体外 富含透明质酸的细胞外基质对神经嵴细胞迁移的影响研究

摘要

该协议概述了适用于参与神经嵴细胞体内迁移到富含透明质的细胞外基质的分子的功能分析的体外迁移实验。

摘要

神经嵴细胞（NCC）是起源于神经管背侧区域的高度迁移细胞。NCC从神经管迁移是NCC产生及其随后向靶位点迁移的重要过程。NCC的迁移途径，包括周围的神经管组织，涉及富含透明质酸（HA）的细胞外基质。为了模拟NCC从神经管迁移到这些富含HA的周围组织中，本研究建立了由HA（平均分子量:1，200-1，400 kDa）和I型胶原蛋白（Col1）组成的混合底物迁移测定。该迁移测定表明NCC细胞系O9-1细胞在混合基质上高度迁移，并且在迁移过程中HA涂层在粘附部位降解。该 体外 模型可用于进一步探索NCC迁移所涉及的机制基础。该协议也适用于评估不同的底物作为支架来研究NCC迁移。

引言

神经嵴细胞（NCC）是存在于发育中的胚胎中的多能细胞群，它们起源于神经形成过程中的神经板边界。它们有助于形成各种组织，包括周围神经系统、心血管系统、颅面组织和骨骼¹。在神经板边界处诱导和NCC规范后，NCC从神经上皮迁移并迁移到NCC来源的组织部位¹。

透明质酸（HA）是一种非硫酸化糖胺聚糖，作为细胞外基质（ECM）的组分分布在各种组织中。HA在胚胎发育中的重要性已在模型系统中通过消融负责透明质酸代谢的基因得到证实。例如，发现非洲爪蟾中透明质酸合酶基因（Has1和Has2）的突变会导致NCC迁移缺陷和颅面畸形²。此外，据报道，HA结合蛋白聚糖，聚集聚糖和保全糖对NCC迁移发挥抑制作用³。在小鼠中，Has2消融导致心内膜垫形成的严重缺陷，导致妊娠中期（E9.5-10）致死率⁴，^5，6。

跨膜蛋白 2 （Tmem2） 是一种细胞表面透明质酸酶，最近已被证明通过去除粘附位点⁷，⁸ 处的基质相关 HA^，在促进整合素介导的癌细胞粘附和迁移中发挥关键作用。最近，Inubushi等人^9证明，由于NCC迁移/迁移和存活的异常，Tmem2的缺乏会导致严重的颅面缺陷。在先前的研究⁹中，分析了NCC形成和迁移过程中Tmem2的表达。在NCC分层部位和迁移的Sox9阳性NCC中观察到Tmem2表达（图1）。此外，使用Tmem2耗尽的小鼠O9-1神经嵴细胞，研究表明Tmem2的体外表达对于O9-1细胞形成粘附并迁移到含HA的底物中至关重要（图2和图3）⁹。

这些结果强烈表明，Tmem2对于NCC通过富含HA的ECM的粘附和迁移也很重要。然而，富含HA的ECM中NCC粘附和迁移的分子机制尚不清楚。因此，有必要建立一个 体外 培养实验系统，以充分探索富含HA的ECM中的NCC粘附和迁移。

在测试细胞迁移的众多方法中，基于细胞伤口闭合的测定是生理学和肿瘤学领域经常使用的简单方法¹⁰。这种方法是有用的，因为它与 体内 表型相关，并且有效地确定药物和化学引诱剂在细胞迁移中的作用¹¹。可以通过测量随时间变化的细胞间隙距离来评估整个细胞质量和单个细胞的迁移能力¹¹。在本手稿中，介绍了 一种改良的 基于体外伤口闭合的测定法，以模拟NCC迁移到神经管周围富含HA的组织中。该程序也适用于研究不同的ECM成分（即胶原蛋白，纤连蛋白和层粘连蛋白），以分析ECM支架在NCC迁移中的作用。

研究方案

所有程序均由大阪大学牙科研究生院动物伦理委员会批准。

1. 小鼠颅神经嵴细胞培养

注意:本研究中使用的神经嵴细胞系包括O9-1细胞，最初来源于Wnt1-Cre;从E8.5小鼠胚胎¹²中分离出表达R26R-GFP的细胞（见讨论）。这里描述的用于培养O9-1细胞的方法遵循先前建立的方案¹³。

