Explorando aberrações cromossômicas X em células ovarianas usando hibridização in situ fluorescente

Resumo

Este artigo apresenta dois métodos baseados na hibridização in situ fluorescente para determinar o conteúdo cromossômico X de células ovarianas em tecido córtex ovariano não enxertado e enxertado de fêmeas com aberrações cromossômicas X.

Resumo

Milhões de pessoas em todo o mundo lidam com questões relativas à fertilidade. A redução da fertilidade, ou mesmo a infertilidade, pode ser devida a muitas causas diferentes, incluindo doenças genéticas, das quais as anormalidades cromossômicas são as mais comuns. A hibridação in situ fluorescente (FISH) é um método bem conhecido e frequentemente utilizado para detectar aberrações cromossômicas em humanos. A FISH é usada principalmente para a análise de anormalidades cromossômicas nos espermatozoides de machos com aberrações cromossômicas numéricas ou estruturais. Além disso, essa técnica também é frequentemente aplicada em mulheres para detectar aberrações cromossômicas X que sabidamente causam disgenesia ovariana. No entanto, ainda faltam informações sobre o conteúdo cromossômico X de células ovarianas de mulheres com aberrações cromossômicas X em linfócitos e/ou células bucais.

O objetivo deste estudo é avançar na pesquisa básica sobre aberrações cromossômicas X em fêmeas, apresentando dois métodos baseados em FISH para identificar o conteúdo cromossômico X de células ovarianas. Primeiro, um método é descrito para determinar o conteúdo cromossômico X de células ovarianas isoladas (ovócitos, células da granulosa e células estromais) em tecido do córtex ovariano não enxertado de mulheres com aberrações cromossômicas X. O segundo método é direcionado a avaliar o efeito das aberrações cromossômicas na foliculogênese, determinando o conteúdo cromossômico X de células ovarianas de folículos secundários e antrais recém-formados no tecido ovariano, de fêmeas com aberrações cromossômicas X após enxertia de longo prazo em camundongos imunocomprometidos. Ambos os métodos podem ser úteis em pesquisas futuras para obter informações sobre o potencial reprodutivo de fêmeas com aberrações cromossômicas X.

Introdução

A infertilidade é um problema de saúde do sistema reprodutor masculino ou feminino, afetando aproximadamente 186 milhões de indivíduos em idade reprodutiva no mundo¹. Em pelo menos 35% dos casais inférteis, a infertilidade é causada por um distúrbio do sistema reprodutor feminino². Vários são os fatores que podem causar a infertilidade feminina, como fatores genéticos, anormalidades do trato genital, disfunção endócrina, doenças inflamatórias e tratamento iatrogênico³.

Anormalidades genéticas estão presentes em aproximadamente 10% das fêmeas inférteis ^4,5. De todas as anormalidades genéticas, as aberrações do cromossomo X são a causa mais comum de disgenesia ovariana². Vários estudos relatam que aberrações cromossômicas X em mulheres com síndrome de Turner (ST) ou síndrome do triplo X estão associadas à falência ovariana prematura devido à perda acelerada de células germinativas ou oogênese prejudicada ^6,7,8.

As aberrações do cromossomo X podem ser divididas em: 1) aberrações numéricas, nas quais o número de cromossomos X é diferente, mas os cromossomos X estão intactos; e 2) aberrações estruturais, nas quais o cromossomo X ganhou ou perdeu material genético ^3,9. As aberrações numéricas do cromossomo X são mais comuns que as anormalidades estruturais e são frequentemente causadas por erros espontâneos durante a divisão celular ^3,9. Quando este erro ocorre durante a meiose, pode levar a gametas aneuplóides e, finalmente, a descendentes com aberrações cromossômicas em todas as células. Quando defeitos cromossômicos surgem em células somáticas como resultado de erros que ocorrem durante a mitose nos estágios iniciais da ontogênese, isso pode levar ao mosaicismo. Nesses indivíduos, tanto células com conteúdo cromossômico X normal quanto células com aberrações cromossômicas X estão presentes.

