JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يحدد هذا البروتوكول تجربة الهجرة في المختبر المناسبة للتحليل الوظيفي للجزيئات المشاركة في الهجرة في الجسم الحي لخلايا القمة العصبية إلى المصفوفة خارج الخلية الغنية بالهيالورونان.

Abstract

خلايا القمة العصبية (NCCs) هي خلايا شديدة الارتحال تنشأ من المنطقة الظهرية للأنبوب العصبي. تعد هجرة الخلايا الخيطية من الأنبوب العصبي عملية أساسية لإنتاج NCC وهجرتها اللاحقة نحو المواقع المستهدفة. يتضمن مسار هجرة NCCs ، بما في ذلك أنسجة الأنبوب العصبي المحيطة ، مصفوفة خارج الخلية غنية بالهيالورونان (HA). لنمذجة هجرة NCC إلى هذه الأنسجة المحيطة الغنية ب HA من الأنبوب العصبي ، تم إنشاء اختبار هجرة الركيزة المختلطة الذي يتكون من HA (متوسط الوزن الجزيئي: 1,200-1,400 kDa) والكولاجين من النوع الأول (Col1) في هذه الدراسة. يوضح اختبار الهجرة هذا أن خلايا خط خلايا NCC ، O9-1 ، مهاجرة للغاية على الركيزة المختلطة وأن طلاء HA يتحلل في موقع الالتصاقات البؤرية أثناء الهجرة. يمكن أن يكون هذا النموذج في المختبر مفيدا لمزيد من الاستكشاف للأساس الميكانيكي الذي ينطوي عليه هجرة NCC. ينطبق هذا البروتوكول أيضا على تقييم ركائز مختلفة كسقالات لدراسة هجرة NCC.

Introduction

خلايا القمة العصبية (NCCs) هي مجموعة خلايا متعددة القدرات موجودة في الأجنة النامية ، وتنشأ من حدود الصفيحة العصبية أثناء العصبية. أنها تسهم في تشكيل مجموعة متنوعة من الأنسجة ، بما في ذلك الجهاز العصبي المحيطي ، ونظام القلب والأوعية الدموية ، والأنسجة القحفية الوجهية ، والهيكل العظمي1. بعد الحث ومواصفات NCC على حدود الصفيحة العصبية ، تهاجر NCCs من الظهارة العصبية وتهاجر نحو مواقع الأنسجة المشتقة من NCC1.

الهيالورونان (HA) هو جليكوزامينوجليكان غير كبريتي يتم توزيعه في مجموعة متنوعة من الأنسجة كمكون للمصفوفة خارج الخلية (ECM). تم إثبات أهمية HA في تطور الجنين في الأنظمة النموذجية من خلال استئصال الجينات المسؤولة عن استقلاب الهيالورونان. على سبيل المثال ، تم العثور على طفرات في جينات سينسيز الهيالورونان (Has1 و Has2) في Xenopus تؤدي إلى عيوب هجرة NCC والتشوه القحفيالوجهي 2. بالإضافة إلى ذلك ، تم الإبلاغ عن أن البروتيوغليكان المرتبط ب HA ، aggrecan و versican ، يمارس تأثيرات مثبطة على هجرة NCC3. في الفئران ، يؤدي الاجتثاث Has2 إلى عيوب شديدة في تكوين وسادة الشغاف ، مما يؤدي إلى فتك منتصف الحمل (E9.5-10)4،5،6.