1. 准备基底膜基质包被板。
   1. 在冰上解冻基底膜基质（见 材料表）。在冷藏的1x PBS中以1:50稀释基质，并保持在冰上。
   2. 用 10 mL 稀释的基底膜基质溶液涂覆 10 cm 培养板。将板在室温下孵育1小时，并在使用前吸出基质。
   3. 用 2 mL PBS 清洗板 3 次。
2. 在基底膜基质包被的板上培养O9-1细胞。
   1. 在37°C的水浴中加热完整的胚胎干（ES）细胞培养基（参见 材料表）。
   2. 轻轻混合O9-1细胞悬液（参见材料表）并使用自动细胞计数器计数细胞数量（参见材料表）。用完整的ES细胞培养基将细胞浓度调节至1.1×10^{6 /} mL。
   3. 将 8 mL 预热的完整 ES 细胞培养基加入基质包被的 10 cm 培养板中，并以 1.1 x 10 6 细胞/板接种 O9-1^细胞。 在37°C下在5%CO₂ 加湿培养箱中孵育。
   4. 第二天，用新鲜的完全ES细胞培养基（预热至37°C）替换培养基。此后每 2-3 天更换一次新鲜培养基。
      注意:当细胞约80%汇合（接种后3-4天）时，可以用0.25%胰蛋白酶-EDTA解离并进一步传代或冷冻以备后用。O9-1细胞的代表性图像如图 1所示。
   5. 在胰蛋白酶消化之前，用 2 mL 的 1x PBS 洗涤培养板。加入2mL预热的0.25%胰蛋白酶-EDTA，并在37°C下孵育5分钟。 检查细胞是否完全脱离;如有必要，轻轻拍打盘子的侧面几次。
   6. 向培养板中加入 2 mL 预热的完整 ES 细胞培养基，并将解离的细胞转移到 15 mL 锥形管中。将试管以300× g 离心5分钟。
   7. 在不干扰细胞沉淀的情况下弃去上清液。然后，向管中加入 2 mL 预热的完整 ES 细胞培养基，并通过移液彻底重悬细胞。将细胞接种到所需细胞密度的新培养板上。
   8. 或者，通过在管中加入 1 mL 含有 10% 二甲基亚砜 （DMSO） 的细胞冷冻培养基代替完整的 ES 细胞培养基并彻底重悬细胞来制备冷冻细胞原液。将细胞悬液转移到冷冻管中，并储存在-80°C。

2. HA/Col1涂层培养皿的制备

注意:将HA / Col1涂覆到玻璃底培养皿上的原始方法是由Irie等人^{提出的7。}

1. 小心地将 50 μL 未稀释的三乙氧基硅烷加入 3.5 cm 玻璃底培养皿中（参见 材料表）。在室温（RT）下孵育5分钟并避光。
   注意:用三乙氧基硅烷孵育不应超过5分钟。这可能会影响涂层效率并产生不良产品。
2. 用 2 mL 蒸馏水快速清洗盘子 3 次。每皿加入 50 μL 0.25% 戊二醛，在 PBS 中稀释 100 倍，并在室温下孵育 30 分钟。
3. 用 2 mL PBS 快速洗涤 4 次。然后，在室温下用 300 μL I 型胶原蛋白在 0.2 N 乙酸中涂覆培养皿 1 小时。
4. 用 2 mL PBS 快速洗涤 3 次。向每个培养皿中加入 300 μL 200 μg/mL 荧光素标记的透明质酸钠-H2 （FAHA-H2）（在 PBS 中稀释），并在室温下孵育过夜。 用 2 mL PBS 再次洗涤 3 次。吸出PBS后，在干净的工作台上风干板5分钟。
   注意:FAHA-H2是一种荧光素标记的透明质酸钠，平均分子量范围为1，200-1，600 KDa。可以根据研究设计使用适当分子量的HA。

3. HA/Col1 包被培养皿上的迁移测定

注意:使用2孔培养插入物在Col1 / HA底物中使用定义的500μm无细胞间隙进行基于伤口闭合的测定（参见 材料表）。O9-1细胞表达Tmem2，这是细胞外空间⁹ 中HA粘附和降解所必需的（图2 和 图3）。

