Esplorazione delle aberrazioni cromosomiche X nelle cellule ovariche utilizzando l'ibridazione fluorescenza in situ

Riepilogo

Questo articolo presenta due metodi basati sull'ibridazione fluorescenza in situ per determinare il contenuto cromosomico X delle cellule ovariche nel tessuto della corteccia ovarica non innestato e innestato da femmine con aberrazioni cromosomiche X.

Abstract

Milioni di persone in tutto il mondo si occupano di questioni riguardanti la fertilità. La riduzione della fertilità, o addirittura l'infertilità, può essere dovuta a molte cause diverse, tra cui disturbi genetici, di cui le anomalie cromosomiche sono le più comuni. L'ibridazione fluorescenza in situ (FISH) è un metodo ben noto e frequentemente utilizzato per rilevare aberrazioni cromosomiche negli esseri umani. La FISH viene utilizzata principalmente per l'analisi di anomalie cromosomiche negli spermatozoi di maschi con aberrazioni cromosomiche numeriche o strutturali. Inoltre, questa tecnica viene spesso applicata anche nelle femmine per rilevare aberrazioni cromosomiche X che sono note per causare disgenesia ovarica. Tuttavia, mancano ancora informazioni sul contenuto cromosomico X delle cellule ovariche di femmine con aberrazioni cromosomiche X nei linfociti e/o nelle cellule buccali.

Lo scopo di questo studio è quello di far progredire la ricerca di base sulle aberrazioni cromosomiche X nelle femmine, presentando due metodi basati sulla FISH per identificare il contenuto cromosomico X delle cellule ovariche. In primo luogo, viene descritto un metodo per determinare il contenuto cromosomico X di cellule ovariche isolate (ovociti, cellule granulosa e cellule stromali) nel tessuto della corteccia ovarica non innestato da femmine con aberrazioni cromosomiche X. Il secondo metodo è diretto a valutare l'effetto delle aberrazioni cromosomiche sulla follicologenesi determinando il contenuto cromosomico X delle cellule ovariche di follicoli secondari e antrali di nuova formazione nel tessuto ovarico, da femmine con aberrazioni cromosomiche X dopo innesto a lungo termine in topi immunocompromessi. Entrambi i metodi potrebbero essere utili nella ricerca futura per ottenere informazioni sul potenziale riproduttivo delle femmine con aberrazioni cromosomiche X.

Introduzione

L'infertilità è un problema di salute del sistema riproduttivo maschile o femminile, che colpisce circa 186 milioni di individui in età riproduttiva in tutto il mondo¹. In almeno il 35% delle coppie infertili, l'infertilità è causata da un disturbo del sistema riproduttivo femminile². Ci sono molti fattori che possono causare infertilità femminile, come fattori genetici, anomalie del tratto genitale, disfunzione endocrina, malattie infiammatorie e trattamento iatrogeno³.

Le anomalie genetiche sono presenti in circa il 10% delle femmine infertili ^4,5. Di tutte le anomalie genetiche, le aberrazioni del cromosoma X sono la causa più comune di disgenesia ovarica². Diversi studi hanno riportato che le aberrazioni cromosomiche X nelle femmine con sindrome di Turner (TS) o sindrome Triple X sono associate a insufficienza ovarica prematura a causa di una perdita accelerata di cellule germinali o oogenesi compromessa ^6,7,8.

Le aberrazioni del cromosoma X possono essere suddivise in: 1) aberrazioni numeriche, in cui il numero di cromosomi X è diverso ma i cromosomi X sono intatti; e 2) aberrazioni strutturali, in cui il cromosoma X ha guadagnato o perso materiale genetico ^3,9. Le aberrazioni numeriche del cromosoma X sono più comuni delle anomalie strutturali e sono spesso causate da errori spontanei durante la divisione cellulare ^3,9. Quando un tale errore si verifica durante la meiosi, può portare a gameti aneuploidi e, infine, alla prole con aberrazioni cromosomiche in tutte le cellule. Quando i difetti cromosomici insorgono nelle cellule somatiche a causa di errori che si verificano durante la mitosi nelle prime fasi dell'ontogenesi, possono portare al mosaicismo. In questi individui sono presenti sia cellule con contenuto cromosomico X normale che cellule con aberrazioni cromosomiche X.