ثبت مؤخرا أن البروتين عبر الغشاء 2 (Tmem2) ، وهو هيالورونيداز سطح الخلية ، يلعب دورا مهما في تعزيز التصاق الخلايا السرطانية بوساطة الأنتغرين وهجرتها عن طريق إزالة HA المرتبط بالمصفوفة في مواقع الالتصاق 7,8. في الآونة الأخيرة ، أظهر Inubushi et al.9 أن نقص Tmem2 يؤدي إلى عيوب قحفية وجهية شديدة بسبب تشوهات في هجرة / هجرة NCC والبقاء على قيد الحياة. في الدراسة السابقة9 ، تم تحليل تعبير Tmem2 أثناء تكوين NCC والهجرة. لوحظ تعبير Tmem2 في موقع تفريغ NCC وفي هجرة NCCs الإيجابية Sox9 (الشكل 1). بالإضافة إلى ذلك ، باستخدام خلايا القمة العصبية للفأر المستنفد Tmem2 O9-1 ، أظهرت الدراسة أن التعبير في المختبر ل Tmem2 كان ضروريا لخلايا O9-1 لتشكيل التصاقات بؤرية وهجرتها إلى ركائز تحتوي على HA (الشكل 2 والشكل 3) 9.

تشير هذه النتائج بقوة إلى أن Tmem2 مهم أيضا لالتصاق NCC والانتقال من خلال ECM الغني ب HA. ومع ذلك ، فإن الآلية الجزيئية لالتصاق NCC والهجرة داخل ECM الغنية ب HA لا تزال غير واضحة. لذلك ، من الضروري إنشاء نظام تجريبي للثقافة في المختبر لاستكشاف التصاق NCC والهجرة بشكل كامل داخل ECM الغني ب HA.

من بين الأساليب العديدة المستخدمة في اختبار هجرة الخلايا ، فإن الفحص القائم على إغلاق جرح الخلية هو طريقة بسيطة تستخدم بشكل متكرر في مجالات علم وظائف الأعضاء والأورام10. هذا النهج مفيد بسبب صلته بالنمط الظاهري في الجسم الحي وهو فعال في تحديد أدوار الأدوية والجاذبات الكيميائية أثناء هجرة الخلايا11. من الممكن تقييم قدرة الهجرة لكل من كتل الخلايا الكاملة والخلايا الفردية عن طريق قياس مسافات فجوة الخلية بمرور الوقت11. في هذه المخطوطة ، تم تقديم اختبار معدل قائم على إغلاق الجروح في المختبر لنموذج هجرة NCC إلى الأنسجة الغنية ب HA المحيطة بالأنبوب العصبي. ينطبق هذا الإجراء أيضا على دراسة مكونات ECM المختلفة (مثل الكولاجين والفبرونيكتين واللامينين) لتحليل دور سقالة ECM في هجرة NCC.

Protocol

تمت الموافقة على جميع الإجراءات من قبل لجنة أخلاقيات الحيوان في كلية الدراسات العليا لطب الأسنان بجامعة أوساكا.

1. ثقافة خلايا قمة الجمجمة العصبية الفأر

ملاحظة: يتكون خط خلايا القمة العصبية المستخدم في هذه الدراسة من خلايا O9-1 ، المشتقة أصلا من Wnt1-Cre. الخلايا المعبرة عن R26R-GFP المعزولة من أجنة الفئران E8.512 (انظر المناقشة). تتبع الطريقة الموضحة هنا لزراعة خلايا O9-1 البروتوكول13 الذي تم إنشاؤه مسبقا.

