В пробирке Исследование влияния богатого гиалуронаном внеклеточного матрикса на миграцию клеток нервного гребня

Резюме

В этом протоколе описывается эксперимент по миграции in vitro , подходящий для функционального анализа молекул, участвующих в миграции клеток нервного гребня in vivo во внеклеточный матрикс, богатый гиалуронаном.

Аннотация

Клетки нервного гребня (NCC) представляют собой сильно мигрирующие клетки, которые происходят из дорсальной области нервной трубки. Эмиграция NCC из нервной трубки является важным процессом для производства NCC и их последующей миграции к целевым участкам. Миграционный путь NCC, включая окружающие ткани нервной трубки, включает внеклеточный матрикс, богатый гиалуроновой кислотой (ГК). Для моделирования миграции NCC в эти богатые ГК окружающие ткани из нервной трубки в этом исследовании был создан смешанный анализ миграции субстрата, состоящий из ГК (средняя молекулярная масса: 1,200-1,400 кДа) и коллагена типа I (Col1). Этот анализ миграции показывает, что клетки клеточной линии NCC, O9-1, сильно мигрируют на смешанном субстрате и что покрытие HA деградирует в месте очаговых спаек в ходе миграции. Эта модель in vitro может быть полезна для дальнейшего изучения механистического базиса, участвующего в миграции NCC. Этот протокол также применим для оценки различных субстратов в качестве каркасов для изучения миграции NCC.

Введение

Клетки нервного гребня (NCC) представляют собой мультипотентную клеточную популяцию, которая присутствует в развивающихся эмбрионах, и они происходят из границы нервной пластинки во время нейруляции. Они способствуют формированию различных тканей, включая периферическую нервную систему, сердечно-сосудистую систему, черепно-лицевые ткани и скелет¹. После индукции и спецификации NCC на границе нервной пластинки NCC эмигрируют из нейроэпителия и мигрируют к тканевым участкам, полученным из NCC¹.

Гиалуронан (ГК) представляет собой несульфатированный гликозаминогликан, который распределяется в различных тканях как компонент внеклеточного матрикса (ECM). Важность гиалуроновой кислоты в развитии эмбриона была продемонстрирована в модельных системах путем абляции генов, ответственных за метаболизм гиалуроновой кислоты. Например, было обнаружено, что мутации в генах гиалуроновой синтазы (Has1 и Has2) у Xenopus приводят к дефектам миграции NCC и черепно-лицевой мальформации². Кроме того, сообщалось, что HA-связывающие протеогликаны, аггрекан и версикан, оказывают ингибирующее действие на миграцию NCC³. У мышей абляция Has2 приводит к серьезным дефектам формирования эндокардиальной подушки, что приводит к летальности в середине беременности (E9,5-10) ^4,5,6.

Недавно было продемонстрировано, что трансмембранный белок 2 (Tmem2), гиалуронидаза клеточной поверхности, играет решающую роль в стимулировании адгезии и миграции раковых клеток, опосредованных интегрином, путем удаления матрикс-ассоциированной ГК в местах адгезии ^7,8. Совсем недавно Inubushi et ^al.9 продемонстрировали, что дефицит Tmem2 приводит к тяжелым черепно-лицевым дефектам из-за аномалий в эмиграции/миграции и выживаемости NCC. В предыдущем исследовании⁹ экспрессия Tmem2 была проанализирована во время формирования и миграции NCC. Экспрессия Tmem2 наблюдалась в месте расслоения NCC и в эмигрирующих Sox9-положительных NCC (рис. 1). Кроме того, с использованием истощенных Tmem2 клеток нервного гребня мыши O9-1 исследование показало, что экспрессия Tmem2 in vitro необходима для формирования фокальных спаек клетками O9-1 и их миграции в HA-содержащие субстраты (рис. 2 и рис. 3)⁹.

Эти результаты убедительно указывают на то, что Tmem2 также важен для адгезии и миграции NCC через HA-богатый ECM. Однако молекулярный механизм адгезии и миграции NCC в богатом ГК ECM до сих пор неясен. Поэтому необходимо создать экспериментальную систему культивирования in vitro для полного изучения адгезии и миграции NCC в богатом ГК ECM.