Na década de 1980, uma técnica citogenética chamada hibridização in situ fluorescente (FISH) foi desenvolvida para visualizar e localizar sequências específicas de ácidos nucléicos em cromossomos metafásicos e interfásicos10,11. Essa técnica usa sondas de DNA marcadas com fluorescência para se ligar a uma sequência específica no cromossomo, que pode ser visualizada usando um microscópio de fluorescência.

Atualmente, a FISH é amplamente utilizada como ferramenta diagnóstica clínica e considerada o padrão-ouro na detecção de aberrações cromossômicas10. No campo da medicina reprodutiva, a análise de FISH em espermatozoides tem sido utilizada para obter informações sobre o conteúdo cromossômico X dos espermatozoides em machos com aberrações cromossômicas numéricas ou estruturais em células somáticas12,13,14. Esses estudos mostraram que homens com aberrações cromossômicas eram mais propensos a ter uma maior frequência de espermatozoides aneuploides presentes em seu sêmen em comparação com homens com cariótipos normais^12,13,14.

Em contraste com os espermatozoides, muito pouco se sabe sobre o conteúdo cromossômico X das células ovarianas (incluindo ovócitos, células granulosas/tecais e células estromais) em indivíduos com aberração cromossômica, bem como as possíveis consequências das aneuploidias dessas células sobre seu potencial reprodutivo. Uma razão importante para a escassa informação sobre o cariótipo das células ovarianas em comparação com os espermatozoides é o fato de que as mulheres têm que se submeter a um procedimento invasivo, como uma punção do folículo ou cirurgia para obter ovócitos ou tecido do córtex ovariano. Os gametas femininos são, portanto, de difícil obtenção para fins de pesquisa.

Atualmente, um estudo observacional de intervenção está sendo realizado na Holanda para explorar a eficácia da criopreservação do tecido ovariano em mulheres jovens com ST¹⁵. Um fragmento de tecido do córtex ovariano da paciente estava disponível para identificar o conteúdo cromossômico X das células ovarianas^16,17. Como parte do estudo, um novo método foi desenvolvido com base em FISH do tecido dissociado do córtex ovariano para determinar se aberrações cromossômicas estão presentes em células ovarianas em fêmeas portadoras de uma aberração cromossômica em células somáticas não ovarianas, como linfócitos ou células bucais. Além disso, o efeito das aneuploidias nas células ovarianas sobre a foliculogênese também foi determinado. Para este fim, um protocolo de FISH estabelecido foi modificado que permite a análise de cortes histológicos do tecido do córtex ovariano após foliculogênese artificialmente induzida durante xenotransplante de longo prazo em camundongos imunocomprometidos. Neste estudo, apresentamos dois métodos baseados em FISH para determinar o conteúdo cromossômico X em células ovarianas em tecido do córtex ovariano não enxertado e enxertado em mulheres com aberrações cromossômicas X, com o objetivo de aprimorar a ciência básica sobre este tema.

Protocolo

O protocolo do estudo TurnerFertility foi aprovado pelo Comitê Central de Pesquisa Envolvendo Seres Humanos (NL57738.000.16). Neste estudo, o tecido do córtex ovariano de 93 fêmeas com ST foi obtido. Os materiais que requerem precauções de segurança estão listados na Tabela 1.

Tabela 1: Precauções de segurança.

Material	Perigo
Ácido acético	Queimaduras graves na pele e irritação do sistema respiratório
Colagenase	Irritante para os olhos, sistema respiratório e pele
DAPI	Irritante para os olhos, sistema respiratório e pele
DNase I	Irritante para os olhos, sistema respiratório e pele
Etanol	Altamente inflamável
Formaldeído	Tóxico após inalação, ingestão e contato com a pele
Formamida (em sondas de fluorescência)	Pode prejudicar o nascituro
Liberase	Irritante para os olhos, sistema respiratório e pele
Metanol	Altamente inflamável, tóxico por inalação, ingestão e contato com a pele
Nonidet P40	Irritante para a pele ou olhos
Pepsina	Irritante para os olhos, sistema respiratório e pele
Proteinase K	Dificuldades respiratórias após inalação
Xileno	Altamente inflamável, tóxico após inalação e contato com a pele. Evite o contato com os olhos.

Tabela 1: Materiais que requerem precauções de segurança.

