In vitro Studio degli effetti della matrice extracellulare ricca di ialuronana sulla migrazione delle cellule della cresta neurale

Riepilogo

Questo protocollo delinea un esperimento di migrazione in vitro adatto all'analisi funzionale delle molecole coinvolte nella migrazione in vivo delle cellule della cresta neurale nella matrice extracellulare ricca di ialuronano.

Abstract

Le cellule della cresta neurale (NCC) sono cellule altamente migratorie che provengono dalla regione dorsale del tubo neurale. L'emigrazione di NCC dal tubo neurale è un processo essenziale per la produzione di NCC e la loro successiva migrazione verso siti bersaglio. La via migratoria delle NCC, compresi i tessuti del tubo neurale circostante, coinvolge la matrice extracellulare ricca di acido ialuronico (HA). Per modellare la migrazione NCC in questi tessuti circostanti ricchi di HA dal tubo neurale, in questo studio è stato stabilito un saggio di migrazione del substrato misto costituito da HA (peso molecolare medio: 1.200-1.400 kDa) e collagene di tipo I (Col1). Questo test di migrazione dimostra che le cellule della linea cellulare NCC, O9-1, sono altamente migratorie sul substrato misto e che il rivestimento HA è degradato nel sito di aderenze focali nel corso della migrazione. Questo modello in vitro può essere utile per un'ulteriore esplorazione delle basi meccanicistiche coinvolte nella migrazione NCC. Questo protocollo è applicabile anche per valutare diversi substrati come scaffold per studiare la migrazione NCC.

Introduzione

Le cellule della cresta neurale (NCC) sono una popolazione cellulare multipotente presente negli embrioni in via di sviluppo e provengono dal bordo della piastra neurale durante la neurulazione. Contribuiscono alla formazione di una varietà di tessuti, tra cui il sistema nervoso periferico, il sistema cardiovascolare, i tessuti craniofacciali e lo scheletro¹. Dopo l'induzione e la specifica NCC al bordo della piastra neurale, gli NCC emigrano dal neuroepitelio e migrano verso i siti tissutali derivati da NCC¹.

L'acido ialuronico (HA) è un glicosaminoglicano non solfato distribuito in una varietà di tessuti come componente della matrice extracellulare (ECM). L'importanza dell'HA nello sviluppo embrionale è stata dimostrata in sistemi modello attraverso l'ablazione di geni responsabili del metabolismo ialuronico. Ad esempio, le mutazioni nei geni della sinalunosi ialuronica (Has1 e Has2) in Xenopus sono state trovate per portare a difetti di migrazione NCC e malformazione craniofacciale². Inoltre, è stato riportato che i proteoglicani leganti l'HA, aggrecan e versican, esercitano effetti inibitori sulla migrazione degli NCC³. Nei topi, l'ablazione Has2 porta a gravi difetti nella formazione del cuscino endocardico, con conseguente letalità a metà gestazione (E9.5-10) ^4,5,6.

La proteina transmembrana 2 (Tmem2), una ialuronidasi della superficie cellulare, ha recentemente dimostrato di svolgere un ruolo critico nel promuovere l'adesione e la migrazione delle cellule tumorali mediate da integrina rimuovendo l'HA associato alla matrice nei siti di adesione ^7,8. Più recentemente, Inubushi et ^al.9 hanno dimostrato che una carenza di Tmem2 porta a gravi difetti craniofacciali dovuti ad anomalie nell'emigrazione/migrazione e sopravvivenza delle NCC. Nel precedente studio⁹, l'espressione di Tmem2 è stata analizzata durante la formazione e la migrazione di NCC. L'espressione di Tmem2 è stata osservata nel sito di delaminazione delle NCC e nelle NCC Sox9-positive emigrate (Figura 1). Inoltre, utilizzando cellule della cresta neurale O9-1 di topo impoverite di Tmem2, lo studio ha dimostrato che l'espressione in vitro di Tmem2 era essenziale per le cellule O9-1 per formare aderenze focali e per la loro migrazione in substrati contenenti HA (Figura 2 e Figura 3)⁹.

Questi risultati indicano fortemente che Tmem2 è importante anche per l'adesione e la migrazione di NCC attraverso l'ECM ricco di HA. Tuttavia, il meccanismo molecolare di adesione e migrazione degli NCC all'interno della ECM ricca di HA non è ancora chiaro. È quindi necessario stabilire un sistema sperimentale di coltura in vitro per esplorare appieno l'adesione e la migrazione di NCC all'interno dell'ECM ricco di HA.