Nel 1980, una tecnica citogenetica chiamata ibridazione fluorescenza in situ (FISH) è stata sviluppata per visualizzare e localizzare specifiche sequenze di acido nucleico sui cromosomi ^10,11 in metafase e interfase. Questa tecnica utilizza sonde di DNA marcate con fluorescenza per legarsi a una sequenza specifica nel cromosoma, che può quindi essere visualizzata utilizzando un microscopio a fluorescenza.

Al giorno d'oggi, la FISH è ampiamente utilizzata come strumento diagnostico clinico ed è considerata il gold standard nel rilevare le aberrazioni cromosomiche¹⁰. Nel campo della medicina riproduttiva, l'analisi FISH sugli spermatozoi è stata utilizzata per ottenere informazioni sul contenuto cromosomico X degli spermatozoi nei maschi con aberrazioni cromosomiche numeriche o strutturali nelle cellule somatiche^12,13,14. Questi studi hanno dimostrato che i maschi con aberrazioni cromosomiche avevano maggiori probabilità di avere una maggiore frequenza di spermatozoi aneuploidi presenti nel loro sperma rispetto ai maschi con cariotipi normali^12,13,14.

A differenza degli spermatozoi, si sa molto poco sul contenuto cromosomico X delle cellule ovariche (inclusi ovociti, cellule granulosa/teca e cellule stromali) in individui con aberrazione cromosomica, così come le possibili conseguenze dell'aneuploidia di queste cellule sul loro potenziale riproduttivo. Una ragione importante per le scarse informazioni sul cariotipo delle cellule ovariche rispetto agli spermatozoi è il fatto che le donne devono sottoporsi a una procedura invasiva come una puntura del follicolo o un intervento chirurgico per ottenere ovociti o tessuto della corteccia ovarica. I gameti femminili sono, quindi, difficili da ottenere per scopi di ricerca.

Attualmente, uno studio di intervento osservazionale è in corso nei Paesi Bassi per esplorare l'efficacia della crioconservazione del tessuto ovarico nelle giovani donne con TS¹⁵. Un frammento del tessuto della corteccia ovarica della paziente era disponibile per identificare il contenuto cromosomico X delle cellule ovariche^16,17. Come parte dello studio, è stato sviluppato un nuovo metodo basato sulla FISH del tessuto dissociato della corteccia ovarica per determinare se le aberrazioni cromosomiche sono presenti nelle cellule ovariche nelle femmine portatrici di un'aberrazione cromosomica nelle cellule somatiche non ovariche, come i linfociti o le cellule buccali. Inoltre, è stato determinato anche l'effetto dell'aneuploidia nelle cellule ovariche sulla follicologenesi. A tal fine, è stato modificato un protocollo FISH stabilito che consente l'analisi delle sezioni istologiche del tessuto della corteccia ovarica dopo follicologenesi indotta artificialmente durante lo xenotrapianto a lungo termine in topi immunocompromessi. In questo studio, presentiamo due metodi basati sulla FISH per determinare il contenuto cromosomico X nelle cellule ovariche nel tessuto della corteccia ovarica non innestato e innestato in femmine con aberrazioni cromosomiche X, con l'obiettivo di migliorare la scienza di base su questo argomento.

Protocollo

Il protocollo di studio TurnerFertility è stato approvato dal Comitato centrale per la ricerca che coinvolge soggetti umani (NL57738.000.16). In questo studio, è stato ottenuto il tessuto della corteccia ovarica di 93 femmine con TS. I materiali che richiedono precauzioni di sicurezza sono elencati nella Tabella 1.

Tabella 1: Precauzioni di sicurezza.

Materiale	Azzardo
Acido acetico	Gravi ustioni cutanee e irritazione del sistema respiratorio
Collagenasi	Irritante per gli occhi, il sistema respiratorio e la pelle
DAPI	Irritante per gli occhi, il sistema respiratorio e la pelle
DNasi I	Irritante per gli occhi, il sistema respiratorio e la pelle
Etanolo	Altamente infiammabile
Formaldeide	Tossico dopo inalazione, ingestione e contatto con la pelle
Formammide (nelle sonde a fluorescenza)	Può danneggiare il nascituro
Liberate	Irritante per gli occhi, il sistema respiratorio e la pelle
Metanolo	Altamente infiammabile, tossico per inalazione, ingestione e contatto con la pelle
Nonidet P40	Irritante per la pelle o gli occhi
Pepsina	Irritante per gli occhi, il sistema respiratorio e la pelle
Proteinasi K	Difficoltà respiratorie dopo l'inalazione
Xilene	Altamente infiammabile, tossico dopo l'inalazione e il contatto con la pelle. Evitare il contatto con gli occhi.