1. FISH em células isoladas do córtex ovariano

1. Dissociação do tecido do córtex ovariano para obtenção de células individuais
   1. Cortar o tecido do córtex ovariano criopreservado/descongelado em pequenos pedaços de aproximadamente 1 mm x 1 mm x 1 mm usando um bisturi.
   2. Digerir enzimaticamente os fragmentos de tecido em 4 mL de meio L15 pré-aquecido (37 °C) contendo 0,1 mg/mL de mistura de enzimas de dissociação tecidual, 10 μg/mL de DNase I e 1 mg/mL de colagenase I de C. histolyticum por um máximo de 75 min a 37 °C. Pipetar a mistura de digestão para cima e para baixo a cada 15 min.
   3. Interromper a digestão enzimática adicionando 4 mL de L15 frio suplementado com 10% de soro fetal bovino (SFB). Lavar o tecido dissociado uma vez com 8 mL de meio L15 frio por centrifugação a 500 x g e ressuspender em 500 μL de meio L15 sem vórtice para evitar danos às células.
   4. Transferir a suspensão celular contendo em grande parte células estromais individuais e pequenos folículos (ovócitos circundados por uma única camada de células da granulosa) para uma placa de Petri plástica e examinar a suspensão celular sob um estereomicroscópio (aumento de 100x).
   5. Pegar os pequenos folículos (<50 μm) manualmente usando uma pipeta plástica de 75 μm e transferir os folículos para uma gota de meio L15 suplementado com FBS a 10% a 4 °C para evitar a agregação dos folículos. Realizar a coleta de folículos por no máximo 30 min. Para melhorar a dispersão celular folicular antes da análise de FISH, transferir os folículos purificados para uma solução de tripsina a 0,06%, ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) 1 mg/mL e glicose 1 mg/mL e incubar por 20 min a 37 °C.
   6. Obter células do estroma ovariano a partir da suspensão de células do córtex usando uma pipeta plástica de 75 μm, tomando especial cuidado para evitar a contaminação com pequenos folículos.
2. Análise FISH de células ovarianas individuais
   1. Transferir os folículos ovarianos tratados (recomendado n = 5-20) com tripsina/EDTA/glicose ou células estromais (n > 1.000) para gotículas de 5 μL de KCl/15 μL de solução salina tamponada com fosfato (DPBS) de Dulbecco em uma lâmina e incubar por 20 min a 37 °C.
   2. Secar e pré-fixar as lâminas em 300 μL de KCl 0,05 mM/ácido acético 7,5%/metanol 22,5% por 2 min à temperatura ambiente (TR). Cobrir as lâminas com metanol/ácido acético (3:1) por 2 min no TR para finalizar a fixação.
   3. Fazer 20x citrato de sódio padrão (SSC) adicionando 876 g de cloreto de sódio e 441 g de citrato trissódico di-hidratado em 5 L de água destilada. Em seguida, adicionar 100 mL de 20x de CSC a 900 mL de água desmineralizada (demi) para obter 2x SSC. Lavar a amostra em 2x SSC a 73 °C, cobri-la com 100 μL de proteinase K a 2% e selá-la com uma lamínula. Incubar as lâminas por 10 min a 37 °C na estação de hibridização.
   4. Retire a lamínula e lave as lâminas por 5 min em DPBS no RT. Fixe a amostra por 5 min com formol a 1% no RT. Nesta fase, o material ainda não está totalmente preso às lâminas de vidro e, portanto, não deve ser colocado em uma plataforma de agitação.
   5. Lavar as lâminas por 5 min em DPBS no TR, seguido de desidratação em 70%, 80%, 90% e etanol 100% subsequentes por 2 min cada. Secar ao ar a amostra desidratada e hibridizá-la com sondas fluorescentemente marcadas.
