In vitro Étude des effets de la matrice extracellulaire riche en hyaluronanes sur la migration des cellules de la crête neurale

Résumé

Ce protocole décrit une expérience de migration in vitro adaptée à l’analyse fonctionnelle des molécules impliquées dans la migration in vivo des cellules de la crête neurale dans la matrice extracellulaire riche en hyaluronane.

Résumé

Les cellules de la crête neurale (CCN) sont des cellules hautement migratrices qui proviennent de la région dorsale du tube neural. L’émigration des NCC du tube neural est un processus essentiel pour la production de NCC et leur migration ultérieure vers les sites cibles. La voie migratoire des NCC, y compris les tissus environnants du tube neural, implique une matrice extracellulaire riche en hyaluronane (HA). Pour modéliser la migration des NCC dans ces tissus environnants riches en HA à partir du tube neural, un test de migration de substrat mixte composé d’HA (poids moléculaire moyen: 1 200-1 400 kDa) et de collagène de type I (Col1) a été établi dans cette étude. Ce test de migration démontre que les cellules de la lignée cellulaire NCC, O9-1, sont hautement migratrices sur le substrat mixte et que le revêtement HA est dégradé au site des adhérences focales au cours de la migration. Ce modèle in vitro peut être utile pour explorer davantage la base mécaniste impliquée dans la migration des CCN. Ce protocole est également applicable à l’évaluation de différents substrats comme échafaudages pour étudier la migration NCC.

Introduction

Les cellules de la crête neurale (CCN) sont une population cellulaire multipotente présente dans les embryons en développement, et elles proviennent de la bordure de la plaque neurale pendant la neurulation. Ils contribuent à la formation d’une variété de tissus, y compris le système nerveux périphérique, le système cardiovasculaire, les tissus craniofaciaux et le squelette¹. Après induction et spécification NCC à la frontière de la plaque neurale, les NCC émigrent du neuroépithélium et migrent vers les sites tissulaires dérivés de NCC¹.

L’hyaluronane (HA) est un glycosaminoglycane non sulfaté qui est distribué dans une variété de tissus en tant que composant de la matrice extracellulaire (ECM). L’importance de l’AH dans le développement de l’embryon a été démontrée dans des systèmes modèles par l’ablation des gènes responsables du métabolisme de l’hyaluronane. Par exemple, des mutations dans les gènes de la hyaluronane synthase (Has1 et Has2) chez Xenopus se sont avérées entraîner des défauts de migration NCC et une malformation craniofaciale². De plus, il a été rapporté que les protéoglycanes se liant à l’HA, aggrécan et versican, exercent des effets inhibiteurs sur la migration NCC³. Chez la souris, l’ablation Has2 entraîne de graves défauts dans la formation du coussin endocardique, entraînant une létalité ^4,5,6 en milieu de gestation (E9.5-10).

Il a récemment été démontré que la protéine transmembranaire 2 (Tmem2), une hyaluronidase de surface cellulaire, joue un rôle essentiel dans la promotion de l’adhésion et de la migration des cellules cancéreuses médiées par l’intégrine en éliminant l’AH associée à la matrice aux sites d’adhésion ^7,8. Plus récemment, Inubushi et ^coll.9 ont démontré qu’une déficience en Tmem2 entraîne de graves anomalies craniofaciales dues à des anomalies de l’émigration/migration et de la survie des CCN. Dans l’étude précédente⁹, l’expression de Tmem2 a été analysée pendant la formation et la migration de NCC. L’expression de Tmem2 a été observée sur le site de délaminage des NCC et chez les NCC positifs pour Sox9 en émigration (Figure 1). De plus, en utilisant des cellules de crête neurale de souris O9-1 appauvries en Tmem2, l’étude a démontré que l’expression in vitro de Tmem2 était essentielle pour que les cellules O9-1 forment des adhérences focales et pour leur migration dans des substrats contenant de l’HA (Figure 2 et Figure 3)⁹.

Ces résultats indiquent fortement que Tmem2 est également important pour l’adhésion et la migration des CCN par l’intermédiaire de l’ECM riche en HA. Cependant, le mécanisme moléculaire de l’adhésion et de la migration des NCC au sein de l’ECM riche en HA n’est toujours pas clair. Il est donc nécessaire d’établir un système expérimental de culture in vitro pour explorer pleinement l’adhésion et la migration des NCC au sein de la MCE riche en HA.