Tabella 1: Materiali che richiedono precauzioni di sicurezza.

1. FISH su singole cellule isolate della corteccia ovarica

1. Dissociazione del tessuto della corteccia ovarica per ottenere singole cellule
   1. Tagliare il tessuto della corteccia ovarica crioconservato / scongelato in piccoli pezzi di circa 1 mm x 1 mm x 1 mm usando un bisturi.
   2. Digerire enzimaticamente i frammenti di tessuto in 4 mL di terreno L15 preriscaldato (37 °C) contenente 0,1 mg/mL di miscela enzimatica di dissociazione tissutale, 10 μg/mL di DNasi I e 1 mg/mL di collagenasi I da C. histolyticum per un massimo di 75 minuti a 37 °C. Pipet la digestione si mescola su e giù ogni 15 minuti.
   3. Interrompere la digestione enzimatica aggiungendo 4 ml di L15 freddo integrato con siero bovino fetale al 10% (FBS). Lavare il tessuto dissociato una volta con 8 ml di terreno L15 freddo mediante centrifugazione a 500 x g e risospendere in 500 μL di terreno L15 senza vortice per evitare danni alle cellule.
   4. Trasferire la sospensione cellulare contenente in gran parte singole cellule stromali e piccoli follicoli (ovociti circondati da un singolo strato di cellule della granulosa) in una capsula di Petri di plastica ed esaminare la sospensione cellulare sotto uno stereomicroscopio (ingrandimento 100x).
   5. Prelevare manualmente i piccoli follicoli (<50 μm) utilizzando una pipetta di plastica da 75 μm e trasferire i follicoli in una goccia di mezzo L15 integrata con FBS al 10% a 4 °C per prevenire l'aggregazione dei follicoli. Eseguire il prelievo del follicolo per un massimo di 30 minuti. Per migliorare la diffusione delle cellule follicolari prima dell'analisi FISH, trasferire i follicoli purificati in una soluzione di tripsina allo 0,06%, 1 mg/ml di acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) e 1 mg/ml di glucosio e incubare per 20 minuti a 37 °C.
   6. Ottenere cellule stromali ovariche dalla sospensione cellulare della corteccia utilizzando una pipetta di plastica da 75 μm, prestando particolare attenzione per evitare la contaminazione con piccoli follicoli.
2. Analisi FISH di singole cellule ovariche
   1. Trasferire i follicoli ovarici trattati (raccomandato n = 5-20) con tripsina/EDTA/glucosio o cellule stromali (n > 1.000) in goccioline di 5 μL di 0,15 mM KCl/15 μL di soluzione salina tamponata fosfato di Dulbecco (DPBS) su un vetrino e incubare per 20 minuti a 37 °C.
   2. Asciugare e prefissare i vetrini in 300 μL di 0,05 mM KCl/7,5% acido acetico/22,5% metanolo per 2 minuti a temperatura ambiente (RT). Coprire i vetrini con metanolo/acido acetico (3:1) per 2 minuti a RT per finalizzare la fissazione.
   3. Preparare 20 volte il citrato di sodio standard (SSC) aggiungendo 876 g di cloruro di sodio e 441 g di citrato trisodico diidrato in 5 L di acqua distillata. Quindi, aggiungere 100 ml di 20x SSC a 900 mL di acqua demineralizzata (demi) per ottenere 2x SSC. Lavare il campione in 2x SSC a 73 °C, coprirlo con 100 μL di proteinasi K al 2% e sigillarlo con un vetrino. Incubare i vetrini per 10 minuti a 37 °C nella stazione di ibridazione.
   4. Rimuovere il vetrino e lavare i vetrini per 5 minuti in DPBS a RT. Fissare il campione per 5 minuti con formaldeide all'1% a RT. In questa fase, il materiale non è ancora completamente attaccato ai vetrini e non deve quindi essere posizionato su una piattaforma vibrante.
