In vitro Étude des effets de la matrice extracellulaire riche en hyaluronanes sur la migration des cellules de la crête neurale

Résumé

Ce protocole décrit une expérience de migration in vitro adaptée à l’analyse fonctionnelle des molécules impliquées dans la migration in vivo des cellules de la crête neurale dans la matrice extracellulaire riche en hyaluronane.

Résumé

Les cellules de la crête neurale (CCN) sont des cellules hautement migratrices qui proviennent de la région dorsale du tube neural. L’émigration des NCC du tube neural est un processus essentiel pour la production de NCC et leur migration ultérieure vers les sites cibles. La voie migratoire des NCC, y compris les tissus environnants du tube neural, implique une matrice extracellulaire riche en hyaluronane (HA). Pour modéliser la migration des NCC dans ces tissus environnants riches en HA à partir du tube neural, un test de migration de substrat mixte composé d’HA (poids moléculaire moyen: 1 200-1 400 kDa) et de collagène de type I (Col1) a été établi dans cette étude. Ce test de migration démontre que les cellules de la lignée cellulaire NCC, O9-1, sont hautement migratrices sur le substrat mixte et que le revêtement HA est dégradé au site des adhérences focales au cours de la migration. Ce modèle in vitro peut être utile pour explorer davantage la base mécaniste impliquée dans la migration des CCN. Ce protocole est également applicable à l’évaluation de différents substrats comme échafaudages pour étudier la migration NCC.

Introduction

Les cellules de la crête neurale (CCN) sont une population cellulaire multipotente présente dans les embryons en développement, et elles proviennent de la bordure de la plaque neurale pendant la neurulation. Ils contribuent à la formation d’une variété de tissus, y compris le système nerveux périphérique, le système cardiovasculaire, les tissus craniofaciaux et le squelette¹. Après induction et spécification NCC à la frontière de la plaque neurale, les NCC émigrent du neuroépithélium et migrent vers les sites tissulaires dérivés de NCC¹.

L’hyaluronane (HA) est un glycosaminoglycane non sulfaté....

Protocole

Toutes les procédures ont été approuvées par le Comité d’éthique animale de l’École supérieure de médecine dentaire de l’Université d’Osaka.

1. Culture de cellules de crête neurale crânienne de souris

REMARQUE : La lignée cellulaire de crête neurale utilisée dans cette étude comprend des cellules O9-1, dérivées à l’origine de Wnt1-Cre; Cellules exprimant R26R-GFP isolées à partir d’embryons de souris E8.5¹² (voir discussion). La méthode décrite ici pour la culture de cellules O9-1 suit un protocole préalablement établi¹³.

Résultats

Un essai de migration a été réalisé sur des substrats mixtes composés de Col1 et de HA de haut poids moléculaire (poids moléculaire moyen : 1 200-1 400 kDa) en utilisant le protocole décrit ici. On a constaté que les cellules O9-1 à la limite de l’écart migraient facilement dans l’espace riche en HA (figure 4). L’immunomarquage d’un marqueur de l’AF, la vinculine¹⁴, a confirmé que les cellules O9-1 formaient des adhérences focales (AF) aux sites.......

Discussion

Diverses composantes de l’ECM régissent l’émigration et la migration des CCN. Par exemple, HA réglemente positivement la migration NCC ^2,15. Fait intéressant, une étude basée sur des modèles génétiques murins de Tmem2, une hyaluronidase de surface cellulaire, a élucidé la nécessité de la dégradation de l’HA dans la migration NCC⁹. Les collagènes sont également abondants dans l’ECM entourant le tube neural

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
10cm cell culture dish	CORNING	Cat. 353003
1X PBS	Millipore	Cat. No. BSS-1005-B
2-well culture inserts	ibidi	Cat. No. 80209
Alexa 555-labelled goat anti-mouse IgG	Invitrogen	Cat. A21422	Goat derived anti-mouse secondary antibody
automated cell counter	Bio-Rad	Cat. No. TC20
CELLBANKER	ZENOGEN PHARMA	Cat. 11910	Cell freezing medium
collagen type I	Sigma	Cat. No. 08-115
Complete ES Cell Medium	Millipore	Cat. No. ES-101-B
DAPI	Invitrogen	Cat. 10184322
Dulbecco’s Modified Eagle Medium	Gibco	Cat. 11971025
Fetal Bovine serum	Gibco	Cat. 10270106
fluorescence microscope	Keyence	Cat. No. BZ-X700
Fluoresent labelled HA	PG Research	FAHA-H2
Glas bottom dish	Iwaki	Cat. 11-0602
glutaldehyde	Sigma	Cat. No. G5882
Matrigel	Fisher	Cat. No. CB-40234	The basement-membrane matrix
monoclonal anti-vinculin antibody	Sigma	Cat. No. V9264
mounting media	Dako	S3023
Normal goat serum	Fisher	Cat. 50062Z
O9-1 cells	Millipore	Cat. No. SCC049
Paraformaldehyde	Sigma	Cat. 158127
triethoxysilane	Sigma	Cat. No. 390143
trypsin-EDTA	Millipore	Cat. No. SM-2003-C