In vitro Investigación de los efectos de la matriz extracelular rica en hialuronanos en la migración de células de cresta neural

Resumen

Este protocolo describe un experimento de migración in vitro adecuado para el análisis funcional de las moléculas involucradas en la migración in vivo de las células de la cresta neural a la matriz extracelular rica en hialuronano.

Resumen

Las células de la cresta neural (NCC) son células altamente migratorias que se originan en la región dorsal del tubo neural. La emigración de NCC desde el tubo neural es un proceso esencial para la producción de NCC y su posterior migración hacia los sitios objetivo. La ruta migratoria de los NCC, incluidos los tejidos del tubo neural circundantes, involucra una matriz extracelular rica en hialuronano (HA). Para modelar la migración de NCC en estos tejidos circundantes ricos en HA desde el tubo neural, se estableció en este estudio un ensayo de migración de sustrato mixto que consiste en HA (peso molecular promedio: 1,200-1,400 kDa) y colágeno tipo I (Col1). Este ensayo de migración demuestra que las células de línea celular NCC, O9-1, son altamente migratorias en el sustrato mixto y que el recubrimiento de HA se degrada en el sitio de adherencias focales en el curso de la migración. Este modelo in vitro puede ser útil para una mayor exploración de la base mecanicista involucrada en la migración de NCC. Este protocolo también es aplicable para evaluar diferentes sustratos como andamios para estudiar la migración de NCC.

Introducción

Las células de la cresta neural (NCC) son una población celular multipotente que está presente en los embriones en desarrollo, y se originan en el borde de la placa neural durante la neurulación. Contribuyen a la formación de una variedad de tejidos, incluyendo el sistema nervioso periférico, el sistema cardiovascular, los tejidos craneofaciales y el esqueleto¹. Después de la inducción y la especificación de NCC en el borde de la placa neural, los NCC emigran del neuroepitelio y migran hacia los sitios de tejido derivados de NCC¹.

El hialuronano (HA) es un glicosaminoglicano no sulfatado que se distribuye en una variedad de tejidos como un componente de la matriz extracelular (ECM). La importancia de HA en el desarrollo embrionario se ha demostrado en sistemas modelo a través de la ablación de genes responsables del metabolismo de los hialuronanos. Por ejemplo, se encontró que las mutaciones en los genes de la hialuronano sintasa (Has1 y Has2) en Xenopus conducen a defectos de migración NCC y malformación craneofacial². Además, se ha informado que los proteoglicanos de unión a HA, agrecano y versicano, ejercen efectos inhibitorios sobre la migración de NCC³. En ratones, la ablación de Has2 conduce a defectos graves en la formación del cojín endocárdico, lo que resulta en la letalidad a mediados de la gestación (E9.5-10) ^4,5,6.

Se ha demostrado recientemente que la proteína transmembrana 2 (Tmem2), una hialuronidasa de superficie celular, desempeña un papel crítico en la promoción de la adhesión y migración de células cancerosas mediada por integrina mediante la eliminación de HA asociada a la matriz en los sitios de adhesión ^7,8. Más recientemente, Inubushi et ^al.9 demostraron que una deficiencia en Tmem2 conduce a defectos craneofaciales graves debido a anomalías en la emigración/migración y supervivencia de NCC. En el estudio anterior⁹, la expresión de Tmem2 se analizó durante la formación y migración de NCC. La expresión de Tmem2 se observó en el sitio de la delaminación de NCC y en la emigración de NCC positivos para Sox9 (Figura 1). Además, utilizando células de la cresta neural O9-1 de ratón sin Tmem2, el estudio demostró que la expresión in vitro de Tmem2 era esencial para que las células O9-1 formaran adherencias focales y para su migración a sustratos que contienen HA (Figura 2 y Figura 3)⁹.

Estos resultados indican fuertemente que Tmem2 también es importante para la adhesión y migración de NCC a través de la ECM rica en HA. Sin embargo, el mecanismo molecular de adhesión y migración de NCC dentro de la ECM rica en HA aún no está claro. Por lo tanto, es necesario establecer un sistema experimental de cultivo in vitro para explorar completamente la adhesión y migración de NCC dentro de la ECM rica en HA.