   5. Lavare i vetrini per 5 minuti in DPBS a RT, seguiti da disidratazione nel successivo 70%, 80%, 90% e 100% etanolo per 2 minuti ciascuno. Asciugare all'aria il campione disidratato e ibridarlo con sonde marcate con fluorescenza.
   6. Selezionare una sonda centromero specifica per il cromosoma X e un'altra sonda centromerica specifica del cromosoma come controllo per determinare il contenuto cromosomico X delle cellule ovariche. In questo caso, vengono utilizzate sonde centromeriche specifiche per il cromosoma X (CEP X [DXZ1]) direttamente marcate con fluorocromo SpectrumGreen e cromosoma 18 (CEP 18 [D18Z1]) direttamente marcate con fluorocromo SpectrumOrange.
   7. Aggiungere 1 μL di CEP X, 1 μL di CEP 18 e 18 μL del tampone di ibridazione al campione e sigillare con un coprivetrino incollato ai vetrini per evitare l'evaporazione della sonda durante l'ibridazione. Trasferire i vetrini alla stazione di ibridazione per la denaturazione a 73 °C per 3 minuti, seguita dall'ibridazione durante un'incubazione notturna a 37 °C.
   8. Rimuovere il coprislip e l'eventuale colla residua dal vetrino dopo l'ibridazione. Lavare i vetrini in 0,4x SSC/0,3% Tween-20 a 72 °C per 2 minuti, quindi incubazione per 1 min in 2x SSC/0,1% Tween-20 a RT.
   9. Disidratare i vetrini con successive incubazioni di 2 minuti in etanolo al 70%, 80%, 90% e 100% e asciugare all'aria al buio. Coprire i vetrini con un supporto di montaggio contenente 4′,6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI). Conservare a -20 °C per almeno 10 minuti prima dell'analisi al microscopio a fluorescenza.
3. Imaging
   1. Esaminare i segnali per il cromosoma X con un microscopio a fluorescenza collegato a un software di elaborazione delle immagini.
      1. Innanzitutto, selezionare DAPI fluorocromatici.
         1. Acquisisci un'immagine selezionando Nuova cella > Live > Capture con ingrandimento 630x. Apparirà una nuova finestra con la soglia. Impostare la barra blu della soglia su 0 per ridurre a icona lo sfondo e la barra rossa al massimo (255) per rendere i segnali più luminosi. Fare clic su Accetta.
         2. Apparirà una nuova finestra con un suggerimento per più scuro/più luminoso (12), raggio (3) e profondità (1). Utilizzare i valori suggeriti o modificarli se non soddisfatti.
      2. In secondo luogo, selezionare fluorochrome SpectrumOrange e fare clic su Capture.
         1. Impostare la barra blu della soglia su 0 per ridurre a icona lo sfondo e la barra rossa al massimo (255) per rendere i segnali più luminosi. Fare clic su Accetta.
         2. La finestra con il miglioramento apparirà con un suggerimento per più scuro / più luminoso (-11), raggio (2,7) e profondità (0,6). Utilizzare i valori suggeriti o modificarli se non soddisfatti.
      3. Infine, seleziona fluorochrome SpectrumGreen e fai clic su Capture.
         1. Impostare la barra blu della soglia su 0 per ridurre a icona lo sfondo e la barra rossa al massimo (255) per rendere i segnali più luminosi. Fare clic su Accetta.
         2. La finestra con il miglioramento apparirà con un suggerimento per più scuro / più luminoso (0), raggio (3) e profondità (0). Utilizzare i valori suggeriti o modificarli se non soddisfatti. Salvare l'immagine in un file appena creato.
            NOTA: Le cellule somatiche sono state valutate solo quando erano visibili due segnali del cromosoma 18 di controllo. Nella maggior parte degli ovociti, è stato possibile rilevare un solo segnale per ciascun cromosoma.
   2. Conservare i vetrini al buio a 4 °C dopo l'analisi per evitare la perdita di segnali.

