fenêtre avec le seuil apparaîtra. Réglez la barre bleue du seuil sur 0 pour minimiser l’arrière-plan et la barre rouge sur maximum (255) pour rendre les signaux plus lumineux. Cliquez sur Accepter.
         2. Une nouvelle fenêtre avec amélioration apparaîtra avec une suggestion pour plus sombre/plus clair (12), rayon (3) et profondeur (1). Utilisez les valeurs suggérées ou ajustez-les si vous n’êtes pas satisfait.
      2. Deuxièmement, sélectionnez fluorochrome SpectrumOrange et cliquez sur Capturer.
         1. Réglez la barre bleue du seuil sur 0 pour minimiser l’arrière-plan et la barre rouge sur maximum (255) pour rendre les signaux plus lumineux. Cliquez sur Accepter.
         2. La fenêtre avec amélioration apparaîtra avec une suggestion pour plus sombre/plus clair (-11), rayon (2,7) et profondeur (0,6). Utilisez les valeurs suggérées ou ajustez-les si vous n’êtes pas satisfait.
      3. Enfin, sélectionnez fluorochrome SpectrumGreen et cliquez sur Capturer.
         1. Réglez la barre bleue du seuil sur 0 pour minimiser l’arrière-plan et la barre rouge sur maximum (255) pour rendre les signaux plus lumineux. Cliquez sur Accepter.
         2. La fenêtre avec amélioration apparaîtra avec une suggestion pour plus sombre/plus clair (0), rayon (3) et profondeur (0). Utilisez les valeurs suggérées ou ajustez-les si vous n’êtes pas satisfait. Enregistrez l’image dans un fichier nouvellement créé.
            REMARQUE: Les cellules somatiques n’ont été évaluées que lorsque deux signaux du chromosome 18 de contrôle étaient visibles. Dans la plupart des ovocytes, un seul signal a pu être détecté pour chaque chromosome.
   2. Conservez les lames dans l’obscurité à 4 °C après analyse pour éviter la perte de signaux.

2. FISH sur des sections de paraffine de tissu du cortex ovarien greffé

REMARQUE : Un fragment de tissu du cortex ovarien cryoconservé/décongelé de 18 femelles atteintes du SGT a été xénogreffé à des souris immunodéficientes combinées sévères (DICS) pendant 5 mois. La procédure de xénogreffe a été décrite précédemment et a été menée à l’Université catholique de Louvain (Bruxelles, Belgique) conformément aux directives locales du Comité de la recherche animale concernant le bien-être animal (référence 2014/UCL/MD/007)^18,19.