De los numerosos enfoques empleados en la prueba de la migración celular, el ensayo basado en el cierre de heridas celulares es un método simple utilizado con frecuencia en los campos de la fisiología y la oncología¹⁰. Este enfoque es útil debido a su relevancia para el fenotipo in vivo y es eficaz para determinar el papel de fármacos y quimioatrayentes durante la migración celular¹¹. Es posible evaluar la capacidad de migración tanto de masas celulares enteras como de células individuales midiendo las distancias de brecha celular a lo largo del tiempo¹¹. En este manuscrito, se introduce un ensayo modificado in vitro basado en el cierre de heridas para modelar la migración de NCC en tejidos ricos en HA que rodean el tubo neural. Este procedimiento también es aplicable para estudiar diferentes componentes de ECM (es decir, colágenos, fibronectina y laminina) para analizar el papel del andamio de ECM en la migración de NCC.

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Protocolo

Todos los procedimientos fueron aprobados por el Comité de Ética Animal de la Facultad de Odontología de la Universidad de Osaka.

1. Cultivo de células de la cresta neural craneal de ratón

NOTA: La línea celular de la cresta neural utilizada en este estudio comprende células O9-1, originalmente derivadas de Wnt1-Cre; Células que expresan R26R-GFP aisladas de embriones de ratón E8.5¹² (ver discusión). El método descrito aquí para el cultivo de células O9-1 sigue un protocolo previamente establecido¹³.

1. Prepare la placa recubierta de matriz de la membrana basal.
   1. Descongele la matriz de la membrana basal (ver Tabla de materiales) en hielo. Diluir la matriz 1:50 en 1x PBS refrigerado y mantener en hielo.
   2. Cubra una placa de cultivo de 10 cm con 10 ml de la solución de matriz de membrana basal diluida. Incubar la placa a temperatura ambiente durante 1 h y aspirar la matriz antes de usarla.
   3. Lave el plato 3 veces con 2 ml de PBS.
2. Cultive células O9-1 en la placa recubierta de matriz de la membrana basal.
   1. Calentar el medio de células madre embrionarias (ES) completo (ver Tabla de materiales) en un baño maría a 37 °C.
   2. Mezcle suavemente la suspensión de celdas O9-1 (consulte la Tabla de materiales) y cuente el número de celdas con un contador de celdas automatizado (consulte la Tabla de materiales). Ajustar la concentración celular a 1,1 × 10⁶/ml con un medio de células madre embrionarias completo.
   3. Agregue 8 ml de medio celular CE completo precalentado a la placa de cultivo de 10 cm recubierta de matriz y siembre las células O9-1 a 1.1 x 10⁶ células/placa. Incubar a 37 °C en una incubadora humidificada de_CO2 al 5%.
   4. Al día siguiente, sustituya el medio por un medio de células madre embrionarias completo fresco (precalentado a 37 °C). Reemplace con medio fresco cada 2-3 días a partir de entonces.
      NOTA: Cuando las células son aproximadamente 80% confluentes (3-4 días después de la placa), pueden disociarse con tripsina-EDTA al 0,25% y pasar más lejos o congelarse para su uso posterior. En la Figura 1 se muestran imágenes representativas de las células O9-1.
   5. Lave la placa de cultivo con 2 ml de 1x PBS antes de la tripsinización. Añadir 2 ml de tripsina-EDTA al 0,25% precalentada e incubar durante 5 min a 37 °C. Verifique el desprendimiento completo de células; Golpee suavemente el costado del plato un par de veces si es necesario.
   6. Agregue 2 ml de medio celular madre embrionaria completo precalentado a la placa de cultivo y transfiera las células disociadas a un tubo cónico de 15 ml. Centrifugar el tubo a 300 x g durante 5 min.
   7. Deseche el sobrenadante sin alterar la bolita celular. Luego, agregue 2 ml de medio celular ES completo precalentado al tubo y resuspenda completamente las células mediante pipeteo. Sembrar las células en una nueva placa de cultivo con la densidad celular deseada.
   8. Alternativamente, prepare un stock de células congeladas agregando 1 ml de medio de congelación celular que contenga 10% de dimetilsulfóxido (DMSO) al tubo en lugar de un medio celular ES completo y resuspendiendo completamente las células. Transfiera la suspensión celular a tubos criogénicos y guárdela a -80 °C.

2. Preparación del plato recubierto de HA/Col1

NOTA: El método original de recubrimiento de HA/Col1 sobre platos con fondo de vidrio fue propuesto por Irie et ^al.7.