Из многочисленных подходов, используемых при тестировании миграции клеток, анализ на основе закрытия клеточной раны является простым методом, часто используемым в области физиологии и онкологии¹⁰. Этот подход полезен из-за его актуальности для фенотипа in vivo и эффективен при определении роли лекарств и хемоаттрактантов во время миграции клеток¹¹. Можно оценить миграционную способность как целых клеточных масс, так и отдельных клеток, измеряя расстояния между клеточными промежутками во времени¹¹. В этой рукописи модифицированный анализ, основанный на закрытии раны in vitro , представлен для моделирования миграции NCC в богатые ГК ткани, окружающие нервную трубку. Эта процедура также применима для изучения различных компонентов ECM (например, коллагенов, фибронектина и ламинина) для анализа роли каркаса ECM в миграции NCC.

протокол

Все процедуры были одобрены Комитетом по этике животных Высшей школы стоматологии Университета Осаки.

1. Культура клеток черепного нервного гребня мыши

ПРИМЕЧАНИЕ: Клеточная линия нервного гребня, используемая в этом исследовании, включает клетки O9-1, первоначально полученные из Wnt1-Cre; R26R-GFP-экспрессирующие клетки, выделенные из эмбрионов мышей E8.5¹² (см. обсуждение). Описанный здесь способ культивирования клеток O9-1 следует ранее установленному протоколу¹³.

1. Подготовьте пластину с матричным покрытием базальной мембраны.
   1. Разморозьте матрицу базальной мембраны (см. Таблицу материалов) на льду. Разбавьте матрицу 1:50 в охлажденном 1x PBS и держите на льду.
   2. Покройте 10-сантиметровую культуральную пластину 10 мл разбавленного матричного раствора с базальной мембраной. Инкубируйте пластину при комнатной температуре в течение 1 часа и аспирируйте матрицу перед использованием.
   3. Вымойте тарелку 3 раза 2 мл PBS.
2. Культура клеток O9-1 на пластине с матричным покрытием базальной мембраны.
   1. Нагрейте всю среду эмбриональных стволовых клеток (см. Таблицу материалов) на водяной бане при температуре 37 °C.
   2. Аккуратно перемешайте суспензию ячеек O9-1 (см. Таблицу материалов) и подсчитайте количество ячеек с помощью автоматического счетчика ячеек (см. Таблицу материалов). Отрегулируйте концентрацию клеток до 1,1 × 10⁶ / мл с полной клеточной средой ES.
   3. Добавьте 8 мл предварительно нагретой полной среды ES-клеток в 10-сантиметровую культуральную пластину с матричным покрытием и засейте клетки O9-1 в количестве 1,1 x 10⁶ клеток/планшет. Инкубировать при 37 °C в 5% увлажненном инкубаторе CO₂ .
   4. На следующий день замените среду свежей полной средой ES-ячейки (предварительно подогретой до 37 °C). После этого заменяйте свежим носителем каждые 2-3 дня.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Когда клетки сливаются примерно на 80% (через 3-4 дня после нанесения покрытия), их можно диссоциировать с 0,25% трипсина-ЭДТА и передавать дальше или замораживать для последующего использования. Репрезентативные изображения клеток O9-1 показаны на рисунке 1.
   5. Перед трипсинизацией вымойте культуральную тарелку 2 мл 1x PBS. Добавьте 2 мл предварительно подогретого 0,25% трипсина-ЭДТА и инкубируйте в течение 5 мин при 37 ° C. Проверка на полное отсоединение клеток; При необходимости аккуратно постучите по стенке тарелки пару раз.
   6. Добавьте 2 мл предварительно подогретой полной среды ES-клеток в культуральную пластину и перенесите диссоциированные клетки в коническую пробирку объемом 15 мл. Центрифугируйте пробирку при 300 x g в течение 5 мин.
   7. Выбросьте надосадочную жидкость, не нарушая клеточную гранулу. Затем добавьте в пробирку 2 мл предварительно нагретой полной среды ES-клеток и тщательно ресуспендируйте клетки пипеткой. Засейте клетки на новую культуральную пластину с желаемой плотностью клеток.
   8. Альтернативно, готовят замороженный клеточный запас, добавляя 1 мл клеточной замораживающей среды, содержащей 10% диметилсульфоксида (ДМСО), в пробирку вместо полной среды ES-клеток и тщательно ресуспендируя клетки. Переложите клеточную суспензию в криопробирки и храните при температуре -80 °C.

2. Приготовление блюда, покрытого HA/Col1

ПРИМЕЧАНИЕ: Оригинальный метод нанесения HA/Col1 на посуду со стеклянным дном был предложен Irie et ^al.7.