2. FISH su sezioni di paraffina di tessuto della corteccia ovarica innestata

NOTA: Un frammento di tessuto della corteccia ovarica crioconservato/scongelato di 18 femmine con TS è stato xenotrapiantato in topi immunodeficienti combinati gravi (SCID) per 5 mesi. La procedura di xenotrapimento è stata descritta in precedenza ed è stata condotta presso l'Université Catholique de Louvain (Bruxelles, Belgio) seguendo le linee guida locali del Comitato per la ricerca sugli animali in materia di benessere degli animali (riferimento 2014/UCL/MD/007)^18,19.

1. Selezione di sezioni di tessuto della corteccia ovarica xenotrapiantata contenente follicoli
   1. Fissare il tessuto della corteccia ovarica xenotrapiantata in formaldeide al 4% e incorporare il tessuto in paraffina. Tagliare i blocchi con un bisturi per rimuovere la paraffina extra e tagliare il blocco di paraffina a 4 μm di spessore su un microtomo di rotazione.
   2. Selezionare ogni settima sezione del nastro di paraffina per la colorazione con ematossilina ed eosina (HE) per determinare quali sezioni contengono follicoli. Mettere la sezione a bagnomaria a 40-45 °C e montarla su vetrini da microscopio immunoistochimico.
2. Deparaffinizzazione e colorazione HE
   1. Mettere i vetrini su una stufa per 10 minuti a 60 °C, quindi immergere i vetrini in xilene al 100% per 5 minuti. Non è necessario posizionare le diapositive direttamente sul fornello. Idratare le sezioni per 15 s in etanolo al 100%, seguito da 2 x 15 s in etanolo al 96%. Risciacquare gli scivoli in acqua di rubinetto per 2 minuti.
   2. Macchiare i vetrini in ematossilina per 10 minuti e successivamente sciacquare brevemente i vetrini con acqua di rubinetto. Immergere brevemente i vetrini in una soluzione di bicarbonato (100 g di solfato di magnesio e 10 g di bicarbonato di sodio in 5 L di acqua distillata). Risciacquare gli scivoli in acqua di rubinetto per 5 minuti.
   3. Controcolorare i vetrini con eosina per 4 minuti e disidratare i vetrini tre volte con etanolo al 100%, seguito da xilene. Coprire le macchie HE sui vetrini e valutare le sezioni HE al microscopio ottico per selezionare le sezioni con follicoli (ingrandimento 100x).
3. Pre-trattamento e ibridazione di sezioni di paraffina per DNA FISH
   1. Selezionare le nuove sezioni che giacciono prima o dopo la sezione che conteneva i follicoli dal nastro di paraffina. Montare una sezione su un vetrino. Asciugare le sezioni di paraffina per almeno 45 minuti su un fornello a 56 °C. Non è necessario posizionare le diapositive direttamente sul fornello.
   2. Deparaffinizzare le sezioni in xilene per 10 min. Immergere i vetrini in etanolo al 99,5% e sciacquarli per 5 minuti in acqua di rubinetto. Pretrattare i vetrini con la soluzione di prelievo target (pH basso) per 10 minuti a 96 °C. Dopo il raffreddamento, sciacquare i vetrini in acqua distillata.
   3. Trattare i vetrini per 5 minuti con acido cloridrico 0,01 M, seguito da digestione della pepsina (200 U/ml) per 15 minuti a 37 °C. Risciacquare nuovamente i vetrini in acido cloridrico 0,01 M e successivamente in PBS.
   4. Fissare i vetrini in formaldeide all'1% / PBS per 5 minuti. Risciacquare brevemente i vetrini in PBS e poi di nuovo in acqua demi. Disidratare i vetrini in etanolo al 99,5% e lasciarli asciugare all'aria.
   5. Selezionare una sonda centromera specifica per il cromosoma X e un'altra sonda centromerica specifica del cromosoma come controllo per determinare il contenuto cromosomico X delle cellule della granulosa. Qui, il cromosoma 18 viene utilizzato come controllo.
   6. Applicare 5 μL di sonda CEP 18 (D18Z1) direttamente etichettata con fluorocromo SpectrumGreen e sonda CEP X (DXZ1) direttamente etichettata con fluorocromo SpectrumRed sui vetrini pretrattati. Applicare un coprivetrino e sigillare l'area con colla fotografica. Posizionare i vetrini in un ibridatore per la denaturazione a 80 °C per 10 minuti e l'ibridazione durante la notte a 37 °C.
   7. Il giorno successivo, sciacquare i vetrini per 5 minuti in 2x SSC a 42 °C, quindi con un risciacquo di 2 minuti e 1 min in 0,3% Nonidet P40 a 73 °C. Rinfrescare il 2x SSC e risciacquare nuovamente i vetrini per 5 minuti a temperatura ambiente. Coprire la cuvetta in modo che le sezioni siano tenute al buio.
   8. Risciacquare brevemente i vetrini in acqua distillata. Disidratare i vetrini in etanolo al 99,5% e lasciarli asciugare nuovamente all'aria. Infine, montare le guide con una soluzione contenente DAPI e supporto di montaggio.
4. Imaging
   1. Analizza i risultati al microscopio a fluorescenza con ingrandimento 630x. Aprire il software di elaborazione delle immagini sul computer. Selezionare FISH come profilo.
   2. Controllare se l'emissione DAPI è impostata a 431 nm e l'eccitazione a 359 nm, l'emissione rossa del Texas a 613 nm e l'eccitazione a 595 nm e l'emissione FITC a 519 nm e l'eccitazione a 495 nm.
   3. Acquisire un'immagine selezionando Live > Capture Single Image. Ottimizza la qualità dell'immagine regolando l'esposizione e il guadagno spostando il cursore Esposizione e il cursore guadagno nel menu Immagine a sinistra (ad esempio, esposizione: 212 ms e guadagno: 7,9). L'esposizione e il guadagno richiesti possono variare a seconda dell'immagine; Osservare le modifiche durante questo processo per ottenere un'immagine ottimizzata. Salvare l'immagine in un file appena creato.
   4. Conservare i vetrini al buio a 4 °C dopo l'analisi per evitare la perdita di segnali.