  1. تحضير لوحة مصفوفة الغشاء القاعدي.
    1. قم بإذابة مصفوفة الغشاء القاعدي (انظر جدول المواد) على الجليد. تمييع المصفوفة 1:50 في 1x PBS المبردة ، والحفاظ على الجليد.
    2. قم بتغطية صفيحة استزراع 10 سم ب 10 مل من محلول مصفوفة الغشاء القاعدي المخفف. احتضان اللوحة في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة ، ونضح المصفوفة قبل الاستخدام.
    3. اغسل الطبق 3x مع 2 مل من PBS.
  2. ثقافة خلايا O9-1 على لوحة مغلفة بمصفوفة الغشاء القاعدي.
    1. قم بتسخين وسط الخلية الجذعية الجنينية الكاملة (انظر جدول المواد) في حمام مائي عند 37 درجة مئوية.
    2. امزج تعليق الخلية O9-1 برفق (انظر جدول المواد) واحسب عدد الخلايا باستخدام عداد الخلايا الآلي (انظر جدول المواد). اضبط تركيز الخلية على 1.1 × 106 / مل باستخدام وسيط خلية ES كامل.
    3. أضف 8 مل من وسط الخلايا الجذعية الجنينية الكامل الذي تم تسخينه مسبقا إلى صفيحة الاستزراع 10 سم المطلية بالمصفوفة ، وقم بزرع خلايا O9-1 عند 1.1 × 106 خلايا / لوحة. احتضان عند 37 درجة مئوية في حاضنة مرطبة 5٪ CO2 .
    4. في اليوم التالي ، استبدل الوسط بوسط خلية ES كامل جديد (تم تسخينه مسبقا إلى 37 درجة مئوية). استبدله بوسط طازج كل 2-3 أيام بعد ذلك.
      ملاحظة: عندما تكون الخلايا متقاربة بنسبة 80٪ تقريبا (3-4 أيام بعد الطلاء) ، يمكن فصلها بنسبة 0.25٪ من التربسين-EDTA وتمريرها أكثر أو تجميدها لاستخدامها لاحقا. يوضح الشكل 1 صورا تمثيلية لخلايا O9-1.
    5. اغسل طبق الاستزراع ب 2 مل من 1x PBS قبل التربسين. يضاف 2 مل من التربسين-EDTA المسخن مسبقا بنسبة 0.25٪ ويحتضن لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية. تحقق من انفصال الخلية الكامل ؛ اضغط برفق على جانب اللوحة عدة مرات إذا لزم الأمر.
    6. أضف 2 مل من وسط الخلايا الجذعية الجنينية الكامل الذي تم تسخينه مسبقا إلى لوحة المزرعة وانقل الخلايا المنفصلة إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مل. جهاز طرد مركزي الأنبوب عند 300 × جم لمدة 5 دقائق.
    7. تخلص من المادة الطافية دون إزعاج حبيبات الخلية. بعد ذلك ، أضف 2 مل من وسط الخلايا الجذعية الجنينية الكامل الذي تم تسخينه مسبقا إلى الأنبوب ، وأعد تعليق الخلايا تماما عن طريق الماصة. زرع الخلايا على لوحة استزراع جديدة بكثافة الخلية المطلوبة.
    8. بدلا من ذلك ، قم بإعداد مخزون الخلايا المجمدة عن طريق إضافة 1 مل من وسط تجميد الخلايا الذي يحتوي على 10٪ ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) إلى الأنبوب بدلا من وسط الخلايا الجذعية الجنينية الكامل وإعادة تعليق الخلايا تماما. انقل تعليق الخلية إلى أنابيب التبريد ، واحفظه في درجة حرارة -80 درجة مئوية.

2. تحضير الطبق المطلي ب HA / Col1

ملاحظة: تم اقتراح الطريقة الأصلية لطلاء HA / Col1 على أطباق ذات قاع زجاجي بواسطة Irie et al.7.

  1. أضف بعناية 50 ميكرولتر من ثلاثي إيثوكسيسيلان غير المخفف إلى طبق ذو قاع زجاجي 3.5 سم (انظر جدول المواد). احتضان لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة (RT) وحفظه بعيدا عن الضوء.
    ملاحظة: يجب ألا تتجاوز الحضانة مع ثلاثي إيثوكسيسيلان 5 دقائق. قد يؤثر ذلك على كفاءة الطلاء وينتج منتجات غير مرغوب فيها.
  2. اغسل الطبق بسرعة 3 مرات مع 2 مل من الماء المقطر. أضف 50 ميكرولتر من 0.25٪ جلوتارالدهيد ، مخفف 100x في برنامج تلفزيوني ، لكل طبق ، واحتضانه في RT لمدة 30 دقيقة.
  3. اغسل بسرعة 4x مع 2 مل من برنامج تلفزيوني. ثم قم بتغطية الأطباق ب 300 ميكرولتر من الكولاجين من النوع الأول في 0.2 N حمض الخليك في RT لمدة 1 ساعة.
  4. يغسل بسرعة 3x مع 2 مل من PBS. أضف 300 ميكرولتر من 200 ميكروغرام / مل من هيالورونات الصوديوم H2 (FAHA-H2) المسمى بالفلوريسينامين (المخفف في PBS) إلى كل طبق واحتضانه طوال الليل في RT. اغسل مرة أخرى 3x مع 2 مل من PBS. بعد استنشاق برنامج تلفزيوني ، جفف اللوحة بالهواء لمدة 5 دقائق على مقعد نظيف.
    ملاحظة: FAHA-H2 عبارة عن هيالورونات الصوديوم المسمى بالفلورسينامين بمتوسط وزن جزيئي يتراوح بين 1200-1600 كيلو فولت أمبير. يمكن استخدام HA ذو الوزن الجزيئي المناسب وفقا لتصميم البحث.