Tra i numerosi approcci impiegati nel testare la migrazione cellulare, il test basato sulla chiusura della ferita cellulare è un metodo semplice frequentemente utilizzato nei campi della fisiologia e dell'oncologia¹⁰. Questo approccio è utile per la sua rilevanza per il fenotipo in vivo ed è efficace nel determinare i ruoli di farmaci e chemioattrattanti durante la migrazione cellulare¹¹. È possibile valutare la capacità di migrazione sia delle masse cellulari intere che delle singole cellule misurando le distanze del gap cellulare nel tempo¹¹. In questo manoscritto, viene introdotto un saggio modificato in vitro basato sulla chiusura della ferita per modellare la migrazione NCC nei tessuti ricchi di HA che circondano il tubo neurale. Questa procedura è applicabile anche per lo studio di diversi componenti della ECM (cioè collagene, fibronectina e laminina) per analizzare il ruolo dello scaffold ECM nella migrazione NCC.

Protocollo

Tutte le procedure sono state approvate dal Comitato etico animale della Scuola di specializzazione in odontoiatria dell'Università di Osaka.

1. Coltura di cellule della cresta neurale cranica di topo

NOTA: La linea cellulare della cresta neurale utilizzata in questo studio comprende cellule O9-1, originariamente derivate da Wnt1-Cre; Cellule che esprimono R26R-GFP isolate da embrioni di topo E8.5¹² (vedi discussione). Il metodo qui descritto per la coltura di cellule O9-1 segue un protocollo¹³ precedentemente stabilito.

1. Preparare la piastra rivestita con matrice di membrana basale.
   1. Scongelare la matrice della membrana basale (vedi Tabella dei materiali) sul ghiaccio. Diluire la matrice 1:50 in 1x PBS refrigerato e mantenere in ghiaccio.
   2. Rivestire una piastra di coltura di 10 cm con 10 ml della soluzione di matrice a membrana basale diluita. Incubare la piastra a temperatura ambiente per 1 ora e aspirare la matrice prima dell'uso.
   3. Lavare la piastra 3x con 2 ml di PBS.
2. Cellule di coltura O9-1 sulla piastra rivestita di matrice della membrana basale.
   1. Riscaldare il mezzo completo delle cellule staminali embrionali (ES) (vedi Tabella dei materiali) a bagnomaria a 37 °C.
   2. Mescolare delicatamente la sospensione di celle O9-1 (vedere Tabella dei materiali) e contare il numero di celle utilizzando un contatore automatico delle celle (vedere Tabella dei materiali). Regolare la concentrazione cellulare a 1,1 × 10⁶/mL con mezzo cellulare ES completo.
   3. Aggiungere 8 ml di mezzo di cella ES completo preriscaldato alla piastra di coltura da 10 cm rivestita di matrice e seminare le cellule O9-1 a 1,1 x 10⁶ celle/piastra. Incubare a 37 °C in un incubatore umidificato al 5% di CO₂ .
   4. Il giorno successivo, sostituire il mezzo con un mezzo di cella ES completo fresco (preriscaldato a 37 °C). Sostituire con terreno fresco ogni 2-3 giorni successivi.
      NOTA: Quando le cellule sono circa l'80% confluenti (3-4 giorni dopo la placcatura), possono essere dissociate con tripsina-EDTA allo 0,25% e fatte passare ulteriormente o congelate per un uso successivo. Le immagini rappresentative delle cellule O9-1 sono mostrate nella Figura 1.
   5. Lavare la piastra di coltura con 2 ml di 1x PBS prima della tripsinizzazione. Aggiungere 2 mL di tripsina-EDTA preriscaldata allo 0,25% e incubare per 5 minuti a 37 °C. Verificare il distacco completo della cellula; Picchiettare delicatamente il lato del piatto un paio di volte, se necessario.
   6. Aggiungere 2 ml di mezzo di cellule ES complete preriscaldate alla piastra di coltura e trasferire le cellule dissociate in un tubo conico da 15 ml. Centrifugare il tubo a 300 x g per 5 min.
   7. Scartare il surnatante senza disturbare il pellet cellulare. Quindi, aggiungere 2 ml di mezzo di cella ES completo preriscaldato al tubo e risospendere completamente le celle mediante pipettaggio. Seminare le cellule su una nuova piastra di coltura alla densità cellulare desiderata.
   8. In alternativa, preparare uno stock di cellule congelate aggiungendo 1 mL di mezzo di congelamento cellulare contenente il 10% di dimetilsolfossido (DMSO) al tubo al posto del mezzo completo di cellule ES e riassorbendo accuratamente le cellule. Trasferire la sospensione cellulare in tubi criogenici e conservare a -80 °C.

2. Preparazione del piatto rivestito HA/Col1

NOTA: Il metodo originale di rivestimento HA / Col1 su piatti con fondo di vetro è stato proposto da Irie et ^al.7.