   6. Selecionar uma sonda centromérica-específica para o cromossomo X e outra sonda centromérica cromossômica-específica como controle para determinar o conteúdo cromossômico X das células ovarianas. Neste caso, são usadas sondas centromémeras específicas para o cromossomo X (CEP X [DXZ1]) diretamente marcado com fluorocromo SpectrumGreen e cromossomo 18 (CEP 18 [D18Z1]) diretamente marcado com fluorocromo SpectrumOrange.
   7. Adicionar 1 μL de CEP X, 1 μL de CEP 18 e 18 μL do tampão de hibridização à amostra e selar com uma lamínula que é colada às lâminas para evitar a evaporação da sonda durante a hibridização. Transferir as lâminas para a estação de hibridização para desnaturação a 73 °C por 3 min, seguida de hibridização durante uma incubação noturna a 37 °C.
   8. Remova a lamínula e qualquer cola restante da lâmina após a hibridização. Lavar as lâminas em 0,4x SSC/0,3% Tween-20 a 72 °C por 2 min, seguido de incubação por 1 min em 2x SSC/0,1% Tween-20 em TR.
   9. Desidratar as lâminas por incubações subsequentes de 2 min em 70%, 80%, 90% e 100% etanol e secar ao ar no escuro. Cubra as lâminas com um meio de montagem contendo 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI). Conservar a -20 °C durante, pelo menos, 10 minutos antes da análise por microscopia de fluorescência.
3. Imagiologia
   1. Examine o(s) sinal(s) do(s) cromossomo X(s) com um microscópio de fluorescência ligado a um software de processamento de imagens.
      1. Primeiro, selecione DAPI fluorocromo.
         1. Adquira uma imagem selecionando Nova célula > Captura de > ao vivo com ampliação de 630x. Uma nova janela com o limite será exibida. Defina a barra azul do limite como 0 para minimizar o plano de fundo e a barra vermelha como o máximo (255) para tornar os sinais mais brilhantes. Clique em Aceitar.
         2. Uma nova janela com aprimoramento aparecerá com uma sugestão para mais escuro/brilhante (12), raio (3) e profundidade (1). Use os valores sugeridos ou ajuste-os se não estiver satisfeito.
      2. Em segundo lugar, selecione fluorochrome SpectrumOrange e clique em Capture.
         1. Defina a barra azul do limite como 0 para minimizar o plano de fundo e a barra vermelha como o máximo (255) para tornar os sinais mais brilhantes. Clique em Aceitar.
         2. A janela com realce aparecerá com uma sugestão para mais escuro/brilhante (-11), raio (2,7) e profundidade (0,6). Use os valores sugeridos ou ajuste-os se não estiver satisfeito.
      3. Finalmente, selecione fluorochrome SpectrumGreen e clique em Capture.
         1. Defina a barra azul do limite como 0 para minimizar o plano de fundo e a barra vermelha como o máximo (255) para tornar os sinais mais brilhantes. Clique em Aceitar.
         2. A janela com realce aparecerá com uma sugestão para mais escuro/brilhante (0), raio (3) e profundidade (0). Use os valores sugeridos ou ajuste-os se não estiver satisfeito. Salve a imagem em um arquivo recém-criado.
            NOTA: As células somáticas só foram avaliadas quando dois sinais do cromossomo controle 18 eram visíveis. Na maioria dos ovócitos, apenas um sinal pôde ser detectado para cada cromossomo.
   2. Conservar as lâminas no escuro a 4 °C após a análise para evitar a perda de sinais.