1. Agregue cuidadosamente 50 μL de trietoxisilano sin diluir a un plato con fondo de vidrio de 3,5 cm (consulte la Tabla de materiales). Incubar durante 5 min a temperatura ambiente (RT) y proteger de la luz.
   NOTA: La incubación con trietoxisilano no debe exceder los 5 min. Esto puede afectar la eficiencia del recubrimiento y producir productos indeseables.
2. Lave el plato rápidamente 3 veces con 2 ml de agua destilada. Añadir 50 μL de glutaraldehído al 0,25%, diluido 100x en PBS, por plato, e incubar a RT durante 30 min.
3. Lavar rápidamente 4 veces con 2 ml de PBS. Luego, cubra los platos con 300 μL de colágeno tipo I en ácido acético 0.2 N a RT durante 1 h.
4. Lavar rápidamente 3 veces con 2 ml de PBS. Agregue 300 μL de hialuronato-H2 sódico marcado con fluorescemina (FAHA-H2) marcado con fluorescemina (diluido en PBS) a cada plato e incube durante la noche en RT. Lave nuevamente 3 veces con 2 ml de PBS. Después de aspirar el PBS, seque al aire la placa durante 5 minutos en un banco limpio.
   NOTA: FAHA-H2 es un hialuronato de sodio marcado con fluoresceinamina con un peso molecular promedio que oscila entre 1.200 y 1.600 KDa. Se puede utilizar HA de un peso molecular apropiado de acuerdo con el diseño de la investigación.

3. Ensayo de migración en el plato recubierto de HA/Col1

NOTA: Se realizó un ensayo basado en el cierre de heridas utilizando huecos definidos de 500 μm libres de células en sustratos de Col1/HA utilizando insertos de cultivo de 2 pocillos (ver Tabla de materiales). Las células O9-1 expresan Tmem2, que es necesario para la adhesión y degradación de HA en el espacio extracelular⁹ (Figura 2 y Figura 3).

1. Después de secar el plato con fondo de vidrio recubierto, adhiera los insertos de cultivo de 2 pocillos a los platos y llene los insertos externamente con 1 ml de PBS.
2. Sembrar las células O9-1 en los pocillos a 1 x 10⁴ células en 100 μL del medio Eagle modificado (DMEM) de Dulbecco que contiene 2% de suero fetal bovino (FBS) por inserto. Cultivar las células durante 2 días a 37 °C en una incubadora humidificada de_CO2 al 5%.
3. Retire las inserciones con cuidado de los platos recubiertos con fondo de vidrio con pinzas. Lave los platos recubiertos con fondo de vidrio suavemente con 2 ml de 1x PBS para eliminar las células y los desechos celulares. Agregue 2 ml de DMEM fresco que contenga 2% de FBS en los platos de cultivo.
4. Capture imágenes de contraste de fase ahora como punto de inicio utilizando un microscopio de fluorescencia todo en uno en modo monocromo con ajustes de alta resolución (ganancia a 6 dB, sin agrupación). En este estudio se utilizaron lentes objetivas con aumentos de 4x a 20x para obtener imágenes (ver Tabla de materiales).
   NOTA: Capture las imágenes de contraste de fase con las barras de escala correspondientes y guárdelas en formato TIFF.
5. Cultivar las células durante 48 h adicionales a 37 °C y 5% de_CO2. Capture imágenes de contraste de fase a las 24 h y 48 h en cultivo utilizando el microscopio de fluorescencia todo en uno.
6. Fijar las células a las 48 h con 1 ml de paraformaldehído al 4% (PFA) durante 15 min a temperatura ambiente o durante la noche a 4 °C. Luego, lave los platos 3 veces durante 5 minutos cada uno con 1 ml de PBS fresco.
7. Coloque un cubreobjetos con medio de montaje (ver Tabla de materiales) para una observación morfológica adicional.
   NOTA: Los platos pueden ser fotografiados inmediatamente o almacenados hasta 2 meses a 4 °C.
8. Opcional: Inmunomarcar las células en busca de proteínas de interés.
   NOTA: Aquí se describe como ejemplo un protocolo para detectar el complejo de adhesión focal (FA) utilizando un anticuerpo monoclonal antivinculina derivado del ratón (consulte la Tabla de materiales).
   1. Incubar los platos (a partir del paso 3.6) con 0,5 ml de tampón de bloqueo (5% de suero normal de cabra en PBS) durante 60 min.
      NOTA: Elija un tampón de bloqueo apropiado para el anticuerpo primario. Un tampón de bloqueo típico sería un 5% de suero normal de la misma especie que el anticuerpo secundario utilizado.
   2. Preparar el anticuerpo primario diluido en tampón de dilución de anticuerpos (suero de cabra normal al 1% en PBS). Incubar los platos con 0,5 ml de anticuerpo primario diluido durante la noche a 4 °C.
      NOTA: Elija el tampón de dilución de anticuerpos adecuado. Por lo general, el anticuerpo se usa en una dilución 1:50-1:200.
   3. Enjuague 3 veces durante 5 minutos cada una con 2 ml de PBS. Prepare el anticuerpo secundario anti-ratón derivado de cabra diluido en el tampón de dilución de anticuerpos (suero de cabra normal al 1% en PBS). Incubar los platos con 0,5 ml de anticuerpo secundario diluido durante 1-3 h a temperatura ambiente.
      NOTA: Normalmente, el anticuerpo secundario se utiliza en una dilución 1:500-1:1.000. DAPI se puede utilizar para teñir los núcleos.
   4. Enjuague 3 veces con 2 ml de PBS durante 5 minutos cada vez. Coloque el cubreobjetos con 50 μL de medio de montaje.
      NOTA: Las antenas se pueden visualizar utilizando el microscopio de fluorescencia todo en uno con un filtro GFP (excitación: 470/40, emisión: 525/50) y un filtro TexasRed (excitación: 560/40, emisión: 630/75) en modo monocromo con ajustes de alta resolución (ganancia a 6 dB, sin agrupación). En este estudio se utilizaron lentes objetivas con aumentos de 4x a 20x para la obtención de imágenes.
      NOTA: El portaobjetos puede almacenarse hasta 2 meses a 4 °C.