1. Aggiungere con cautela 50 μL di trietossisilano non diluito in una teglia con fondo di vetro di 3,5 cm (vedere Tabella dei materiali). Incubare per 5 minuti a temperatura ambiente (RT) e proteggere dalla luce.
   NOTA: L'incubazione con trietossisilano non deve superare i 5 minuti. Ciò può influire sull'efficienza del rivestimento e produrre prodotti indesiderati.
2. Lavare rapidamente il piatto 3 volte con 2 ml di acqua distillata. Aggiungere 50 μL di glutaraldeide allo 0,25%, diluito 100x in PBS, per piatto, e incubare a RT per 30 minuti.
3. Lavare rapidamente 4 volte con 2 ml di PBS. Quindi, rivestire i piatti con 300 μL di collagene di tipo I in acido acetico 0,2 N a RT per 1 ora.
4. Lavare rapidamente 3 volte con 2 ml di PBS. Aggiungere 300 μL di 200 μg/mL di ialuronato di sodio marcato con fluoresceinamina (FAHA-H2) (diluito in PBS) a ciascun piatto e incubare per una notte a RT. Lavare di nuovo 3 volte con 2 ml di PBS. Dopo aver aspirato il PBS, asciugare all'aria la piastra per 5 minuti su una panca pulita.
   NOTA: FAHA-H2 è uno ialuronato di sodio marcato con fluoresceinamina con un peso molecolare medio compreso tra 1.200 e 1.600 KDa. L'HA di un peso molecolare appropriato può essere utilizzato secondo il disegno di ricerca.

3. Saggio di migrazione sul piatto rivestito di HA/Col1

NOTA: Un saggio basato sulla chiusura della ferita utilizzando spazi definiti di 500 μm privi di cellule in substrati Col1/HA è stato eseguito utilizzando inserti di coltura a 2 pozzetti (vedere la tabella dei materiali). Le cellule O9-1 esprimono Tmem2, che è necessario per l'adesione e la degradazione dell'HA nello spazio extracellulare⁹ (Figura 2 e Figura 3).

1. Dopo aver asciugato il piatto con fondo di vetro rivestito, attaccare gli inserti di coltura a 2 pozzetti ai piatti e riempire gli inserti esternamente con 1 ml di PBS.
2. Seminare le cellule O9-1 nei pozzetti a 1 x 10⁴ cellule in 100 μL del mezzo Eagle modificato (DMEM) di Dulbecco contenente il 2% di siero fetale bovino (FBS) per inserto. Coltivare le cellule per 2 giorni a 37 °C in un incubatore umidificato al 5% di CO₂ .
3. Rimuovere accuratamente gli inserti dai piatti con fondo di vetro rivestito con una pinzetta. Lavare delicatamente i piatti con fondo di vetro rivestito con 2 ml di 1x PBS per rimuovere le cellule e i detriti cellulari. Aggiungere 2 ml di DMEM fresco contenente il 2% di FBS nei piatti di coltura.
4. Cattura immagini a contrasto di fase ora come punto di partenza utilizzando un microscopio a fluorescenza all-in-one in modalità monocromatica con impostazioni ad alta risoluzione (guadagno a 6 dB, nessun binning). In questo studio sono stati utilizzati obiettivi con ingrandimenti da 4x a 20x per l'imaging (vedere Tabella dei materiali).
   NOTA: Acquisire le immagini a contrasto di fase con le barre di scala corrispondenti e salvarle in formato TIFF.
5. Coltura delle cellule per ulteriori 48 ore a 37 °C e 5% di CO₂. Cattura immagini a contrasto di fase a 24 ore e 48 ore in coltura utilizzando il microscopio a fluorescenza all-in-one.
6. Fissare le cellule a 48 h con 1 mL di paraformaldeide (PFA) al 4% per 15 minuti a temperatura ambiente o per una notte a 4 °C. Quindi, lavare i piatti 3 volte per 5 minuti ciascuno con 1 ml di PBS fresco.
7. Posizionare un coprivetrino con supporto di montaggio (vedi Tabella dei materiali) per ulteriori osservazioni morfologiche.
   NOTA: Le stoviglie possono essere visualizzate immediatamente o conservate fino a 2 mesi a 4 °C.
8. Opzionale: Immunomarcare le cellule per le proteine di interesse.
   NOTA: Un protocollo per rilevare il complesso di adesione focale (FA) utilizzando un anticorpo monoclonale anti-vinculina derivato dal topo (vedere la tabella dei materiali) è descritto qui come esempio.
   1. Incubare i piatti (dal punto 3.6) con 0,5 ml di tampone bloccante (siero di capra normale al 5% in PBS) per 60 minuti.
      NOTA: scegliere un tampone di blocco appropriato per l'anticorpo primario. Un tipico tampone bloccante sarebbe il 5% di siero normale della stessa specie dell'anticorpo secondario utilizzato.
   2. Preparare l'anticorpo primario diluito nel tampone anticorpale di diluizione (siero di capra normale all'1% in PBS). Incubare i piatti con 0,5 mL di anticorpo primario diluito per una notte a 4 °C.
      NOTA: Scegliere il tampone di diluizione anticorpale appropriato. Tipicamente, l'anticorpo viene utilizzato ad una diluizione 1:50-1:200.
   3. Risciacquare 3 volte per 5 minuti ciascuno con 2 ml di PBS. Preparare l'anticorpo secondario diluito derivato dalla capra anti-topo nel tampone anticorpale di diluizione (siero di capra normale all'1% in PBS). Incubare i piatti con 0,5 ml di anticorpo secondario diluito per 1-3 ore a temperatura ambiente.
      NOTA: Tipicamente, l'anticorpo secondario viene utilizzato ad una diluizione 1:500-1:1.000. DAPI può essere utilizzato per colorare i nuclei.
   4. Risciacquare 3 volte con 2 ml di PBS per 5 minuti ogni volta. Posizionare il coprislip con 50 μL di supporto di montaggio.
      NOTA: Le immagini possono essere visualizzate utilizzando il microscopio a fluorescenza all-in-one con un filtro GFP (eccitazione: 470/40, emissione: 525/50) e un filtro TexasRed (eccitazione: 560/40, emissione: 630/75) in modalità monocromatica con impostazioni ad alta risoluzione (guadagno a 6 dB, nessun binning). In questo studio sono stati utilizzati obiettivi con ingrandimenti da 4x a 20x.
      NOTA: Il vetrino può essere conservato fino a 2 mesi a 4 °C.