1. Sélection de sections de tissu du cortex ovarien xénogreffé contenant des follicules
   1. Fixez le tissu du cortex ovarien xénogreffé dans du formaldéhyde à 4% et incorporez le tissu dans de la paraffine. Coupez les blocs avec un scalpel pour éliminer la paraffine supplémentaire et coupez le bloc de paraffine à 4 μm d’épaisseur sur un microtome de rotation.
   2. Sélectionnez une section sur sept du ruban de paraffine pour la coloration à l’hématoxyline et à l’éosine (HE) afin de déterminer quelles sections contiennent des follicules. Placez la section dans un bain-marie à 40-45 °C et montez-les sur des lames de microscope immunohistochimique.
2. Déparaffinisation et coloration HE
   1. Placez les lames sur un poêle pendant 10 min à 60 °C, puis immergez les lames dans 100% xylène pendant 5 min. Il n’est pas nécessaire de placer les lames directement sur le poêle. Hydrater les sections pendant 15 s dans de l’éthanol à 100 %, puis 2 x 15 s dans de l’éthanol à 96 %. Rincer les lames à l’eau du robinet pendant 2 min.
   2. Colorer les lames dans de l’hématoxyline pendant 10 minutes, puis rincer brièvement les lames à l’eau du robinet. Immerger brièvement les lames dans une solution de bicarbonate (100 g de sulfate de magnésium et 10 g de bicarbonate de sodium dans 5 L d’eau distillée). Rincer les lames à l’eau du robinet pendant 5 min.
   3. Contre-colorer les lames avec de l’éosine pendant 4 min et déshydrater les lames trois fois avec de l’éthanol à 100%, puis du xylène. Couvrir les taches HE sur les lames et évaluer les sections HE au microscope optique pour sélectionner les sections avec follicules (grossissement 100x).
3. Prétraitement et hybridation de coupes de paraffine pour DNA FISH
   1. Sélectionnez de nouvelles sections qui se trouvent avant ou après la section contenant des follicules du ruban de paraffine. Montez une section sur une lame de verre. Sécher les sections de paraffine pendant au moins 45 min sur un poêle à 56 °C. Il n’est pas nécessaire de placer les lames directement sur le poêle.
   2. Déparaffiner les sections dans le xylène pendant 10 min. Plongez les lames dans de l’éthanol à 99,5% et rincez-les pendant 5 min à l’eau du robinet. Prétraiter les lames avec une solution de récupération cible (pH bas) pendant 10 min à 96 °C. Après refroidissement, rincer les lames à l’eau distillée.
   3. Traiter les lames pendant 5 min avec de l’acide chlorhydrique 0,01 M, puis digérer la pepsine (200 U/mL) pendant 15 min à 37 °C. Rincer à nouveau les lames dans de l’acide chlorhydrique 0,01 M, puis dans du PBS.
   4. Fixer les lames dans 1% de formaldéhyde/PBS pendant 5 min. Rincer brièvement les lames dans du PBS, puis à nouveau dans de l’eau demi. Déshydratez les lames dans de l’éthanol à 99,5 % et laissez-les sécher à l’air.
   5. Sélectionnez une sonde spécifique du centromère pour le chromosome X et une autre sonde centromérique spécifique au chromosome comme témoin pour déterminer le contenu chromosomique X des cellules de la granulosa. Ici, le chromosome 18 est utilisé comme témoin.
   6. Appliquer 5 μL de sonde CEP 18 (D18Z1) directement marquée avec du fluorochrome SpectrumGreen et sonde CEP X (DXZ1) directement marquée avec du fluorochrome SpectrumRed sur les lames prétraitées. Appliquez un bordereau de couverture et scellez la zone avec de la colle photo. Placer les lames dans un hybrideur pour dénaturation à 80 °C pendant 10 min et hybridation pendant une nuit à 37 °C.
   7. Le lendemain, rincer les lames pendant 5 min dans 2x SSC à 42 °C, suivi d’un rinçage de 2 min et d’un rinçage de 1 min dans du Nonidet P40 à 0,3 % à 73 °C. Rafraîchir le 2x SSC et rincer à nouveau les lames pendant 5 min à température ambiante. Couvrir la cuvette de manière à ce que les sections soient maintenues dans l’obscurité.
   8. Rincer brièvement les lames à l’eau distillée. Déshydratez les lames dans de l’éthanol à 99,5 % et laissez-les sécher à l’air libre. Enfin, montez les diapositives avec une solution contenant DAPI et support de montage.
4. Imagerie
   1. Analysez les résultats au microscope à fluorescence à un grossissement de 630x. Ouvrez le logiciel de traitement d’image sur l’ordinateur. Sélectionnez FISH comme profil.
   2. Vérifiez si l’émission DAPI est réglée à 431 nm et l’excitation à 359 nm, l’émission rouge Texas à 613 nm et l’excitation à 595 nm, et l’émission FITC à 519 nm et l’excitation à 495 nm.
   3. Acquérir une image en sélectionnant Live > Capture Single Image. Optimisez la qualité de l’image en ajustant l’exposition et le gain en déplaçant le curseur d’exposition et le curseur de gain dans le menu Image à gauche (par exemple, exposition : 212 ms et gain : 7,9). L’exposition et le gain requis peuvent varier selon l’image; Observez les changements au cours de ce processus pour obtenir une image optimisée. Enregistrez l’image dans un fichier nouvellement créé.
   4. Conservez les lames dans l’obscurité à 4 °C après analyse pour éviter la perte de signaux.