2. FISH em cortes de parafina de tecido córtex ovariano enxertado

NOTA: Um fragmento de tecido do córtex ovariano criopreservado/descongelado de 18 fêmeas com ST foi xenoenxertado em camundongos imunodeficientes combinados graves (SCID) por 5 meses. O procedimento de xenoenxertia já foi descrito anteriormente e foi realizado na Université Catholique de Louvain (Bruxelas, Bélgica) seguindo as diretrizes locais do Committee on Animal Research em relação ao bem-estar animal (referência 2014/UCL/MD/007)^18,19.

1. Seleção de cortes de tecido do córtex ovariano xenoenxertado contendo folículos
   1. Fixar o tecido do córtex ovariano xenoenxertado em formaldeído a 4% e embutir o tecido em parafina. Aparar os blocos com bisturi para remover parafina extra e cortar o bloco de parafina para 4 μm de espessura em micrótomo de rotação.
   2. Selecione cada sétima seção da fita de parafina para coloração de hematoxilina e eosina (HE) para determinar quais seções contêm folículos. Colocar a secção em banho-maria a 40-45 °C e montá-la em lâminas de microscópio imunohistoquímico.
2. Desparafinização e coloração HE
   1. Coloque as lâminas em um fogão por 10 min a 60 °C e, em seguida, mergulhe as lâminas em xileno 100% por 5 min. Não é necessário colocar as lâminas diretamente no fogão. Hidratar as seções por 15 s em etanol 100%, seguido de 2 x 15 s em etanol 96%. Enxágue as lâminas em água corrente por 2 min.
   2. Manchar as lâminas em hematoxilina por 10 min e, em seguida, enxaguar as lâminas brevemente em água da torneira. Imergir brevemente as lâminas em uma solução de bicarbonato (100 g de sulfato de magnésio e 10 g de bicarbonato de sódio em 5 L de água destilada). Enxágue as lâminas em água corrente por 5 min.
   3. Contracorar as lâminas com eosina por 4 min e desidratá-las três vezes com etanol 100%, seguido de xileno. Cobrir as colorações de HE nas lâminas e avaliar os cortes de HE em microscópio de luz para selecionar os cortes com folículos (aumento de 100x).
3. Pré-tratamento e hibridização de cortes em parafina para DNA FISH
   1. Selecione novas seções que estejam antes ou depois da seção que continha folículos da faixa de parafina. Monte uma seção em uma lâmina de vidro. Secar as secções de parafina durante, pelo menos, 45 minutos num fogão a 56 °C. Não é necessário colocar as lâminas diretamente no fogão.
   2. Desparafinizar as seções em xileno por 10 min. Imergir as lâminas em etanol 99,5% e enxaguar por 5 min em água da torneira. Pré-tratar as lâminas com solução de recuperação do alvo (pH baixo) por 10 min a 96 °C. Após esfriar, enxágue as lâminas em água destilada.
   3. Tratar as lâminas por 5 min com ácido clorídrico 0,01 M, seguido de digestão com pepsina (200 U/mL) por 15 min a 37 °C. Enxaguar novamente as lâminas em ácido clorídrico 0,01 M e posteriormente em PBS.
   4. Fixar as lâminas em formol a 1%/PBS por 5 min. Enxágue as lâminas brevemente em PBS e, em seguida, novamente em água demi. Desidrate as lâminas em etanol 99,5% e deixe-as secar ao ar.
   5. Selecionar uma sonda centromérica-específica para o cromossomo X e outra sonda centromérica cromossômica-específica como controle para determinar o conteúdo cromossômico X das células da granulosa. Aqui, o cromossomo 18 é usado como controle.
   6. Aplicar 5 μL da sonda CEP 18 (D18Z1) diretamente marcada com fluorocromo SpectrumGreen e da sonda CEP X (DXZ1) diretamente marcada com fluorocromo SpectrumRed nas lâminas pré-tratadas. Aplique uma lamínula e sele a área com cola fotográfica. Colocar as lâminas num hibridizador para desnaturação a 80 °C durante 10 min e hibridização durante a noite a 37 °C.
   7. No dia seguinte, enxaguar as lâminas por 5 min em 2x SSC a 42 °C, seguido de 2 min e 1 min de enxágue em Nonidet P40 0,3% a 73 °C. Atualize o CSC 2x e enxágue as lâminas novamente por 5 min à temperatura ambiente. Cubra a cubeta para que as seções sejam mantidas no escuro.
   8. Enxágue brevemente as lâminas em água destilada. Desidrate as lâminas em etanol 99,5% e deixe-as secar ao ar novamente. Por fim, monte as lâminas com uma solução contendo DAPI e meio de montagem.
4. Imagiologia
   1. Analise os resultados em microscópio de fluorescência com aumento de 630x. Abra o software de processamento de imagens no computador. Selecione FISH como o perfil.
   2. Verifique se a emissão DAPI está ajustada em 431 nm e a excitação em 359 nm, emissão vermelha Texas em 613 nm e excitação em 595 nm, e emissão FITC em 519 nm e excitação em 495 nm.
   3. Adquira uma imagem selecionando Live > Capture Single Image. Otimize a qualidade da imagem ajustando a exposição e o ganho movendo o Controle Deslizante de Exposição e o Controle Deslizante de Ganho no menu Imagem à esquerda (por exemplo, exposição: 212 ms e ganho: 7,9). A exposição e o ganho necessários podem variar por imagem; Observe as mudanças durante esse processo para obter uma imagem otimizada. Salve a imagem em um arquivo recém-criado.
   4. Conservar as lâminas no escuro a 4 °C após a análise para evitar a perda de sinais.

