In vitro Investigação dos Efeitos da Matriz Extracelular Rica em Hialuronano na Migração de Células da Crista Neural

Resumo

Este protocolo descreve um experimento de migração in vitro adequado para a análise funcional das moléculas envolvidas na migração in vivo de células da crista neural para a matriz extracelular rica em hialuronano.

Resumo

As células da crista neural (NCCs) são células altamente migratórias que se originam da região dorsal do tubo neural. A emigração de NCCs do tubo neural é um processo essencial para a produção de NCC e sua subsequente migração para os locais alvo. A rota migratória das NCCs, incluindo os tecidos do tubo neural circundantes, envolve matriz extracelular rica em hialuronano (AH). Para modelar a migração de NCC para esses tecidos circundantes ricos em AH a partir do tubo neural, um ensaio misto de migração de substrato consistindo de AH (peso molecular médio: 1.200-1.400 kDa) e colágeno tipo I (Col1) foi estabelecido neste estudo. Este ensaio de migração demonstra que as células da linhagem celular NCC, O9-1, são altamente migratórias sobre o substrato misto e que o revestimento do AH é degradado no local das aderências focais no curso da migração. Este modelo in vitro pode ser útil para uma maior exploração das bases mecanicistas envolvidas na migração de NCC. Este protocolo também é aplicável para avaliar diferentes substratos como scaffolds para estudar a migração de NCC.

Introdução

As células da crista neural (NCCs) são uma população celular multipotente que está presente em embriões em desenvolvimento, e se originam da borda da placa neural durante a neurulação. Contribuem para a formação de uma variedade de tecidos, incluindo o sistema nervoso periférico, o sistema cardiovascular, os tecidos craniofaciais e o esqueleto1^. Após indução e especificação da NCC na borda da placa neural, as NCCs emigram do neuroepitélio e migram para sítios teciduais derivados da NCC¹.

O hialuronano (AH) é um glicosaminoglicano não sulfatado que se distribui em uma variedade de tecidos como ....

Protocolo

Todos os procedimentos foram aprovados pelo Comitê de Ética Animal da Escola de Pós-Graduação em Odontologia da Universidade de Osaka.

1. Cultura de células da crista neural do crânio de camundongos

NOTA: A linhagem celular da crista neural utilizada neste estudo compreende células O9-1, originalmente derivadas de Wnt1-Cre; Células que expressam R26R-GFP isoladas de embriões de camundongo E8.5¹² (ver discussão). O método aqui descrito para a cultura de células O9-1 segue um protocolo previamente^{estabelecido13}.

1. Prepare a p....

Resultados

Um ensaio de migração foi realizado em substratos mistos compostos por Col1 e AH de alto peso molecular (peso molecular médio: 1.200-1.400 kDa) utilizando o protocolo aqui descrito. Células O9-1 no limite da falha migraram prontamente para a lacuna rica em AH (Figura 4). A imunomarcação para um marcador de AG, a vinculina¹⁴, confirmou que as células O9-1 formaram aderências focais (AGs) nos locais de degradação do AH (Figura 5)........

Discussão

Vários componentes do ECM regulam a emigração/migração do NCC. Por exemplo, o AH regula positivamente a migração de^NCC2,15. Curiosamente, um estudo baseado em modelos genéticos murinos de Tmem2, uma hialuronidase de superfície celular, elucidou a exigência de degradação do AH na migração de^NCC9. Os colágenos também são abundantes na MEC ao redor do tubo neural¹⁶. Demonstrou-se que a decorina, um peq.......

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
10cm cell culture dish	CORNING	Cat. 353003
1X PBS	Millipore	Cat. No. BSS-1005-B
2-well culture inserts	ibidi	Cat. No. 80209
Alexa 555-labelled goat anti-mouse IgG	Invitrogen	Cat. A21422	Goat derived anti-mouse secondary antibody
automated cell counter	Bio-Rad	Cat. No. TC20
CELLBANKER	ZENOGEN PHARMA	Cat. 11910	Cell freezing medium
collagen type I	Sigma	Cat. No. 08-115
Complete ES Cell Medium	Millipore	Cat. No. ES-101-B
DAPI	Invitrogen	Cat. 10184322
Dulbecco’s Modified Eagle Medium	Gibco	Cat. 11971025
Fetal Bovine serum	Gibco	Cat. 10270106
fluorescence microscope	Keyence	Cat. No. BZ-X700
Fluoresent labelled HA	PG Research	FAHA-H2
Glas bottom dish	Iwaki	Cat. 11-0602
glutaldehyde	Sigma	Cat. No. G5882
Matrigel	Fisher	Cat. No. CB-40234	The basement-membrane matrix
monoclonal anti-vinculin antibody	Sigma	Cat. No. V9264
mounting media	Dako	S3023
Normal goat serum	Fisher	Cat. 50062Z
O9-1 cells	Millipore	Cat. No. SCC049
Paraformaldehyde	Sigma	Cat. 158127
triethoxysilane	Sigma	Cat. No. 390143
trypsin-EDTA	Millipore	Cat. No. SM-2003-C