In vitro Investigação dos Efeitos da Matriz Extracelular Rica em Hialuronano na Migração de Células da Crista Neural

Resumo

Este protocolo descreve um experimento de migração in vitro adequado para a análise funcional das moléculas envolvidas na migração in vivo de células da crista neural para a matriz extracelular rica em hialuronano.

Resumo

As células da crista neural (NCCs) são células altamente migratórias que se originam da região dorsal do tubo neural. A emigração de NCCs do tubo neural é um processo essencial para a produção de NCC e sua subsequente migração para os locais alvo. A rota migratória das NCCs, incluindo os tecidos do tubo neural circundantes, envolve matriz extracelular rica em hialuronano (AH). Para modelar a migração de NCC para esses tecidos circundantes ricos em AH a partir do tubo neural, um ensaio misto de migração de substrato consistindo de AH (peso molecular médio: 1.200-1.400 kDa) e colágeno tipo I (Col1) foi estabelecido neste estudo. Este ensaio de migração demonstra que as células da linhagem celular NCC, O9-1, são altamente migratórias sobre o substrato misto e que o revestimento do AH é degradado no local das aderências focais no curso da migração. Este modelo in vitro pode ser útil para uma maior exploração das bases mecanicistas envolvidas na migração de NCC. Este protocolo também é aplicável para avaliar diferentes substratos como scaffolds para estudar a migração de NCC.

Introdução

As células da crista neural (NCCs) são uma população celular multipotente que está presente em embriões em desenvolvimento, e se originam da borda da placa neural durante a neurulação. Contribuem para a formação de uma variedade de tecidos, incluindo o sistema nervoso periférico, o sistema cardiovascular, os tecidos craniofaciais e o esqueleto1^. Após indução e especificação da NCC na borda da placa neural, as NCCs emigram do neuroepitélio e migram para sítios teciduais derivados da NCC¹.

O hialuronano (AH) é um glicosaminoglicano não sulfatado que se distribui em uma variedade de tecidos como componente da matriz extracelular (MEC). A importância do AH no desenvolvimento embrionário tem sido demonstrada em sistemas modelo através da ablação de genes responsáveis pelo metabolismo do hialuronano. Por exemplo, mutações nos genes hialuronano sintase (Has1 e Has2) em Xenopus levaram a defeitos de migração de NCC e malformação craniofacial2. Além disso, os proteoglicanos ligantes de AH, agrecan e versican, têm sido relatados como exercendo efeitos inibitórios sobre a migração de NCC³. Em camundongos, a ablação de Has2 leva a graves defeitos na formação do coxim endocárdico, resultando em letalidade no meio da gestação (E9,5-10)^4,5,6.

A proteína transmembrana 2 (Tmem2), uma hialuronidase de superfície celular, demonstrou recentemente desempenhar um papel crítico na promoção da adesão e migração de células cancerosas mediadas por integrinas, removendo o AH associado à matriz nos sítios de adesão ^7,8. Mais recentemente, Inubushi et ^al.9 demonstraram que a deficiência de Tmem2 leva a graves defeitos craniofaciais devido a anormalidades na emigração/migração e sobrevida das NCC. No estudo anterior⁹, a expressão de Tmem2 foi analisada durante a formação e migração de NCC. A expressão de Tmem2 foi observada no local de delaminação de NCC e em NCCs Sox9-positivos emigrados (Figura 1). Além disso, utilizando células da crista neural O9-1 de camundongos depletadas de Tmem2, o estudo demonstrou que a expressão in vitro de Tmem2 foi essencial para que as células O9-1 formassem aderências focais e para sua migração para substratos contendo AH (Figura 2 e Figura 3)⁹.

Esses resultados indicam fortemente que o Tmem2 também é importante para a adesão e migração do NCC através da MEC rica em AH. No entanto, o mecanismo molecular de adesão e migração de NCC dentro da MEC rica em AH ainda não está claro. Portanto, é necessário estabelecer um sistema experimental de cultivo in vitro para explorar completamente a adesão e migração de NCC dentro da MEC rica em AH.