Parmi les nombreuses approches utilisées pour tester la migration cellulaire, le test basé sur la fermeture des plaies cellulaires est une méthode simple fréquemment utilisée dans les domaines de la physiologie et de l’oncologie¹⁰. Cette approche est utile en raison de sa pertinence pour le phénotype in vivo et est efficace pour déterminer les rôles des médicaments et des chimioattractants au cours de la migration cellulaire¹¹. Il est possible d’évaluer la capacité de migration des masses cellulaires entières et des cellules individuelles en mesurant les distances d’écart cellulaire au fil du temps¹¹. Dans ce manuscrit, un essai modifié in vitro basé sur la fermeture des plaies est introduit pour modéliser la migration NCC dans les tissus riches en HA entourant le tube neural. Cette procédure est également applicable à l’étude de différents composants de la MCE (collagène, fibronectine et laminine) afin d’analyser le rôle de l’échafaudage de la MCE dans la migration des CCN.

Protocole

Toutes les procédures ont été approuvées par le Comité d’éthique animale de l’École supérieure de médecine dentaire de l’Université d’Osaka.

1. Culture de cellules de crête neurale crânienne de souris

REMARQUE : La lignée cellulaire de crête neurale utilisée dans cette étude comprend des cellules O9-1, dérivées à l’origine de Wnt1-Cre; Cellules exprimant R26R-GFP isolées à partir d’embryons de souris E8.5¹² (voir discussion). La méthode décrite ici pour la culture de cellules O9-1 suit un protocole préalablement établi¹³.

1. Préparez la plaque revêtue de matrice de membrane basale.
   1. Décongeler la matrice de la membrane basale (voir le tableau des matériaux) sur la glace. Diluez la matrice 1:50 dans 1x PBS réfrigéré et gardez la glace.
   2. Enduire une plaque de culture de 10 cm de 10 mL de la solution diluée de matrice bas-membrane. Incuber la plaque à température ambiante pendant 1 h et aspirer la matrice avant utilisation.
   3. Lavez la plaque 3x avec 2 ml de PBS.
2. Culture de cellules O9-1 sur la plaque recouverte de matrice membranaire basale.
   1. Réchauffer le milieu cellulaire embryonnaire complet (SE) (voir le tableau des matériaux) au bain-marie à 37 °C.
   2. Mélangez délicatement la suspension de cellules O9-1 (voir le tableau des matériaux) et comptez le nombre de cellules à l’aide d’un compteur de cellules automatisé (voir le tableau des matériaux). Ajuster la concentration cellulaire à 1,1 × 10⁶/mL avec un milieu cellulaire ES complet.
   3. Ajouter 8 mL de milieu cellulaire ES complet préchauffé à la plaque de culture de 10 cm recouverte de matrice et ensemencer les cellules O9-1 à 1,1 x 10⁶ cellules/plaque. Incuber à 37 °C dans un incubateur humidifié à 5% de CO₂ .
   4. Le lendemain, remplacez le milieu par un milieu de cellule ES complet frais (préchauffé à 37 °C). Remplacer par un milieu frais tous les 2-3 jours par la suite.
      REMARQUE: Lorsque les cellules sont confluentes à environ 80% (3-4 jours après le placage), elles peuvent être dissociées avec 0,25% de trypsine-EDTA et évacuées plus loin ou congelées pour une utilisation ultérieure. Des images représentatives des cellules O9-1 sont présentées à la figure 1.
   5. Laver la plaque de culture avec 2 ml de 1x PBS avant la trypsinisation. Ajouter 2 mL de trypsine-EDTA préchauffé à 0,25 % et incuber pendant 5 min à 37 °C. Vérifier s’il y a un détachement complet de la cellule; Tapotez doucement le côté de la plaque plusieurs fois si nécessaire.
   6. Ajouter 2 mL de milieu cellulaire ES complet préchauffé à la plaque de culture et transférer les cellules dissociées dans un tube conique de 15 mL. Centrifuger le tube à 300 x g pendant 5 min.
   7. Jetez le surnageant sans déranger la pastille de cellule. Ensuite, ajoutez 2 mL de milieu cellulaire ES complet préchauffé dans le tube et remettez soigneusement les cellules en suspension par pipetage. Ensemencer les cellules sur une nouvelle plaque de culture à la densité cellulaire désirée.
   8. Vous pouvez également préparer un stock de cellules congelées en ajoutant 1 mL de milieu de congélation cellulaire contenant 10 % de diméthylsulfoxyde (DMSO) dans le tube au lieu du milieu cellulaire ES complet et en remettant complètement les cellules en suspension. Transférer la suspension cellulaire dans des tubes cryogéniques et conserver à −80 °C.

2. Préparation du plat enrobé de HA/Col1

REMARQUE : La méthode originale d’enrobage de HA/Col1 sur des plats à fond de verre a été proposée par Irie et ^coll.7.