3. مقايسة الهجرة على الطبق المطلي ب HA / Col1

ملاحظة: تم إجراء اختبار قائم على إغلاق الجرح باستخدام فجوات خالية من الخلايا 500 ميكرومتر محددة في ركائز Col1 / HA باستخدام إدخالات ثقافة بئرين (انظر جدول المواد). تعبر خلايا O9-1 عن Tmem2 ، وهو أمر مطلوب لالتصاق وتدهور HA في الفضاء خارج الخلية9 (الشكل 2 والشكل 3).

  1. بعد تجفيف الطبق ذو القاع الزجاجي المطلي ، قم بتوصيل إدخالات الثقافة 2-well بالأطباق ، واملأ الإدخالات خارجيا ب 1 مل من PBS.
  2. قم بزرع خلايا O9-1 في الآبار عند 1 × 104 خلايا في 100 ميكرولتر من وسط النسر المعدل من Dulbecco (DMEM) الذي يحتوي على 2٪ مصل بقري جنيني (FBS) لكل إدخال. استزراع الخلايا لمدة يومين عند 37 درجة مئوية في حاضنة مرطبة بنسبة 5٪ CO2 .
  3. قم بإزالة الحشوات بعناية من الأطباق ذات القاع الزجاجي المطلي بالملاقط. اغسل الأطباق ذات القاع الزجاجي المطلي برفق باستخدام 2 مل من 1x PBS لإزالة الخلايا وحطام الخلايا. أضف 2 مل من DMEM الطازج الذي يحتوي على 2٪ FBS إلى أطباق الاستزراع.
  4. التقط صورا بتباين الطور الآن كنقطة زمنية للبدء باستخدام مجهر مضان الكل في واحد في وضع أحادي اللون مع إعدادات عالية الدقة (كسب عند 6 ديسيبل ، بدون تجميع). تم استخدام العدسات الموضوعية ذات التكبير من 4x إلى 20x للتصوير في هذه الدراسة (انظر جدول المواد).
    ملاحظة: التقط صور تباين الطور باستخدام أشرطة المقياس المقابلة واحفظها بتنسيق TIFF.
  5. استزرع الخلايا لمدة 48 ساعة إضافية عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2. التقط صورا بتباين الطور عند 24 ساعة و 48 ساعة في الثقافة باستخدام مجهر مضان الكل في واحد.
  6. ثبت الخلايا عند 48 ساعة باستخدام 1 مل من 4٪ بارافورمالدهيد (PFA) لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة أو طوال الليل عند 4 درجات مئوية. ثم اغسل الأطباق 3 مرات لمدة 5 دقائق لكل منها 1 مل من برنامج تلفزيوني طازج.
  7. ضع غطاء مع وسيط تثبيت (انظر جدول المواد) لمزيد من المراقبة المورفولوجية.
    ملاحظة: يمكن تصوير الأطباق على الفور أو تخزينها لمدة تصل إلى 2 أشهر عند 4 درجات مئوية.
  8. اختياري: تسمية الخلايا المناعية للبروتينات ذات الأهمية.
    ملاحظة: يوصف هنا كمثال بروتوكول للكشف عن مركب الالتصاق البؤري (FA) باستخدام جسم مضاد أحادي النسيلة مشتق من الفأر (انظر جدول المواد).