Das inúmeras abordagens empregadas no teste da migração celular, o ensaio baseado no fechamento de feridas celulares é um método simples e frequentemente utilizado nos campos da fisiologia e^oncologia10. Essa abordagem é útil devido à sua relevância para o fenótipo in vivo e é eficaz na determinação do papel de drogas e quimioatrativos durante a migração celular¹¹. É possível avaliar a capacidade de migração tanto de massas celulares inteiras quanto de células individuais medindo as distâncias de gap celular ao longo do tempo¹¹. Neste manuscrito, um ensaio modificado in vitro baseado no fechamento de feridas é introduzido para modelar a migração de NCC para tecidos ricos em AH ao redor do tubo neural. Esse procedimento também é aplicável para estudar diferentes componentes da MEC (i.e., colágenos, fibronectina e laminina) para analisar o papel do arcabouço da MEC na migração da NCC.

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Protocolo

Todos os procedimentos foram aprovados pelo Comitê de Ética Animal da Escola de Pós-Graduação em Odontologia da Universidade de Osaka.

1. Cultura de células da crista neural do crânio de camundongos

NOTA: A linhagem celular da crista neural utilizada neste estudo compreende células O9-1, originalmente derivadas de Wnt1-Cre; Células que expressam R26R-GFP isoladas de embriões de camundongo E8.5¹² (ver discussão). O método aqui descrito para a cultura de células O9-1 segue um protocolo previamente^{estabelecido13}.

1. Prepare a placa revestida com matriz de membrana basal.
   1. Descongelar a matriz da membrana basal (ver Tabela de Materiais) no gelo. Diluir a matriz 1:50 em PBS refrigerado 1x e manter no gelo.
   2. Revestir uma placa de cultura de 10 cm com 10 mL da solução diluída da matriz basal-membrana. Incubar a placa à temperatura ambiente por 1 h e aspirar a matriz antes do uso.
   3. Lave a placa 3x com 2 mL de PBS.
2. Cultura de células O9-1 na placa revestida com matriz da membrana basal.
   1. Aquecer o meio de células estaminais embrionárias (ES) completo (ver Tabela de Materiais) em banho-maria a 37 °C.
   2. Misture suavemente a suspensão de células O9-1 (consulte Tabela de Materiais) e conte o número de células usando um contador de células automatizado (consulte Tabela de Materiais). Ajustar a concentração celular para 1,1 × 10⁶/mL com meio celular ES completo.
   3. Adicionar 8 mL de meio de célula ES completo pré-aquecido à placa de cultura de 10 cm revestida com matriz e semear as células O9-1 a 1,1 x 10⁶ células/placa. Incubar a 37 °C numa estufa humidificada a 5% CO₂ .
   4. No dia seguinte, substitua o meio por meio de célula ES completo fresco (pré-aquecido a 37 °C). Substitua por meio fresco a cada 2-3 dias depois.
      NOTA: Quando as células são aproximadamente 80% confluentes (3-4 dias após o plaqueamento), elas podem ser dissociadas com 0,25% de tripsina-EDTA e passadas posteriormente ou congeladas para uso posterior. Imagens representativas das células O9-1 são mostradas na Figura 1.
   5. Lavar a placa de cultura com 2 mL de PBS 1x antes da tripsinização. Adicionar 2 mL de tripsina-EDTA a 0,25% pré-aquecido e incubar por 5 min a 37 °C. Verifique se há descolamento completo da célula; Toque suavemente na lateral do prato algumas vezes, se necessário.
   6. Adicionar 2 mL de meio celular ES completo pré-aquecido à placa de cultura e transferir as células dissociadas para um tubo cônico de 15 mL. Centrifugar o tubo a 300 x g por 5 min.
   7. Descarte o sobrenadante sem perturbar o pellet celular. Em seguida, adicione 2 mL de meio celular ES completo pré-aquecido ao tubo e ressuspenda completamente as células por pipetagem. Semeando as células em uma nova placa de cultura na densidade celular desejada.
   8. Alternativamente, prepare um estoque de células congeladas adicionando 1 mL de meio de congelamento celular contendo 10% de dimetilsulfóxido (DMSO) ao tubo no lugar do meio de célula ES completo e ressuspendendo completamente as células. Transfira a suspensão celular para tubos de crio e armazene a -80 °C.

2. Preparo do prato revestido com HA/Col1

NOTA: O método original de revestimento de HA/Col1 em placas com fundo de vidro foi proposto por Irie et ^al.7.