Resultados

FISH em células ovarianas isoladas antes da enxertia
Tecido cortical ovariano criopreservado de fêmeas com ST 45,X/46,XX (paciente A) ou 45,X/46,XX/47,XXX (paciente B) foi utilizado para ilustrar os resultados utilizando este protocolo. No paciente A, 50% dos linfócitos tinham cariótipo 45,X e 50% tinham cariótipo 46,XX. No paciente B, 38% dos linfócitos eram 45,X, 28% 46,XX e 34% 47,XXX. Sondas centrômero-específicas para o cromossomo X (verde) e o cromossomo 18 como controle (vermelho) foram...

Discussão

A análise de FISH é uma técnica bem conhecida para detectar aberrações cromossômicas X em linfócitos ou células bucais de homens e mulheres¹⁰. Vários estudos descreveram FISH em gametas de machos com aberrações cromossômicas X, mas informações detalhadas obtidas por FISH em células ovarianas de fêmeas com aberrações cromossômicas X ainda são escassas¹⁴. Este artigo apresenta novos métodos baseados em FISH para determinar se aneuploidias estão presentes...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetic acid	Biosolve BV	0001070602BS
Centrifuge 1200	Hettich Universal	4140
Collagenase I	Sigma	131470
Coverslip	VWR	0631-0146
DAPI	Vector	H-1200
DNase I	Roche	10104159001
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline	Lonza	BE17-513Q
EDTA	Merck	108421
Eosin-Y	Sigma	1159350100
Ethanol	EMSURE	1009832500
Fetal Bovine Serum (FBS)	Life technology	10100147
Fluorescence microscope for sections DM4 B	Leica Microsystems
Fluorescence microscope scope A1	Zeiss AXIO
Fluorescent labeled probes for dissociated cells	Abbott Diagnostics	CEPX (DXZ1) 05J1023 CEP18 (D18Z1) 05J0818
Fluorescent labeled probes for tissue sections	Abbott Diagnostics	CEP X (DXZ1 05J08-023 CEP 18 (D18Z1)  05J10-028
Formaldehyde	Sigma	252549
Glucose	Merck	108337
Glue (Fixogum)	Leica Microsystems	LK071A
Hematoxylin	Sigma	1159380025
Hybridization buffer	Abott Diagnostics	32-804826/06J67-001
Hybridization Station	Dako	S2451
Hydrochloric acid	Merck	1003171000
Image processing software individual ovarian cortex cells (Cytovision 7.7)	Leica Biosystems
Image processing software on paraffine sections	Leica Application Suitex (3.7.5.24914)
Immunohitochemistry microscope slides	Dako	K802021-2
L15	Lonza	12-700Q
Liberase DH	Roche	05 401 151 001
Light microscope	Zeiss West Germany
Magnesium sulphate	Merck	A335586
Methanol	Honeywell	14262-1L
Mounting medium	Vectashield, Vector	H-1000
Nonidet P40	Sigma	7385-1L
Paraffin	Poth Hile	2712.20.10
Pepsin	Sigma	P7000-25G
Phosphate-Buffered Saline (PBS)	Gibco	11530546
Plastic pipette	CooperSurgical	7-72-4075/1
Potassium chloride	Merck	1049361000
Proteinase K	Qiagen	19131
Rotation microtome HM 355S	Thermo sceintific
Scalpel	Dahlhausen	11.000.00.515
Slide for FISH on dissociated cells	Thermo scientific	J1810AM1JZ
Sodium bicarbonate	Sigma	55761-500G
Standard Sodium Citrate (SSC)	Fisher Scientific, Invitrogen	10515203
Stereomicroscope IX 70	Olympus
Target Retrieval Solution	Dako	GV80511-2
Trypsin	Sigma	T4799
Tween-20	ThermoFisher	85113
Xylene	BOOM	760518191000