    1. احتضن الأطباق (من الخطوة 3.6) ب 0.5 مل من العازلة المانعة (5٪ مصل الماعز العادي في برنامج تلفزيوني) لمدة 60 دقيقة.
      ملاحظة: اختر حاجزا مناسبا للحظر للجسم المضاد الأساسي. سيكون المخزن المؤقت النموذجي للحجب هو مصل طبيعي بنسبة 5٪ من نفس النوع مثل الجسم المضاد الثانوي المستخدم.
    2. تحضير الجسم المضاد الأولي المخفف في المخزن المؤقت لتخفيف الأجسام المضادة (1٪ مصل الماعز الطبيعي في برنامج تلفزيوني). احتضان الأطباق مع 0.5 مل من الأجسام المضادة الأولية المخففة طوال الليل عند 4 درجات مئوية.
      ملاحظة: اختر المخزن المؤقت المناسب لتخفيف الأجسام المضادة. عادة ، يتم استخدام الجسم المضاد في تخفيف 1: 50-1: 200.
    3. شطف 3x لمدة 5 دقائق لكل منها مع 2 مل من PBS. قم بإعداد الجسم المضاد الثانوي المخفف المشتق من الماعز المضاد للفأر في المخزن المؤقت لتخفيف الأجسام المضادة (1٪ مصل الماعز الطبيعي في برنامج تلفزيوني). احتضان الأطباق مع 0.5 مل من الأجسام المضادة الثانوية المخففة لمدة 1-3 ساعات في درجة حرارة الغرفة.
      ملاحظة: عادة ، يتم استخدام الجسم المضاد الثانوي عند تخفيف 1: 500-1: 1,000. يمكن استخدام DAPI لتلطيخ النوى.
    4. شطف 3x مع 2 مل من PBS لمدة 5 دقائق في كل مرة. ضع غطاء الغطاء مع 50 ميكرولتر من وسيط التثبيت.
      ملاحظة: يمكن تصوير الأطباق باستخدام المجهر الفلوري الكل في واحد مع مرشح GFP (الإثارة: 470/40 ، الانبعاث: 525/50) ومرشح TexasRed (الإثارة: 560/40 ، الانبعاث: 630/75) في وضع أحادي اللون مع إعدادات عالية الدقة (كسب عند 6 ديسيبل ، بدون تجميع). تم استخدام عدسات موضوعية ذات تكبير من 4x إلى 20x للتصوير في هذه الدراسة.
      ملاحظة: يمكن تخزين الشريحة لمدة تصل إلى 2 أشهر عند 4 درجات مئوية.

4. تحليل البيانات

  1. افتح برنامج ImageJ 1.51s. في نافذة ImageJ، حدد ملف > فتح من شريط القائمة لفتح ملف الصورة المحفوظ.
  2. لضبط مقياس القياس ، ارسم خطا بنفس مسافة شريط المقياس. انتقل إلى تحليل > تعيين مقياس واكتب المسافة والوحدات المعروفة للخط في المربعات المناسبة في نافذة تعيين المقياس .
  3. ارسم خطا مستقيما بين فجوة الخلية، واضغط على تحليل > قياس لنقل القيم إلى نافذة بيانات. قم بقياس خمسة مواضع مختلفة على الأقل في كل عينة ، وقم بحساب متوسط المسافات للحصول على بيانات العينة التمثيلية. إجراء التحليلات الإحصائية باستخدام البرامج المناسبة (انظر جدول المواد).