1. Adicione cuidadosamente 50 μL de trietoxissilano não diluído a um prato com fundo de vidro de 3,5 cm (ver Tabela de Materiais). Incubar durante 5 min à temperatura ambiente (TR) e proteger da luz.
   NOTA: A incubação com trietoxisilano não deve exceder 5 min. Isso pode afetar a eficiência do revestimento e produzir produtos indesejáveis.
2. Lave o prato rapidamente 3x com 2 mL de água destilada. Adicionar 50 μL de glutaraldeído a 0,25%, diluído 100x em PBS, por prato, e incubar em TR por 30 min.
3. Lave rapidamente 4x com 2 mL de PBS. Em seguida, revestir as placas com 300 μL de colágeno tipo I em ácido acético 0,2 N em TR por 1 h.
4. Lave rapidamente 3x com 2 mL de PBS. Adicionar 300 μL de 200 μg/mL de hialuronato de sódio marcado com fluoresceinamina-H2 (FAHA-H2) (diluído em PBS) a cada prato e incubar durante a noite em RT. Lave novamente 3x com 2 mL de PBS. Após a aspiração do PBS, seque a placa ao ar por 5 min em uma bancada limpa.
   NOTA: FAHA-H2 é um hialuronato de sódio marcado com fluoresceinamina com peso molecular médio variando de 1.200-1.600 KDa. AH de peso molecular adequado pode ser utilizado de acordo com o desenho da pesquisa.

3. Ensaio de migração na placa revestida com HA/Col1

NOTA: Um ensaio baseado no fechamento da ferida usando lacunas livres de células definidas de 500 μm em substratos de Col1/HA foi realizado usando pastilhas de cultura de 2 poços (ver Tabela de Materiais). As células O9-1 expressam Tmem2, necessário para a adesão e degradação do AH no espaço^{extracelular9} (Figura 2 e Figura 3).

1. Depois de secar a placa de fundo de vidro revestida, anexe as pastilhas de cultura de 2 poços às placas e preencha as pastilhas externamente com 1 mL de PBS.
2. Semeando as células O9-1 nos poços a 1 x 10⁴ células em 100 μL de meio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) contendo 2% de soro fetal bovino (SFB) por inserção. Cultivar as células por 2 dias a 37 °C em estufa umidificada com CO₂ a 5%.
3. Retire cuidadosamente as pastilhas das placas com fundo de vidro revestido com uma pinça. Lave suavemente os pratos com fundo de vidro revestido com 2 mL de 1x PBS para remover as células e os detritos celulares. Adicionar 2 mL de DMEM fresco contendo 2% de FBS nos pratos de cultura.
4. Capture imagens de contraste de fase agora como o ponto de partida usando um microscópio de fluorescência tudo-em-um em modo monocromático com configurações de alta resolução (ganho a 6 dB, sem binning). Lentes objetivas com aumentos de 4x a 20x foram utilizadas para aquisição de imagens neste estudo (ver Tabela de Materiais).
   NOTA: Capture as imagens de contraste de fase com as barras de escala correspondentes e salve-as no formato TIFF.
5. Cultivar as células por mais 48 h a 37 °C e 5% de CO₂. Capturar imagens de contraste de fase em 24 h e 48 h em cultura usando o microscópio de fluorescência tudo-em-um.
6. Fixar as células a 48 h com 1 ml de paraformaldeído (PFA) a 4% durante 15 minutos à temperatura ambiente ou durante a noite a 4 °C. Em seguida, lave a louça 3x por 5 min cada com 1 mL de PBS fresco.
7. Coloque uma lamínula com meio de montagem (ver Tabela de Materiais) para observação morfológica adicional.
   NOTA: Os pratos podem ser fotografados imediatamente ou armazenados por até 2 meses a 4 °C.
8. Opcional: Imunomarcar as células para proteínas de interesse.
   NOTA: Um protocolo para detectar o complexo de adesão focal (FA) usando um anticorpo anti-vinculina monoclonal derivado de camundongo (consulte a Tabela de Materiais) é descrito aqui como um exemplo.
   1. Incubar as placas (a partir do passo 3.6) com 0,5 ml de tampão de bloqueio (5% de soro normal de cabra em PBS) durante 60 minutos.
      Observação : escolha um buffer de bloqueio apropriado para o anticorpo primário. Um tampão de bloqueio típico seria 5% de soro normal da mesma espécie que o anticorpo secundário usado.
   2. Preparar o anticorpo primário diluído em tampão de diluição de anticorpos (1% de soro normal de cabra em PBS). Incubar as placas com 0,5 ml de anticorpo primário diluído durante a noite a 4 °C.
      NOTA: Escolha o tampão de diluição de anticorpos apropriado. Normalmente, o anticorpo é usado em uma diluição de 1:50-1:200.
   3. Enxaguar 3x por 5 min cada com 2 mL de PBS. Preparar o anticorpo secundário diluído derivado da cabra anti-rato no tampão de diluição de anticorpos (1% de soro normal de cabra em PBS). Incubar as placas com 0,5 mL de anticorpo secundário diluído por 1-3 h à temperatura ambiente.
      NOTA: Normalmente, o anticorpo secundário é usado em uma diluição de 1:500-1:1.000. DAPI pode ser usado para coloração dos núcleos.
   4. Enxaguar 3x com 2 mL de PBS por 5 min de cada vez. Coloque a lamínula com 50 μL de meio de montagem.
      NOTA: As placas podem ser fotografadas usando o microscópio de fluorescência tudo-em-um com um filtro GFP (excitação: 470/40, emissão: 525/50) e um filtro TexasRed (excitação: 560/40, emissão: 630/75) em modo monocromático com configurações de alta resolução (ganho a 6 dB, sem binning). Lentes objetivas com aumentos de 4x a 20x foram utilizadas para a realização de exames neste estudo.
      NOTA: O slide pode ser armazenado por até 2 meses a 4 °C.

4. Análise dos dados

1. Abra o software ImageJ 1.51s. Na janela ImageJ, selecione Arquivo > Abrir na barra de menus para abrir o arquivo de imagem salvo.
2. Para definir a escala de medição, desenhe uma linha da mesma distância que a barra de escala. Vá para Analisar > Definir escala e digite a distância conhecida e as unidades da linha nas caixas apropriadas da janela Definir escala .
3. Desenhe uma linha reta entre a lacuna da célula e pressione Analisar > Medir para transferir os valores para uma janela de dados. Meça pelo menos cinco posições diferentes em cada amostra e faça a média das distâncias para obter os dados representativos da amostra. Realizar as análises estatísticas utilizando software apropriado (ver Tabela de Materiais).

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Resultados

Um ensaio de migração foi realizado em substratos mistos compostos por Col1 e AH de alto peso molecular (peso molecular médio: 1.200-1.400 kDa) utilizando o protocolo aqui descrito. Células O9-1 no limite da falha migraram prontamente para a lacuna rica em AH (Figura 4). A imunomarcação para um marcador de AG, a vinculina¹⁴, confirmou que as células O9-1 formaram aderências focais (AGs) nos locais de degradação do AH (Figura 5)....

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Discussão

Vários componentes do ECM regulam a emigração/migração do NCC. Por exemplo, o AH regula positivamente a migração de^NCC2,15. Curiosamente, um estudo baseado em modelos genéticos murinos de Tmem2, uma hialuronidase de superfície celular, elucidou a exigência de degradação do AH na migração de^NCC9. Os colágenos também são abundantes na MEC ao redor do tubo neural¹⁶. Demonstrou-se que a decorina, um peq...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
10cm cell culture dish	CORNING	Cat. 353003
1X PBS	Millipore	Cat. No. BSS-1005-B
2-well culture inserts	ibidi	Cat. No. 80209
Alexa 555-labelled goat anti-mouse IgG	Invitrogen	Cat. A21422	Goat derived anti-mouse secondary antibody
automated cell counter	Bio-Rad	Cat. No. TC20
CELLBANKER	ZENOGEN PHARMA	Cat. 11910	Cell freezing medium
collagen type I	Sigma	Cat. No. 08-115
Complete ES Cell Medium	Millipore	Cat. No. ES-101-B
DAPI	Invitrogen	Cat. 10184322
Dulbecco’s Modified Eagle Medium	Gibco	Cat. 11971025
Fetal Bovine serum	Gibco	Cat. 10270106
fluorescence microscope	Keyence	Cat. No. BZ-X700
Fluoresent labelled HA	PG Research	FAHA-H2
Glas bottom dish	Iwaki	Cat. 11-0602
glutaldehyde	Sigma	Cat. No. G5882
Matrigel	Fisher	Cat. No. CB-40234	The basement-membrane matrix
monoclonal anti-vinculin antibody	Sigma	Cat. No. V9264
mounting media	Dako	S3023
Normal goat serum	Fisher	Cat. 50062Z
O9-1 cells	Millipore	Cat. No. SCC049
Paraformaldehyde	Sigma	Cat. 158127
triethoxysilane	Sigma	Cat. No. 390143
trypsin-EDTA	Millipore	Cat. No. SM-2003-C