1. Ajouter délicatement 50 μL de triéthoxysilane non dilué à un plat à fond de verre de 3,5 cm (voir le tableau des matières). Incuber pendant 5 min à température ambiante (RT) et protéger de la lumière.
   NOTE: L’incubation avec le triéthoxysilane ne doit pas dépasser 5 min. Cela peut affecter l’efficacité du revêtement et produire des produits indésirables.
2. Lavez le plat rapidement 3x avec 2 ml d’eau distillée. Ajouter 50 μL de glutaraldéhyde à 0,25 %, dilué 100x dans du PBS, par boîte, et incuber à TA pendant 30 min.
3. Laver rapidement 4x avec 2 ml de PBS. Ensuite, enrobez les plats de 300 μL de collagène de type I dans de l’acide acétique 0,2 N à TA pendant 1 h.
4. Laver rapidement 3x avec 2 mL de PBS. Ajouter 300 μL de hyaluronate de sodium H2 marqué à la fluorescéinamine (FAHA-H2) à 200 μg/mL (dilué dans du PBS) à chaque plat et incuber toute la nuit à TA. Laver à nouveau 3x avec 2 mL de PBS. Après avoir aspiré le PBS, sécher la plaque à l’air libre pendant 5 minutes sur un banc propre.
   REMARQUE: FAHA-H2 est un hyaluronate de sodium marqué à la fluorescéinamine avec un poids moléculaire moyen allant de 1 200 à 1 600 KDa. HA d’un poids moléculaire approprié peut être utilisé selon le plan de recherche.

3. Essai de migration sur la capsule enrobée de HA/Col1

REMARQUE : Un essai basé sur la fermeture de la plaie utilisant des espaces sans cellules définis de 500 μm dans des substrats Col1/HA a été effectué à l’aide d’inserts de culture à 2 puits (voir le tableau des matériaux). Les cellules O9-1 expriment Tmem2, nécessaire à l’adhésion et à la dégradation de l’HA dans l’espace extracellulaire⁹ (Figure 2 et Figure 3).

1. Après avoir séché le plat à fond de verre enrobé, fixez les inserts de culture à 2 puits aux plats et remplissez les inserts à l’extérieur avec 1 ml de PBS.
2. Ensemencer les cellules O9-1 dans les puits à raison de 1 x 10⁴ cellules dans 100 μL de milieu Eagle modifié (DMEM) de Dulbecco contenant 2 % de sérum fœtal bovin (FBS) par insert. Culture des cellules pendant 2 jours à 37 °C dans un incubateur humidifié à 5% de CO₂ .
3. Retirez soigneusement les inserts de la vaisselle à fond de verre enduite avec une pince à épiler. Lavez doucement la vaisselle à fond de verre enduit de 2 ml de 1x PBS pour enlever les cellules et les débris cellulaires. Ajouter 2 ml de DMEM frais contenant 2% de FBS dans les plats de culture.
4. Capturez des images à contraste de phase dès maintenant comme point de départ à l’aide d’un microscope à fluorescence tout-en-un en mode monochrome avec des réglages haute résolution (gain à 6 dB, pas de rangement). Des lentilles objectives avec des grossissements de 4x à 20x ont été utilisées pour l’imagerie dans cette étude (voir le tableau des matériaux).
   REMARQUE: Capturez les images à contraste de phase avec les barres d’échelle correspondantes et enregistrez-les au format TIFF.
5. Culture des cellules pendant 48 heures supplémentaires à 37 °C et 5 % de CO₂. Capturez des images à contraste de phase à 24 h et 48 h en culture à l’aide du microscope à fluorescence tout-en-un.
6. Fixer les cellules à 48 h avec 1 mL de paraformaldéhyde (PFA) à 4 % pendant 15 min à température ambiante ou toute la nuit à 4 °C. Ensuite, lavez la vaisselle 3x pendant 5 minutes chacune avec 1 ml de PBS frais.
7. Placer une lamelle de couverture avec un support de montage (voir le tableau des matériaux) pour une observation morphologique plus approfondie.
   REMARQUE: Les plats peuvent être imagés immédiatement ou conservés jusqu’à 2 mois à 4 ° C.
8. Facultatif : Immunomarquer les cellules pour les protéines d’intérêt.
   REMARQUE : Un protocole de détection du complexe d’adhésion focale (AF) à l’aide d’un anticorps monoclonal antivinculine dérivé de souris (voir le tableau des matériaux) est décrit ici à titre d’exemple.
   1. Incuber les plats (à partir de l’étape 3.6) avec 0,5 mL de tampon bloquant (5% de sérum de chèvre normal dans PBS) pendant 60 min.
      REMARQUE: Choisissez un tampon de blocage approprié pour l’anticorps primaire. Un tampon bloquant typique serait 5% de sérum normal de la même espèce que l’anticorps secondaire utilisé.
   2. Préparer l’anticorps primaire dilué dans un tampon de dilution d’anticorps (1% de sérum de chèvre normal dans PBS). Incuber les plats avec 0,5 mL d’anticorps primaire dilué pendant une nuit à 4 °C.
      REMARQUE: Choisissez le tampon de dilution d’anticorps approprié. En règle générale, l’anticorps est utilisé à une dilution de 1:50-1:200.
   3. Rincer 3x pendant 5 min chacun avec 2 mL de PBS. Préparer l’anticorps secondaire anti-souris dérivé de chèvre dilué dans le tampon de dilution des anticorps (sérum de chèvre normal à 1% dans PBS). Incuber les boîtes avec 0,5 mL d’anticorps secondaire dilué pendant 1 à 3 h à température ambiante.
      REMARQUE: En règle générale, l’anticorps secondaire est utilisé à une dilution de 1:500-1:1 000. DAPI peut être utilisé pour colorer les noyaux.
   4. Rincer 3x avec 2 mL de PBS pendant 5 min à chaque fois. Placez le couvercle avec 50 μL de support de montage.
      REMARQUE: Les antennes peuvent être imagées à l’aide du microscope à fluorescence tout-en-un avec un filtre GFP (excitation: 470/40, émission: 525/50) et un filtre TexasRed (excitation: 560/40, émission: 630/75) en mode monochrome avec des réglages haute résolution (gain à 6 dB, pas de rangement). Des lentilles objectives avec des grossissements de 4x à 20x ont été utilisées pour l’imagerie dans cette étude.
      REMARQUE: La lame peut être conservée jusqu’à 2 mois à 4 ° C.