النتائج

تم إجراء اختبار الهجرة على ركائز مختلطة تتكون من Col1 والوزن الجزيئي العالي HA (متوسط الوزن الجزيئي: 1,200-1,400 كيلو دالتون) باستخدام البروتوكول الموضح هنا. تم العثور على خلايا O9-1 عند حدود الفجوة تهاجر بسهولة إلى الفجوة الغنية ب HA (الشكل 4). أكد التلوين المناعي لعلامة FA ، vinculin

Discussion

تنظم مكونات ECM المختلفة الهجرة / الهجرة NCC. على سبيل المثال ، ينظم HA بشكل إيجابي ترحيل NCC 2,15. ومن المثير للاهتمام ، أن دراسة تستند إلى نماذج الفئران الجينية ل Tmem2 ، وهو هيالورونيداز سطح الخلية ، أوضحت متطلبات تدهور HA في هجرة NCC9. الكولاجين وفير أيضا ?...

Disclosures

ويعلن صاحب البلاغ أنه لا توجد مصالح متنافسة.

Acknowledgements

أعرب عن تقديري الكبير لفوميتوشي إيري ويو ياماغوتشي لتشجيعهما واقتراحاتهما الطيبة في إنشاء هذه الطريقة. تم دعم هذا العمل من خلال المنح المساعدة لبرامج البحث العلمي من الجمعية اليابانية لتعزيز العلوم (#19KK0232 إلى TI ، #20H03896 إلى T.I.). تم وصف الطريقة الأصلية لطلاء HA على ركائز زجاجية ومقايسات تحلل HA في الموقع على الركائز في Yamamoto et al. (2017) 8 ، بينما تم وصف طريقة تحضير ركائز HA / Col1 المختلطة في Irie et al. (2021) 7.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
10cm cell culture dishCORNINGCat. 353003
1X PBSMilliporeCat. No. BSS-1005-B
2-well culture insertsibidiCat. No. 80209
Alexa 555-labelled goat anti-mouse IgGInvitrogenCat. A21422Goat derived anti-mouse secondary antibody
automated cell counterBio-RadCat. No. TC20
CELLBANKERZENOGEN PHARMACat. 11910Cell freezing medium
collagen type ISigmaCat. No. 08-115
Complete ES Cell MediumMilliporeCat. No. ES-101-B
DAPIInvitrogenCat. 10184322
Dulbecco’s Modified Eagle Medium GibcoCat. 11971025
Fetal Bovine serumGibcoCat. 10270106
fluorescence microscopeKeyenceCat. No. BZ-X700
Fluoresent labelled HAPG ResearchFAHA-H2
Glas bottom dishIwakiCat. 11-0602
glutaldehydeSigmaCat. No. G5882
MatrigelFisherCat. No. CB-40234The basement-membrane matrix
monoclonal anti-vinculin antibodySigmaCat. No. V9264
mounting mediaDakoS3023
Normal goat serumFisherCat. 50062Z
O9-1 cellsMilliporeCat. No. SCC049
ParaformaldehydeSigmaCat. 158127
triethoxysilaneSigmaCat. No. 390143
trypsin-EDTAMilliporeCat. No. SM-2003-C