Résultats

FISH sur cellules ovariennes isolées avant la greffe
Des tissus du cortex ovarien cryoconservés de femelles atteintes de 45,X/46,XX (patient A) ou 45,X/46,XX/47,XXX (patient B) TS ont été utilisés pour illustrer les résultats à l’aide de ce protocole. Chez le patient A, 50% des lymphocytes avaient un caryotype 45,X et 50% avaient 46,XX. Chez le patient B, 38% des lymphocytes étaient 45,X, 28% étaient 46,XX et 34% étaient 47,XXX. Des sondes spécifiques aux centromères pour le chromosome X...

Discussion

L’analyse FISH est une technique bien connue pour détecter les aberrations chromosomiques X dans les lymphocytes ou les cellules buccales des mâles et des femelles¹⁰. Plusieurs études ont décrit FISH sur des gamètes de mâles présentant des aberrations chromosomiques X, mais les informations détaillées obtenues par FISH sur les cellules ovariennes de femelles présentant des aberrations chromosomiques X font encore défaut¹⁴. Cet article présente de nouvelles mé...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetic acid	Biosolve BV	0001070602BS
Centrifuge 1200	Hettich Universal	4140
Collagenase I	Sigma	131470
Coverslip	VWR	0631-0146
DAPI	Vector	H-1200
DNase I	Roche	10104159001
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline	Lonza	BE17-513Q
EDTA	Merck	108421
Eosin-Y	Sigma	1159350100
Ethanol	EMSURE	1009832500
Fetal Bovine Serum (FBS)	Life technology	10100147
Fluorescence microscope for sections DM4 B	Leica Microsystems
Fluorescence microscope scope A1	Zeiss AXIO
Fluorescent labeled probes for dissociated cells	Abbott Diagnostics	CEPX (DXZ1) 05J1023 CEP18 (D18Z1) 05J0818
Fluorescent labeled probes for tissue sections	Abbott Diagnostics	CEP X (DXZ1 05J08-023 CEP 18 (D18Z1)  05J10-028
Formaldehyde	Sigma	252549
Glucose	Merck	108337
Glue (Fixogum)	Leica Microsystems	LK071A
Hematoxylin	Sigma	1159380025
Hybridization buffer	Abott Diagnostics	32-804826/06J67-001
Hybridization Station	Dako	S2451
Hydrochloric acid	Merck	1003171000
Image processing software individual ovarian cortex cells (Cytovision 7.7)	Leica Biosystems
Image processing software on paraffine sections	Leica Application Suitex (3.7.5.24914)
Immunohitochemistry microscope slides	Dako	K802021-2
L15	Lonza	12-700Q
Liberase DH	Roche	05 401 151 001
Light microscope	Zeiss West Germany
Magnesium sulphate	Merck	A335586
Methanol	Honeywell	14262-1L
Mounting medium	Vectashield, Vector	H-1000
Nonidet P40	Sigma	7385-1L
Paraffin	Poth Hile	2712.20.10
Pepsin	Sigma	P7000-25G
Phosphate-Buffered Saline (PBS)	Gibco	11530546
Plastic pipette	CooperSurgical	7-72-4075/1
Potassium chloride	Merck	1049361000
Proteinase K	Qiagen	19131
Rotation microtome HM 355S	Thermo sceintific
Scalpel	Dahlhausen	11.000.00.515
Slide for FISH on dissociated cells	Thermo scientific	J1810AM1JZ
Sodium bicarbonate	Sigma	55761-500G
Standard Sodium Citrate (SSC)	Fisher Scientific, Invitrogen	10515203
Stereomicroscope IX 70	Olympus
Target Retrieval Solution	Dako	GV80511-2
Trypsin	Sigma	T4799
Tween-20	ThermoFisher	85113
Xylene	BOOM	760518191000