Risultati

FISH su cellule ovariche isolate prima dell'innesto
Il tessuto crioconservato della corteccia ovarica di femmine con 45,X/46,XX (paziente A) o 45,X/46,XX/47,XXX (paziente B) TS è stato utilizzato per illustrare i risultati utilizzando questo protocollo. Nel paziente A, il 50% dei linfociti aveva un cariotipo 45,X e il 50% aveva 46,XX. Nel paziente B, il 38% dei linfociti era 45,X, il 28% era 46,XX e il 34% era 47,XXX. Le sonde centromeri-specifiche per il cromosoma X (verde) e il cromosoma 18 come co...

Discussione

L'analisi FISH è una tecnica ben nota per rilevare aberrazioni cromosomiche X nei linfociti o nelle cellule buccali di maschi e femmine¹⁰. Diversi studi hanno descritto la FISH su gameti di maschi con aberrazioni cromosomiche X, ma mancano ancora informazioni dettagliate ottenute dalla FISH su cellule ovariche di femmine con aberrazioni cromosomiche X¹⁴. Questo articolo presenta nuovi metodi basati sulla FISH per determinare se l'aneuploidia è presente nelle cellule ovari...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetic acid	Biosolve BV	0001070602BS
Centrifuge 1200	Hettich Universal	4140
Collagenase I	Sigma	131470
Coverslip	VWR	0631-0146
DAPI	Vector	H-1200
DNase I	Roche	10104159001
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline	Lonza	BE17-513Q
EDTA	Merck	108421
Eosin-Y	Sigma	1159350100
Ethanol	EMSURE	1009832500
Fetal Bovine Serum (FBS)	Life technology	10100147
Fluorescence microscope for sections DM4 B	Leica Microsystems
Fluorescence microscope scope A1	Zeiss AXIO
Fluorescent labeled probes for dissociated cells	Abbott Diagnostics	CEPX (DXZ1) 05J1023 CEP18 (D18Z1) 05J0818
Fluorescent labeled probes for tissue sections	Abbott Diagnostics	CEP X (DXZ1 05J08-023 CEP 18 (D18Z1)  05J10-028
Formaldehyde	Sigma	252549
Glucose	Merck	108337
Glue (Fixogum)	Leica Microsystems	LK071A
Hematoxylin	Sigma	1159380025
Hybridization buffer	Abott Diagnostics	32-804826/06J67-001
Hybridization Station	Dako	S2451
Hydrochloric acid	Merck	1003171000
Image processing software individual ovarian cortex cells (Cytovision 7.7)	Leica Biosystems
Image processing software on paraffine sections	Leica Application Suitex (3.7.5.24914)
Immunohitochemistry microscope slides	Dako	K802021-2
L15	Lonza	12-700Q
Liberase DH	Roche	05 401 151 001
Light microscope	Zeiss West Germany
Magnesium sulphate	Merck	A335586
Methanol	Honeywell	14262-1L
Mounting medium	Vectashield, Vector	H-1000
Nonidet P40	Sigma	7385-1L
Paraffin	Poth Hile	2712.20.10
Pepsin	Sigma	P7000-25G
Phosphate-Buffered Saline (PBS)	Gibco	11530546
Plastic pipette	CooperSurgical	7-72-4075/1
Potassium chloride	Merck	1049361000
Proteinase K	Qiagen	19131
Rotation microtome HM 355S	Thermo sceintific
Scalpel	Dahlhausen	11.000.00.515
Slide for FISH on dissociated cells	Thermo scientific	J1810AM1JZ
Sodium bicarbonate	Sigma	55761-500G
Standard Sodium Citrate (SSC)	Fisher Scientific, Invitrogen	10515203
Stereomicroscope IX 70	Olympus
Target Retrieval Solution	Dako	GV80511-2
Trypsin	Sigma	T4799
Tween-20	ThermoFisher	85113
Xylene	BOOM	760518191000