4. Analyse des données

1. Ouvrez le logiciel ImageJ 1.51s. Dans la fenêtre ImageJ, sélectionnez Fichier > Ouvrir dans la barre de menus pour ouvrir le fichier image enregistré.
2. Pour définir l’échelle de mesure, tracez une ligne de la même distance que la barre d’échelle. Accédez à Analyser > Définir l’échelle et saisissez la distance et les unités connues de la ligne dans les zones appropriées de la fenêtre Définir l’échelle .
3. Tracez une ligne droite entre l’espace de cellule et appuyez sur Analyser > Mesure pour transférer les valeurs dans une fenêtre de données. Mesurer au moins cinq positions différentes dans chaque échantillon et faire la moyenne des distances pour obtenir les données représentatives de l’échantillon. Effectuer les analyses statistiques à l’aide d’un logiciel approprié (voir le tableau des matières).

Résultats

Un essai de migration a été réalisé sur des substrats mixtes composés de Col1 et de HA de haut poids moléculaire (poids moléculaire moyen : 1 200-1 400 kDa) en utilisant le protocole décrit ici. On a constaté que les cellules O9-1 à la limite de l’écart migraient facilement dans l’espace riche en HA (figure 4). L’immunomarquage d’un marqueur de l’AF, la vinculine¹⁴, a confirmé que les cellules O9-1 formaient des adhérences focales (AF) aux sites...

Discussion

Diverses composantes de l’ECM régissent l’émigration et la migration des CCN. Par exemple, HA réglemente positivement la migration NCC ^2,15. Fait intéressant, une étude basée sur des modèles génétiques murins de Tmem2, une hyaluronidase de surface cellulaire, a élucidé la nécessité de la dégradation de l’HA dans la migration NCC⁹. Les collagènes sont également abondants dans l’ECM entourant le tube neural

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
10cm cell culture dish	CORNING	Cat. 353003
1X PBS	Millipore	Cat. No. BSS-1005-B
2-well culture inserts	ibidi	Cat. No. 80209
Alexa 555-labelled goat anti-mouse IgG	Invitrogen	Cat. A21422	Goat derived anti-mouse secondary antibody
automated cell counter	Bio-Rad	Cat. No. TC20
CELLBANKER	ZENOGEN PHARMA	Cat. 11910	Cell freezing medium
collagen type I	Sigma	Cat. No. 08-115
Complete ES Cell Medium	Millipore	Cat. No. ES-101-B
DAPI	Invitrogen	Cat. 10184322
Dulbecco’s Modified Eagle Medium	Gibco	Cat. 11971025
Fetal Bovine serum	Gibco	Cat. 10270106
fluorescence microscope	Keyence	Cat. No. BZ-X700
Fluoresent labelled HA	PG Research	FAHA-H2
Glas bottom dish	Iwaki	Cat. 11-0602
glutaldehyde	Sigma	Cat. No. G5882
Matrigel	Fisher	Cat. No. CB-40234	The basement-membrane matrix
monoclonal anti-vinculin antibody	Sigma	Cat. No. V9264
mounting media	Dako	S3023
Normal goat serum	Fisher	Cat. 50062Z
O9-1 cells	Millipore	Cat. No. SCC049
Paraformaldehyde	Sigma	Cat. 158127
triethoxysilane	Sigma	Cat. No. 390143
trypsin-EDTA	Millipore	Cat. No. SM-2003-C