4. Análisis de datos

1. Abra el software ImageJ 1.51s. En la ventana ImageJ, seleccione Archivo > Abrir en la barra de menús para abrir el archivo de imagen guardado.
2. Para ajustar la escala de medición, dibuje una línea de la misma distancia que la barra de escala. Vaya a Analizar > Definir escala y escriba la distancia y las unidades conocidas de la línea en los cuadros correspondientes de la ventana Definir escala .
3. Dibuje una línea recta entre el espacio de celda y presione Analizar > Medir para transferir los valores a una ventana de datos. Mida al menos cinco posiciones diferentes en cada muestra y promedie las distancias para obtener los datos representativos de la muestra. Realice los análisis estadísticos utilizando el software apropiado (ver Tabla de materiales).

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Resultados

Se realizó un ensayo de migración en sustratos mixtos compuestos de Col1 y HA de alto peso molecular (peso molecular promedio: 1.200-1.400 kDa) utilizando el protocolo descrito aquí. Se encontró que las células de O9-1 en el límite de la brecha migran fácilmente a la brecha rica en HA (Figura 4). La inmunotinción para un marcador de AF, la vinculina¹⁴, confirmó que las células O9-1 formaron adherencias focales (FA) en los sitios de degradación de HA (

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Discusión

Varios componentes de ECM regulan la emigración/migración de NCC. Por ejemplo, la HA regula positivamente la migración de NCC ^2,15. Curiosamente, un estudio basado en modelos genéticos de ratón de Tmem2, una hialuronidasa de superficie celular, elucidó el requisito de degradación de HA en la migración de NCC⁹. Los colágenos también son abundantes en la ECM que rodea el tubo neural¹⁶. Se ha demostrado que l...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
10cm cell culture dish	CORNING	Cat. 353003
1X PBS	Millipore	Cat. No. BSS-1005-B
2-well culture inserts	ibidi	Cat. No. 80209
Alexa 555-labelled goat anti-mouse IgG	Invitrogen	Cat. A21422	Goat derived anti-mouse secondary antibody
automated cell counter	Bio-Rad	Cat. No. TC20
CELLBANKER	ZENOGEN PHARMA	Cat. 11910	Cell freezing medium
collagen type I	Sigma	Cat. No. 08-115
Complete ES Cell Medium	Millipore	Cat. No. ES-101-B
DAPI	Invitrogen	Cat. 10184322
Dulbecco’s Modified Eagle Medium	Gibco	Cat. 11971025
Fetal Bovine serum	Gibco	Cat. 10270106
fluorescence microscope	Keyence	Cat. No. BZ-X700
Fluoresent labelled HA	PG Research	FAHA-H2
Glas bottom dish	Iwaki	Cat. 11-0602
glutaldehyde	Sigma	Cat. No. G5882
Matrigel	Fisher	Cat. No. CB-40234	The basement-membrane matrix
monoclonal anti-vinculin antibody	Sigma	Cat. No. V9264
mounting media	Dako	S3023
Normal goat serum	Fisher	Cat. 50062Z
O9-1 cells	Millipore	Cat. No. SCC049
Paraformaldehyde	Sigma	Cat. 158127
triethoxysilane	Sigma	Cat. No. 390143
trypsin-EDTA	Millipore	Cat. No. SM-2003-C