References

  1. Bhatt, S., Diaz, R., Trainor, P. A. Signals and switches in mammalian neural crest cell differentiation. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (2), 008326 (2013).
  2. Casini, P., Nardi, I., Ori, M. Hyaluronan is required for cranial neural crest cells migration and craniofacial development. Developmental Dynamics. 241 (2), 294-302 (2012).
  3. Landolt, R. M., Vaughan, L., Winterhalter, K. H., Zimmermann, D. R. Versican is selectively expressed in embryonic tissues that act as barriers to neural crest cell migration and axon outgrowth. Development. 121 (8), 2303-2312 (1995).
  4. Camenisch, T. D., et al. Disruption of hyaluronan synthase-2 abrogates normal cardiac morphogenesis and hyaluronan-mediated transformation of epithelium to mesenchyme. Journal of Clinical Investigation. 106 (3), 349-360 (2000).
  5. Camenisch, T. D., Schroeder, J. A., Bradley, J., Klewer, S. E., McDonald, J. A. Heart-valve mesenchyme formation is dependent on hyaluronan-augmented activation of ErbB2-ErbB3 receptors. Nature Medicine. 8 (8), 850-855 (2002).
  6. Lan, Y., Qin, C., Jiang, R. Requirement of hyaluronan synthase-2 in craniofacial and palate development. Journal of Dental Research. 98 (12), 1367-1375 (2019).
  7. Irie, F., et al. The cell surface hyaluronidase TMEM2 regulates cell adhesion and migration via degradation of hyaluronan at focal adhesion sites. Journal of Biological Chemistry. 296, 100481 (2021).
  8. Yamamoto, H., et al. A mammalian homolog of the zebrafish transmembrane protein 2 (TMEM2) is the long-sought-after cell-surface hyaluronidase. Journal of Biological Chemistry. 292 (18), 7304-7313 (2017).
  9. Inubushi, T., et al. The cell surface hyaluronidase TMEM2 plays an essential role in mouse neural crest cell development and survival. PLoS Genetics. 18 (7), 1009765 (2022).
  10. Justus, C. R., Leffler, N., Ruiz-Echevarria, M., Yang, L. V. In vitro cell migration and invasion assays. Journal of Visualized Experiments. (88), e51046 (2014).
  11. Pijuan, J., et al. Cell migration, invasion, and adhesion assays: From cell imaging to data analysis. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7, 107 (2019).
  12. Ishii, M., et al. A stable cranial neural crest cell line from mouse. Stem Cells and Development. 21 (17), 3069-3080 (2012).
  13. Nguyen, B. H., Ishii, M., Maxson, R. E., Wang, J. Culturing and manipulation of O9-1 neural crest cells. Journal of Visualized Experiments. (140), e58346 (2018).
  14. Humphries, J. D., et al. Vinculin controls focal adhesion formation by direct interactions with talin and actin. Journal of Cell Biology. 179 (5), 1043-1057 (2007).
  15. Perris, R., Perissinotto, D. Role of the extracellular matrix during neural crest cell migration. Mechanisms of Development. 95 (1-22), 3-21 (2000).
  16. Perris, R., et al. Spatial and temporal changes in the distribution of proteoglycans during avian neural crest development. Development. 111 (2), 583-599 (1991).
  17. Zagris, N., Gilipathi, K., Soulintzi, N., Konstantopoulos, K. Decorin developmental expression and function in the early avian embryo. The International Journal of Developmental Biology. 55 (6), 633-639 (2011).
  18. Perris, R., Paulsson, M., Bronner-Fraser, M. Molecular mechanisms of avian neural crest cell migration on fibronectin and laminin. Developmental Biology. 136 (1), 222-238 (1989).
  19. Chevalier, N. R., et al. How tissue mechanical properties affect enteric neural crest cell migration. Scientific Reports. 6, 20927 (2016).
  20. Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8 (10), 839-845 (2007).
  21. Griffith, L. G., Swartz, M. A. Capturing complex 3D tissue physiology in vitro. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7 (3), 211-224 (2006).
  22. Jonkman, J. E., et al. An introduction to the wound healing assay using live-cell microscopy. Cell Adhesion and Migration. 8 (5), 440-451 (2014).
  23. Davis, P. K., Ho, A., Dowdy, S. F. Biological methods for cell-cycle synchronization of mammalian cells. Biotechniques. 30 (6), 1322-1331 (2001).
  24. Wayner, E. A., Garcia-Pardo, A., Humphries, M. J., McDonald, J. A., Carter, W. G. Identification and characterization of the T lymphocyte adhesion receptor for an alternative cell attachment domain (CS-1) in plasma fibronectin. Journal of Cell Biology. 109 (3), 1321-1330 (1989).
  25. Robert, G. A., et al. Molecular structure of 3-aminopropyltriethoxysilane layers formed on silanol-terminated silicon surfaces. The Journal of Physical Chemistry. 116 (10), 6289-6297 (2012).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

JoVE 192

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved