במבחנה חקר ההשפעות של מטריצה חוץ-תאית עשירה בהיאלורונן על נדידת תאי קרסט עצביים

Summary

פרוטוקול זה מתאר ניסוי נדידה חוץ גופית המתאים לניתוח פונקציונלי של המולקולות המעורבות בנדידת in vivo של תאי פסגה עצבית לתוך מטריצה חוץ-תאית עשירה בהיאלורונן.

Abstract

תאי פסגה עצבית (NCCs) הם תאים נודדים מאוד שמקורם באזור הגבי של הצינור העצבי. הגירה של NCCs מן הצינור העצבי הוא תהליך חיוני לייצור NCC ואת ההגירה שלהם לאחר מכן לעבר אתרי המטרה. מסלול הנדידה של NCCs, כולל רקמות הצינור העצבי שמסביב, כולל מטריצה חוץ-תאית עשירה בהיאלורונן (HA). כדי למדל נדידת NCC לתוך הרקמות הסובבות העשירות בחומצה היאלורונית מהצינור העצבי, הוקמה במחקר זה בדיקת נדידת מצע מעורבת המורכבת מחומצה היאלורונית (משקל מולקולרי ממוצע: 1,200-1,400 kDa) וקולגן מסוג I (Col1). בדיקת נדידה זו מראה כי תאי קו תאי NCC, O9-1, נודדים מאוד על המצע המעורב וכי ציפוי החומצה ההיאלורונית מתפרק באתר של הידבקויות מוקדיות במהלך הנדידה. מודל זה במבחנה יכול להיות שימושי לחקירה נוספת של הבסיס המכניסטי המעורב בהגירה של NCC. פרוטוקול זה ישים גם להערכת מצעים שונים כפיגומים לחקר נדידת NCC.

Introduction

תאי קרסט עצביים (Neural crest cells או NCCs) הם אוכלוסיית תאים רב-פוטנטית הקיימת בעוברים מתפתחים, והם מקורם בגבול הצלחת העצבית במהלך הנוירולציה. הם תורמים להיווצרות של מגוון רקמות, כולל מערכת העצבים ההיקפית, מערכת הלב וכלי הדם, רקמות craniofacial ואת השלד¹. לאחר אינדוקציה ואפיון NCC בגבול הצלחת העצבית, NCCs מהגרים מהנוירואפיתל ונודדים לעבר אתרי רקמות שמקורם ב- NCC¹.

היאלורונן (HA) הוא גליקוזאמינוגליקן ללא סולפט המופץ במגוון רקמות כמרכיב של המטריצה החוץ תאית (ECM). חשיבותה של חומצה היאלורונית בהתפתחות עוברים הודגמה במערכות מודל באמצעות אבלציה של גנים האחראים על חילוף החומרים של היאלורונן. לדוגמה, מוטציות בגנים סינתאז היאלורונן (Has1 ו- Has2) ב- Xenopus נמצאו כמובילות לפגמים בנדידת NCC ומום גולגולתי². בנוסף, דווח כי הפרוטאוגליקנים קושרי HA, אגרקן וורסיקני, מפעילים השפעות מעכבות על נדידת NCC³. בעכברים, אבלציה Has2 מובילה לפגמים חמורים בהיווצרות כרית אנדוקרדיאלית, וכתוצאה מכך קטלניות באמצע ההיריון (E9.5-10) ^4,5,6.

חלבון טרנסממברנה 2 (Tmem2), היאלורונידאז על פני התא, הוכח לאחרונה כממלא תפקיד קריטי בקידום הידבקות ונדידה של תאים סרטניים בתיווך אינטגרין על ידי הסרת חומצה היאלורונית הקשורה למטריצה באתרי ההדבקה ^7,8. לאחרונה, Inubushi et ^al.9 הראו כי מחסור ב- Tmem2 מוביל למומים גולגולתיים חמורים עקב חריגות בהגירה / הגירה של NCC והישרדות. במחקר הקודם⁹, ביטוי Tmem2 נותח במהלך היווצרות והגירה של NCC. ביטוי Tmem2 נצפה באתר של דלמינציה של NCC ובהגירה של NCCs חיוביים ל-Sox9 (איור 1). נוסף על כך, באמצעות שימוש בתאי סמל עצבי O9-1 של עכבר שהתרוקן מ-Tmem2, המחקר הראה שהביטוי במבחנה של Tmem2 היה חיוני ליצירת הידבקויות מוקדיות עבור תאי O9-1 ולנדידתם למצעים המכילים HA (איור 2 ואיור 3)⁹.

תוצאות אלה מצביעות בבירור על כך ש- Tmem2 חשוב גם להידבקות והגירה של NCC באמצעות ECM עשיר ב- HA. עם זאת, המנגנון המולקולרי של הידבקות והגירה של NCC בתוך ECM עשיר HA עדיין לא ברור. לכן, יש צורך להקים מערכת ניסויית בתרבית חוץ גופית כדי לחקור באופן מלא הידבקות והגירה של NCC בתוך ECM עשיר HA.

מבין הגישות הרבות המשמשות לבדיקת נדידת תאים, הבדיקה המבוססת על סגירת פצעי תאים היא שיטה פשוטה המשמשת לעתים קרובות בתחומי הפיזיולוגיה והאונקולוגיה¹⁰. גישה זו שימושית בשל הרלוונטיות שלה לפנוטיפ in vivo והיא יעילה בקביעת התפקידים של תרופות וכימואטרקטנטים במהלך נדידת תאים¹¹. ניתן להעריך את יכולת הנדידה הן של מסות תאים שלמים והן של תאים בודדים על ידי מדידת מרחקי פער התא לאורך זמן¹¹. בכתב יד זה, מוצגת בדיקה שונה המבוססת על סגירת פצעים במבחנה כדי למדל נדידת NCC לרקמות עשירות בחומצה היאלורונית המקיפות את הצינור העצבי. הליך זה ישים גם לחקר רכיבי ECM שונים (כלומר, קולגן, פיברונקטין ולמינין) כדי לנתח את תפקיד פיגום ECM בנדידת NCC.

Protocol

כל הנהלים אושרו על ידי ועדת האתיקה של בעלי חיים של בית הספר למוסמכים של אוניברסיטת אוסקה לרפואת שיניים.

1. תרבות של עכבר גולגולתי עצבי crest תאים

הערה: קו תאי הפסגה העצבית ששימש במחקר זה כולל תאי O9-1, שמקורם ב-Wnt1-Cre; תאים המבטאים R26R-GFP שבודדו מעוברי עכבר E8.5¹² (ראו דיון). השיטה המתוארת כאן לגידול תאי O9-1 עוקבת אחר פרוטוקול¹³ שנקבע בעבר.

1. הכינו את הצלחת מצופה המטריצה של קרום המרתף.
   1. הפשירו את מטריצת קרום המרתף (ראו טבלת חומרים) על קרח. לדלל את המטריצה 1:50 ב 1x PBS מקורר, ולשמור על קרח.
   2. מצפים צלחת תרבית בקוטר 10 ס"מ ב-10 מ"ל של תמיסת מטריצת קרום מרתף מדוללת. דוגרים על הצלחת בטמפרטורת החדר למשך שעה, ושאפו את המטריצה לפני השימוש.
   3. לשטוף את הצלחת 3x עם 2 מ"ל של PBS.
2. תאי תרבית O9-1 על הצלחת המצופה מטריצה של קרום המרתף.
   1. יש לחמם את תא הגזע העוברי המלא (ES) (ראו טבלת חומרים) באמבט מים בטמפרטורה של 37°C.
   2. ערבב בעדינות את תרחיף התאים O9-1 (ראה טבלת חומרים) וספור את מספר התאים באמצעות מונה תאים אוטומטי (ראה רשימת חומרים). כוונן את ריכוז התא ל- 1.1 × 10⁶/מ"ל עם תווך תאי ES מלא.
   3. הוסף 8 מ"ל של תווך תאי ES שלם שחומם מראש לצלחת התרבית המצופה מטריצה בקוטר 10 ס"מ, וזרע את תאי O9-1 בגודל 1.1 x 10⁶ תאים לצלחת. יש לדגור בטמפרטורה של 37°C באינקובטור לח של 5% CO₂ .
   4. למחרת, החלף את המדיום בתווך תאי ES מלא טרי (מחומם מראש ל-37°C). יש להחליף במדיום טרי כל 2-3 ימים לאחר מכן.
      הערה: כאשר התאים הם בערך 80% confluent (3-4 ימים לאחר ציפוי), הם יכולים להיות מנותקים עם 0.25% טריפסין-EDTA ולהעביר הלאה או להקפיא לשימוש מאוחר יותר. תמונות מייצגות של תאי O9-1 מוצגות באיור 1.
   5. שטפו את צלחת התרבית עם 2 מ"ל של 1x PBS לפני טריפסיניזציה. הוסף 2 מ"ל של 0.25% טריפסין-EDTA שחומם מראש ודגר במשך 5 דקות ב 37 ° C. בדוק ניתוק תאים מלא; טפחו בעדינות על צד הצלחת כמה פעמים במידת הצורך.
   6. הוסף 2 מ"ל של תווך תאי ES שלם שחומם מראש לצלחת התרבית והעבר את התאים המנותקים לצינור חרוטי 15 מ"ל. צנטריפוגה את הצינור ב 300 x גרם במשך 5 דקות.
   7. השליכו את הסופרנאטנט מבלי להפריע לכדורית התא. לאחר מכן, הוסף 2 מ"ל של תווך תאי ES שלמים שחוממו מראש לצינור, והשהה מחדש את התאים ביסודיות על ידי צנרת. זרעו את התאים על צלחת תרבית חדשה בצפיפות התאים הרצויה.
   8. לחלופין, הכינו מלאי תאים קפואים על ידי הוספת 1 מ"ל של מדיום הקפאת תאים המכיל 10% דימתיל סולפוקסיד (DMSO) לצינור במקום תווך תאי ES שלם והשעיה יסודית של התאים. העבירו את תרחיף התא לצינורות הקפאה, ואחסנו בטמפרטורה של -80°C.

2. הכנת התבשיל המצופה HA/Col1

הערה: השיטה המקורית של ציפוי HA/Col1 על כלים בעלי תחתית זכוכית הוצעה על ידי Irie et ^al.7.

1. הוסיפו בזהירות 50 מיקרוליטר של טריאתוקסיסילן לא מדולל לצלחת בעלת תחתית זכוכית בקוטר 3.5 ס"מ (ראו טבלת חומרים). יש לדגור במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר (RT) ולהגן מפני אור.
   הערה: הדגירה עם triethoxysilane לא יעלה על 5 דקות. זה עלול להשפיע על יעילות הציפוי ולייצר מוצרים לא רצויים.
2. לשטוף את המנה במהירות 3x עם 2 מ"ל של מים מזוקקים. הוסיפו 50 μL של 0.25% גלוטראלדהיד, מדולל פי 100 ב-PBS, לכל מנה, ודגרו ב-RT למשך 30 דקות.
3. יש לשטוף במהירות 4x עם 2 מ"ל של PBS. לאחר מכן, מצפים את הכלים עם 300 μL של קולגן מסוג I ב 0.2 N חומצה אצטית ב RT במשך 1 שעה.
4. לשטוף במהירות 3x עם 2 מ"ל של PBS. יש להוסיף 300 μL של 200 מיקרוגרם/מ"ל נתרן היאלורונאט-H2 (FAHA-H2) עם תווית פלואורסציינמין (מדולל ב-PBS) לכל מנה ולדגור למשך הלילה ב-RT. יש לשטוף שוב 3x עם 2 מ"ל PBS. לאחר שאיפת PBS, לייבש את הצלחת באוויר במשך 5 דקות על ספסל נקי.
   הערה: FAHA-H2 הוא נתרן היאלורונט עם תווית פלואורסציינמין עם משקל מולקולרי ממוצע שנע בין 1,200-1,600 KDa. HA של משקל מולקולרי מתאים ניתן להשתמש על פי תכנון המחקר.

3. בדיקת נדידה על צלחת מצופה HA/Col1

הערה: בדיקה מבוססת סגירת פצע באמצעות מרווחים מוגדרים של 500 מיקרומטר ללא תאים במצעי Col1/HA בוצעה באמצעות תוספות תרבית של 2 בארות (ראה טבלת חומרים). תאי O9-1 מבטאים את Tmem2, אשר נדרש להידבקות ולפירוק של חומצה היאלורונית בחלל החוץ-תאי⁹ (איור 2 ואיור 3).

1. לאחר ייבוש צלחת תחתית הזכוכית המצופה מחברים את תוספות התרבית 2 בארות לכלים, וממלאים את התוספות חיצונית עם 1 מ"ל של PBS.
2. זרעו את תאי O9-1 לתוך הבארות ב 1 x 10⁴ תאים ב 100 μL של מדיום הנשר המעובד של Dulbecco (DMEM) המכיל 2% סרום בקר עוברי (FBS) לכל תוספת. תרבית את התאים במשך 2 ימים ב 37 ° C באינקובטור 5% CO₂ לח.
3. מוציאים את התוספות בזהירות מהכלים המצופים בתחתית הזכוכית בפינצטה. שטפו בעדינות את הכלים המצופים בתחתית הזכוכית עם 2 מ"ל של 1x PBS כדי להסיר את התאים ואת פסולת התא. הוסף 2 מ"ל של DMEM טרי המכיל 2% FBS לתוך מנות התרבית.
4. צלם תמונות עם ניגודיות פאזה כעת כנקודת זמן התחלה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי All-in-One במצב מונוכרום עם הגדרות ברזולוציה גבוהה (רווח של 6 dB, ללא binning). במחקר זה נעשה שימוש בעדשות אובייקטיביות עם הגדלות של פי 4 עד פי 20 לצורך הדמיה (ראו טבלת חומרים).
   הערה: לכוד את התמונות עם ניגודיות הפאזה עם פסי קנה המידה המתאימים ושמור אותן בתבנית TIFF.
5. תרבית את התאים במשך 48 שעות נוספות ב 37 ° C ו 5% CO₂. צלם תמונות עם ניגודיות פאזה בתרבית של 24 שעות ו-48 שעות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי רב-תכליתי.
6. תקן את התאים ב 48 שעות עם 1 מ"ל של 4% paraformaldehyde (PFA) במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר או לילה ב 4 ° C. לאחר מכן, לשטוף את הכלים 3x במשך 5 דקות כל אחד עם 1 מ"ל של PBS טרי.
7. הניחו תלוש כיסוי עם אמצעי הרכבה (ראו טבלת חומרים) לתצפית מורפולוגית נוספת.
   הערה: ניתן לצלם את הכלים באופן מיידי או לאחסן עד חודשיים בטמפרטורה של 4°C.
8. אופציונלי: סימון חיסוני של התאים לחלבונים מעניינים.
   הערה: פרוטוקול לזיהוי קומפלקס הידבקות מוקד (FA) באמצעות נוגדן חד-שבטי אנטי-וינקולין שמקורו בעכבר (ראה טבלת חומרים) מתואר כאן כדוגמה.
   1. דוגרים על הכלים (משלב 3.6) עם 0.5 מ"ל של חיץ חוסם (5% סרום עיזים רגיל ב-PBS) למשך 60 דקות.
      הערה: בחר מאגר חסימה מתאים עבור הנוגדן הראשי. חיץ חוסם טיפוסי יהיה 5% סרום נורמלי מאותו מין כמו הנוגדן המשני בשימוש.
   2. הכינו את הנוגדן הראשוני המדולל במאגר דילול נוגדנים (1% סרום עיזים תקין ב-PBS). לדגור את הכלים עם 0.5 מ"ל של נוגדן ראשוני מדולל לילה ב 4 °C (75 °F).
      הערה: בחר את מאגר דילול הנוגדנים המתאים. בדרך כלל, הנוגדן משמש בדילול 1:50-1:200.
   3. יש לשטוף 3 פעמים במשך 5 דקות כל אחד עם 2 מ"ל של PBS. הכינו את הנוגדן המשני נגד עכבר שמקורו בעז מדוללת במאגר דילול הנוגדנים (1% סרום עיזים תקין ב-PBS). לדגור את הכלים עם 0.5 מ"ל של נוגדן משני מדולל במשך 1-3 שעות בטמפרטורת החדר.
      הערה: בדרך כלל, הנוגדן המשני משמש בדילול של 1:500-1:1,000. DAPI יכול לשמש להכתמת הגרעינים.
   4. יש לשטוף 3 פעמים עם 2 מ"ל PBS במשך 5 דקות בכל פעם. מניחים את הכיסוי עם 50 μL של אמצעי הרכבה.
      הערה: ניתן לצלם את הכלים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי All-in-One עם מסנן GFP (עירור: 470/40, פליטה: 525/50) ומסנן TexasRed (עירור: 560/40, פליטה: 630/75) במצב מונוכרום עם הגדרות ברזולוציה גבוהה (רווח ב 6 dB, ללא binning). במחקר זה נעשה שימוש בעדשות אובייקטיביות עם הגדלות של פי 4 עד פי 20.
      הערה: ניתן לאחסן את השקופית עד חודשיים ב- 4 °C.

4. ניתוח נתונים

1. פתח את תוכנת ImageJ 1.51s. בחלון ImageJ, בחר File > Open משורת התפריטים כדי לפתוח את קובץ התמונה שנשמר.
2. לקביעת קנה המידה, ציירו קו באותו מרחק כמו סרגל קנה המידה. עבור אל נתח > הגדר קנה מידה והקלד את המרחק והיחידות הידועים של הקו בתיבות המתאימות בחלון הגדר קנה מידה .
3. צייר קו ישר בין המרווח בין התאים והקש Analyze > Measure כדי להעביר את הערכים לחלון נתונים. מדדו לפחות חמישה מיקומים שונים בכל מדגם, וערכו ממוצע של המרחקים כדי לקבל את נתוני המדגם המייצגים. בצע את הניתוחים הסטטיסטיים באמצעות תוכנה מתאימה (ראה טבלת חומרים).

תוצאות

בדיקת נדידה בוצעה על מצעים מעורבים המורכבים מ-Col1 ו-HA בעל משקל מולקולרי גבוה (משקל מולקולרי ממוצע: 1,200-1,400 kDa) באמצעות הפרוטוקול המתואר כאן. תאי O9-1 בגבול הפער נמצאו נודדים בקלות לתוך הפער העשיר בחומצה היאלורונית (איור 4). צביעה חיסונית עבור סמן FA, וינקולין¹⁴, אישרה ש?...

Discussion

רכיבי ECM שונים מסדירים הגירה/הגירה של NCC. לדוגמה, HA מווסת באופן חיובי את נדידת NCC ^2,15. באופן מעניין, מחקר המבוסס על מודלים גנטיים של עכברים של Tmem2, היאלורונידאז על פני התא, הבהיר את הדרישה לפירוק HA בנדידת NCC⁹. קולגן מצוי בשפע גם ב-ECM המקיף את הצינור העצ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
10cm cell culture dish	CORNING	Cat. 353003
1X PBS	Millipore	Cat. No. BSS-1005-B
2-well culture inserts	ibidi	Cat. No. 80209
Alexa 555-labelled goat anti-mouse IgG	Invitrogen	Cat. A21422	Goat derived anti-mouse secondary antibody
automated cell counter	Bio-Rad	Cat. No. TC20
CELLBANKER	ZENOGEN PHARMA	Cat. 11910	Cell freezing medium
collagen type I	Sigma	Cat. No. 08-115
Complete ES Cell Medium	Millipore	Cat. No. ES-101-B
DAPI	Invitrogen	Cat. 10184322
Dulbecco’s Modified Eagle Medium	Gibco	Cat. 11971025
Fetal Bovine serum	Gibco	Cat. 10270106
fluorescence microscope	Keyence	Cat. No. BZ-X700
Fluoresent labelled HA	PG Research	FAHA-H2
Glas bottom dish	Iwaki	Cat. 11-0602
glutaldehyde	Sigma	Cat. No. G5882
Matrigel	Fisher	Cat. No. CB-40234	The basement-membrane matrix
monoclonal anti-vinculin antibody	Sigma	Cat. No. V9264
mounting media	Dako	S3023
Normal goat serum	Fisher	Cat. 50062Z
O9-1 cells	Millipore	Cat. No. SCC049
Paraformaldehyde	Sigma	Cat. 158127
triethoxysilane	Sigma	Cat. No. 390143
trypsin-EDTA	Millipore	Cat. No. SM-2003-C