1. 干燥涂层玻璃底培养皿后，将 2 孔培养插入物连接到培养皿上，并在外部填充 1 mL PBS 的插入物。
2. 将 O9-1 细胞接种到孔中，在 100 μL Dulbecco 的改良 Eagle 培养基 （DMEM） 中，每次插入物含有 2% 胎牛血清 （FBS）。将细胞在37°C下在5%CO 2加湿培养箱中培养₂天。
3. 用镊子小心地从涂层玻璃底培养皿中取出插入物。用 2 mL 的 1x PBS 轻轻清洗涂有涂层的玻璃底培养皿，以去除细胞和细胞碎片。将 2 mL 含有 2% FBS 的新鲜 DMEM 加入培养皿中。
4. 现在，使用具有高分辨率设置（增益为6 dB，无合并）的单色模式下的一体化荧光显微镜捕获相衬图像作为起始时间点。本研究使用放大倍率为4倍至20倍的物镜进行成像（见 材料表）。
   注意:使用相应的比例尺捕获相衬图像并将其保存为TIFF格式。
5. 将细胞在37°C和5%CO₂下再培养48小时。使用多合一荧光显微镜在培养物中捕获24小时和48小时的相衬图像。
6. 在室温下用1mL的4%多聚甲醛（PFA）固定细胞48小时15分钟或在4°C下过夜。 然后，用 1 mL 新鲜 PBS 清洗餐具 3 次，每次 5 分钟。
7. 将盖玻片与安装介质（见 材料表）放在一起进行进一步的形态观察。
   注意:培养皿可以立即成像或在4°C下储存长达2个月。
8. 可选:对感兴趣的蛋白质细胞进行免疫标记。
   注意:此处以使用小鼠来源的单克隆抗黏着蛋白抗体（参见 材料表）检测粘连（FA）复合物的方案为例进行描述。
   1. 将培养皿（来自步骤3.6）与0.5mL封闭缓冲液（PBS中的5%正常山羊血清）孵育60分钟。
      注意:为一抗选择合适的封闭缓冲液。典型的封闭缓冲液是来自与所用二抗相同物种的 5% 正常血清。
   2. 在抗体稀释缓冲液（PBS中的1%正常山羊血清）中制备稀释的一抗。将培养皿与0.5mL稀释的一抗在4°C孵育过夜。
      注意:选择合适的抗体稀释缓冲液。通常，抗体以1:50-1:200稀释度使用。
   3. 用 2 mL PBS 冲洗 3 次，每次冲洗 5 分钟。在抗体稀释缓冲液（PBS中的1%正常山羊血清）中制备稀释的山羊来源的抗小鼠二抗。将培养皿与0.5mL稀释的二抗在室温下孵育1-3小时。
      注意:通常，二抗以1:500-1:1，000稀释度使用。DAPI可用于对细胞核进行染色。
   4. 用 2 mL PBS 冲洗 3 次，每次 5 分钟。将盖玻片与 50 μL 封片剂一起放置。
      注意:可以使用带有GFP滤光片（激发:470/40，发射:525/50）和TexasRed滤光片（激发:560/40，发射:630/75）的多合一荧光显微镜对培养皿进行成像，单色模式具有高分辨率设置（增益为6 dB，无合并）。本研究使用放大倍率为4倍至20倍的物镜进行成像。
      注意:载玻片可在4°C下保存长达2个月。

4. 数据分析

1. 打开 ImageJ 1.51s 软件。在 ImageJ 窗口中，从菜单栏中选择"文件>打开"以打开保存的图像文件。
2. 要设置测量刻度，请绘制一条与比例尺距离相同的线。转到 分析>设置 比例，然后在 设置比例 窗口的相应框中键入线的已知距离和单位。
3. 在单元格间隙之间绘制一条直线，然后按 "分析>度量 "将值传输到数据窗口。测量每个样本中至少五个不同的位置，并平均距离以获得具有代表性的样本数据。使用适当的软件进行统计分析（见 材料表）。

结果

使用此处描述的方案在由Col1和高分子量HA（平均分子量:1，200-1，400kDa）组成的混合底物上进行迁移测定。发现间隙边界处的O9-1细胞很容易迁移到富含HA的间隙中（图4）。FA标志物（长春斑蛋白¹⁴）的免疫染色证实，O9-1细胞在HA降解部位形成局灶粘附（FA）（图5）。

讨论

各种 ECM 组件规范 NCC 迁移/迁移。例如，HA积极调节NCC迁移^2，15。有趣的是，一项基于细胞表面透明质酸酶Tmem2的遗传小鼠模型的研究阐明了NCC迁移^中HA降解的要求9。神经管周围的ECM中也含有丰富的胶原蛋白¹⁶。Decorin是一种富含亮氨酸的小蛋白聚糖，已被证明可以在神经发育过程中调节NCC迁移¹⁷。其他...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
10cm cell culture dish	CORNING	Cat. 353003
1X PBS	Millipore	Cat. No. BSS-1005-B
2-well culture inserts	ibidi	Cat. No. 80209
Alexa 555-labelled goat anti-mouse IgG	Invitrogen	Cat. A21422	Goat derived anti-mouse secondary antibody
automated cell counter	Bio-Rad	Cat. No. TC20
CELLBANKER	ZENOGEN PHARMA	Cat. 11910	Cell freezing medium
collagen type I	Sigma	Cat. No. 08-115
Complete ES Cell Medium	Millipore	Cat. No. ES-101-B
DAPI	Invitrogen	Cat. 10184322
Dulbecco’s Modified Eagle Medium	Gibco	Cat. 11971025
Fetal Bovine serum	Gibco	Cat. 10270106
fluorescence microscope	Keyence	Cat. No. BZ-X700
Fluoresent labelled HA	PG Research	FAHA-H2
Glas bottom dish	Iwaki	Cat. 11-0602
glutaldehyde	Sigma	Cat. No. G5882
Matrigel	Fisher	Cat. No. CB-40234	The basement-membrane matrix
monoclonal anti-vinculin antibody	Sigma	Cat. No. V9264
mounting media	Dako	S3023
Normal goat serum	Fisher	Cat. 50062Z
O9-1 cells	Millipore	Cat. No. SCC049
Paraformaldehyde	Sigma	Cat. 158127
triethoxysilane	Sigma	Cat. No. 390143
trypsin-EDTA	Millipore	Cat. No. SM-2003-C