1. Осторожно добавьте 50 мкл неразбавленного триэтоксисилана в чашку со стеклянным дном диаметром 3,5 см (см. Таблицу материалов). Инкубировать в течение 5 минут при комнатной температуре (RT) и беречь от света.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Инкубация с триэтоксисиланом не должна превышать 5 минут. Это может повлиять на эффективность покрытия и привести к получению нежелательных продуктов.
2. Быстро вымойте посуду 3 раза 2 мл дистиллированной воды. Добавьте 50 мкл 0,25% глутарового альдегида, разбавленного в 100 раз в PBS, на чашку и инкубируйте при RT в течение 30 минут.
3. Быстро вымойте 4 раза с 2 мл PBS. Затем смажьте посуду 300 мкл коллагена I типа в 0,2 N уксусной кислоты при РТ в течение 1 часа.
4. Быстро промойте 3 раза с 2 мл PBS. Добавьте 300 мкл 200 мкг / мл меченного флуоресцеинамином гиалуроната натрия-H2 (FAHA-H2) (разбавленного в PBS) в каждую чашку и инкубируйте в течение ночи при RT. Снова промойте 3 раза с 2 мл PBS. После аспирации PBS высушите пластину на воздухе в течение 5 минут на чистой скамье.
   ПРИМЕЧАНИЕ: FAHA-H2 представляет собой меченный флуоресцеинамином гиалуронат натрия со средней молекулярной массой в диапазоне от 1,200 до 1,600 кДа. Гиалуроновая кислота соответствующей молекулярной массы может быть использована в соответствии с дизайном исследования.

3. Анализ миграции на тарелке, покрытой HA/Col1

ПРИМЕЧАНИЕ: Анализ на основе закрытия раны с использованием определенных 500 мкм бесклеточных промежутков в субстратах Col1 / HA был выполнен с использованием 2-луночных культуральных вставок (см. Таблицу материалов). Клетки O9-1 экспрессируют Tmem2, который необходим для адгезии и деградации ГК во внеклеточном пространстве⁹ (рис. 2 и рис. 3).

1. После высыхания чашки со стеклянным дном с покрытием прикрепите 2-луночные вкладыши для культуры к посуде и заполните вкладыши снаружи 1 мл PBS.
2. Засейте клетки O9-1 в лунки в количестве 1 x 10⁴ клеток в 100 мкл модифицированной среды Eagle (DMEM) Дульбекко, содержащей 2% эмбриональной бычьей сыворотки (FBS) на вкладыш. Культивируйте клетки в течение 2 дней при 37 ° C в 5% увлажненном инкубаторе CO₂ .
3. Аккуратно снимите вставки с покрытой стеклянной посуды пинцетом. Аккуратно вымойте посуду со стеклянным дном с покрытием 2 мл 1x PBS, чтобы удалить клетки и клеточный мусор. Добавьте 2 мл свежего ДМЭМ, содержащего 2% FBS, в чашки для культивирования.
4. Захват фазово-контрастных изображений теперь в качестве начальной точки времени с помощью флуоресцентного микроскопа «все в одном» в монохромном режиме с настройками высокого разрешения (усиление при 6 дБ, без биннинга). Линзы объектива с увеличением от 4x до 20x использовались для визуализации в этом исследовании (см. Таблицу материалов).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Захватите фазово-контрастные изображения с соответствующими масштабными линейками и сохраните их в формате TIFF.
5. Культивируют клетки еще 48 ч при 37 °C и 5%_CO2. Получение фазово-контрастных изображений через 24 ч и 48 ч в культуре с помощью флуоресцентного микроскопа «все в одном».
6. Зафиксируйте клетки в течение 48 ч 1 мл 4% параформальдегида (PFA) в течение 15 минут при комнатной температуре или на ночь при 4 ° C. Затем вымойте посуду 3 раза по 5 минут каждая, добавив 1 мл свежего PBS.
7. Поместите покровное стекло с монтажной средой (см. Таблицу материалов) для дальнейшего морфологического наблюдения.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Посуду можно сразу же наносить или хранить до 2 месяцев при температуре 4 °C.
8. Дополнительно: Иммуномаркировка клеток на наличие интересующих белков.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол для обнаружения комплекса фокальной адгезии (FA) с использованием моноклонального антивинкулинового антитела мышиного происхождения (см. Таблицу материалов) описан здесь в качестве примера.
   1. Инкубируйте посуду (начиная с шага 3.6) с 0,5 мл блокирующего буфера (5% нормальной козьей сыворотки в PBS) в течение 60 мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Выберите подходящий блокирующий буфер для первичного антитела. Типичным блокирующим буфером будет 5% нормальной сыворотки того же вида, что и вторичное антитело.
   2. Приготовьте разбавленное первичное антитело в буфере для разведения антител (1% нормальной козьей сыворотки в PBS). Инкубируйте чашки с 0,5 мл разбавленного первичного антитела в течение ночи при 4 ° C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Выберите подходящий буфер для разбавления антител. Как правило, антитело используют в разведении 1:50-1:200.
   3. Ополаскивайте 3 раза в течение 5 минут по 2 мл PBS. Приготовьте разбавленное вторичное антитело против мышей, полученное из козы, в буфере для разбавления антител (1% нормальной козьей сыворотки в PBS). Инкубируют в чашках с 0,5 мл разведенного вторичного антитела в течение 1-3 ч при комнатной температуре.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Как правило, вторичное антитело используется в разведении 1:500-1:1000. DAPI можно использовать для окрашивания ядер.
   4. Промывайте 3 раза 2 мл PBS в течение 5 минут каждый раз. Поместите покровное стекло в 50 мкл монтажной среды.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Чашки можно визуализировать с помощью флуоресцентного микроскопа «все в одном» с фильтром GFP (возбуждение: 470/40, излучение: 525/50) и фильтром TexasRed (возбуждение: 560/40, излучение: 630/75) в монохромном режиме с настройками высокого разрешения (усиление при 6 дБ, без биннинга). Линзы объектива с увеличением от 4x до 20x использовались для визуализации в этом исследовании.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Предметное стекло можно хранить до 2 месяцев при температуре 4 °C.