4. Analisi dei dati

1. Aprire il software ImageJ 1.51s. Nella finestra ImageJ, selezionare File > Apri dalla barra dei menu per aprire il file di immagine salvato.
2. Per impostare la scala di misurazione, tracciare una linea della stessa distanza della barra della scala. Vai a Analizza > Imposta scala e digita la distanza nota e le unità della linea nelle caselle appropriate della finestra Imposta scala .
3. Tracciare una linea retta tra lo spazio tra le celle e premere Analizza > Misura per trasferire i valori in una finestra dati. Misurare almeno cinque posizioni diverse in ciascun campione e calcolare la media delle distanze per ottenere i dati rappresentativi del campione. Eseguire le analisi statistiche utilizzando software appropriati (vedi Tabella dei Materiali).

Risultati

Un saggio di migrazione è stato eseguito su substrati misti composti da Col1 e HA ad alto peso molecolare (peso molecolare medio: 1.200-1.400 kDa) utilizzando il protocollo qui descritto. Si è scoperto che le cellule O9-1 al confine del gap migrano facilmente nel gap ricco di HA (Figura 4). L'immunocolorazione per un marcatore FA, la vinculina¹⁴, ha confermato che le cellule O9-1 formavano aderenze focali (FA) nei siti di degradazione dell'HA (F...

Discussione

Diverse componenti dell'ECM regolano l'emigrazione/migrazione dei NCC. Ad esempio, l'HA regola positivamente la migrazione NCC ^2,15. È interessante notare che uno studio basato su modelli genetici murini di Tmem2, una ialuronidasi della superficie cellulare, ha chiarito il requisito della degradazione dell'HA nella migrazione NCC⁹. I collageni sono anche abbondanti nella ECM che circonda il tubo neurale¹⁶. Decorin,...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
10cm cell culture dish	CORNING	Cat. 353003
1X PBS	Millipore	Cat. No. BSS-1005-B
2-well culture inserts	ibidi	Cat. No. 80209
Alexa 555-labelled goat anti-mouse IgG	Invitrogen	Cat. A21422	Goat derived anti-mouse secondary antibody
automated cell counter	Bio-Rad	Cat. No. TC20
CELLBANKER	ZENOGEN PHARMA	Cat. 11910	Cell freezing medium
collagen type I	Sigma	Cat. No. 08-115
Complete ES Cell Medium	Millipore	Cat. No. ES-101-B
DAPI	Invitrogen	Cat. 10184322
Dulbecco’s Modified Eagle Medium	Gibco	Cat. 11971025
Fetal Bovine serum	Gibco	Cat. 10270106
fluorescence microscope	Keyence	Cat. No. BZ-X700
Fluoresent labelled HA	PG Research	FAHA-H2
Glas bottom dish	Iwaki	Cat. 11-0602
glutaldehyde	Sigma	Cat. No. G5882
Matrigel	Fisher	Cat. No. CB-40234	The basement-membrane matrix
monoclonal anti-vinculin antibody	Sigma	Cat. No. V9264
mounting media	Dako	S3023
Normal goat serum	Fisher	Cat. 50062Z
O9-1 cells	Millipore	Cat. No. SCC049
Paraformaldehyde	Sigma	Cat. 158127
triethoxysilane	Sigma	Cat. No. 390143
trypsin-EDTA	Millipore	Cat. No. SM-2003-C