4. Анализ данных

1. Откройте программное обеспечение ImageJ 1.51s. В окне ImageJ выберите «Файл» > «Открыть» в строке меню, чтобы открыть сохраненный файл изображения.
2. Для настройки шкалы измерения нарисуйте линию на том же расстоянии, что и масштабная линейка. Перейдите в раздел « Анализ» > «Задать масштаб» и введите известное расстояние и единицы измерения линии в соответствующих полях окна «Задать масштаб ».
3. Проведите прямую линию между ячейками и нажмите « Анализировать» > «Измерить », чтобы перенести значения в окно данных. Измерьте не менее пяти различных положений в каждом образце и усредните расстояния, чтобы получить репрезентативные данные выборки. Выполните статистический анализ с помощью соответствующего программного обеспечения (см. Таблицу материалов).

Результаты

Анализ миграции проводили на смешанных субстратах, состоящих из Col1 и высокомолекулярной ГК (средняя молекулярная масса: 1,200-1,400 кДа) с использованием протокола, описанного здесь. Было обнаружено, что клетки O9-1 на границе разрыва легко мигрируют в богатую ГК щель (рис. 4). И?...

Обсуждение

Различные компоненты ECM регулируют эмиграцию/миграцию NCC. Например, HA положительно регулирует миграцию NCC ^2,15. Интересно, что исследование, основанное на генетических мышиных моделях Tmem2, гиалуронидазы клеточной поверхности, выявило необходимость деграда...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
10cm cell culture dish	CORNING	Cat. 353003
1X PBS	Millipore	Cat. No. BSS-1005-B
2-well culture inserts	ibidi	Cat. No. 80209
Alexa 555-labelled goat anti-mouse IgG	Invitrogen	Cat. A21422	Goat derived anti-mouse secondary antibody
automated cell counter	Bio-Rad	Cat. No. TC20
CELLBANKER	ZENOGEN PHARMA	Cat. 11910	Cell freezing medium
collagen type I	Sigma	Cat. No. 08-115
Complete ES Cell Medium	Millipore	Cat. No. ES-101-B
DAPI	Invitrogen	Cat. 10184322
Dulbecco’s Modified Eagle Medium	Gibco	Cat. 11971025
Fetal Bovine serum	Gibco	Cat. 10270106
fluorescence microscope	Keyence	Cat. No. BZ-X700
Fluoresent labelled HA	PG Research	FAHA-H2
Glas bottom dish	Iwaki	Cat. 11-0602
glutaldehyde	Sigma	Cat. No. G5882
Matrigel	Fisher	Cat. No. CB-40234	The basement-membrane matrix
monoclonal anti-vinculin antibody	Sigma	Cat. No. V9264
mounting media	Dako	S3023
Normal goat serum	Fisher	Cat. 50062Z
O9-1 cells	Millipore	Cat. No. SCC049
Paraformaldehyde	Sigma	Cat. 158127
triethoxysilane	Sigma	Cat. No. 390143
trypsin-EDTA	Millipore	Cat. No. SM-2003-C