تصور مواقع العدوى المبكرة لمرض انفجار الأرز (Magnaporthe oryzae) على الشعير (Hordeum vulgare) باستخدام مجهر أساسي وهاتف ذكي

Summary

هذا بروتوكول مباشر لفحص غمد أوراق الشعير باستخدام الحد الأدنى من الكواشف ومعدات المختبرات الشائعة (بما في ذلك الهاتف الذكي الأساسي). والغرض من ذلك هو تصور عملية العدوى المبكرة لمرض الانفجار في المختبرات دون الوصول إلى معدات الفحص المجهري المتقدمة.

Abstract

إن فهم كيفية تفاعل النباتات ومسببات الأمراض ، وما إذا كان هذا التفاعل يبلغ ذروته في الدفاع أو المرض ، مطلوب لتطوير استراتيجيات أقوى وأكثر استدامة لصحة النبات. وقد أسفر التقدم في الأساليب التي تصور عينات مسببات الأمراض النباتية بشكل أكثر فعالية أثناء العدوى والاستعمار عن أدوات مثل فحص غمد أوراق الأرز ، والذي كان مفيدا في مراقبة العدوى وأحداث الاستعمار المبكرة بين الأرز والممرض الفطري ، Magnaporthe oryzae. يتسبب هذا العامل الممرض الحيوي النصفي في فقدان المرض الشديد في الأرز وأحاديات الفلقة ذات الصلة ، بما في ذلك الدخن والجاودار والشعير ، ومؤخرا القمح. عند إجراء فحص غمد الأوراق بشكل صحيح ، ينتج قسما نباتيا واضحا بصريا ، بسمك عدة طبقات ، مما يسمح للباحثين بإجراء تصوير الخلايا الحية أثناء هجوم العامل الممرض أو إنشاء عينات ثابتة ملطخة بميزات محددة. وقد تخلفت التحقيقات الخلوية التفصيلية في تفاعل الشعير و M. oryzae عن تلك الخاصة بمضيف الأرز ، على الرغم من الأهمية المتزايدة لهذه الحبوب كمصدر غذائي للحيوانات والبشر وكمشروبات مخمرة. تم الإبلاغ هنا عن تطوير مقايسة غمد أوراق الشعير لإجراء دراسات معقدة لتفاعلات M. oryzae خلال أول 48 ساعة بعد التلقيح. مقايسة غمد الأوراق ، بغض النظر عن الأنواع التي تتم دراستها ، حساسة ؛ يوجد بروتوكول يغطي كل شيء ، من ظروف نمو الشعير والحصول على غمد الأوراق ، إلى التلقيح والحضانة وتصوير العامل الممرض على أوراق النبات. يمكن تحسين هذا البروتوكول للفحص عالي الإنتاجية باستخدام شيء بسيط مثل الهاتف الذكي لأغراض التصوير.

Introduction

Magnaporthe oryzae ، فطر انفجار الأرز ، يصيب مجموعة متنوعة من محاصيل الحبوب ، بما في ذلك الشعير والقمح والأرز¹. يسبب هذا العامل الممرض أمراضا مدمرة ويشكل تهديدا عالميا لهذه المحاصيل القيمة ، مما يتسبب في خسارة كاملة للمحاصيل إذا لم تتم السيطرة عليها. تركز العديد من المختبرات حول العالم على مرض انفجار الأرز بسبب تهديده العالمي وسماته كنموذج ممتاز للتفاعلات الفطرية النباتية². لقد تم تسلسله بالكامل ، وتم تحديد علم الوراثة لدورته المعدية ، وخاصة الأحداث المبكرة ، ^3,4. تبدأ دورة الحياة ببوغ ينبت على سطح الورقة ، مكونا بنية اختراق متخصصة تسمى appressorium. يخترق appressorium أنسجة الأوراق ، وتستمر العدوى مع تطور الآفات التي تبدأ عملية التبويض وانتشار المرض⁴. إن منع أي من هذه الأحداث المبكرة من شأنه أن يمنع هذا المرض المدمر بشكل كبير. وبالتالي ، ركزت معظم الأبحاث الحالية حول مرض الانفجار على خطوات العدوى المبكرة ، من الكونيديا النابتة التي تشكل مادة مضغوطة إلى تطوير الخيوط الغازية والمركب البيني الحيوي (BIC) ⁵.

وقد أجريت الكم الهائل من البحوث حول مرض الانفجار في الأرز، على الرغم من أن M. oryzae هو ممرض كبير لمجموعة متنوعة من المحاصيل، والسلالات المتطورة حديثا تظهر كتهديد عالمي للقمح⁶. في حين أن الأرز هو واحد من المحاصيل الأساسية الثلاثة الأولى المستخدمة لإطعام السكان ، إلى جانب القمح والذرة ، فإن الشعير هو رابع حبوب الحبوب من حيث علف الماشية وإنتاج البيرة⁷. مع نمو صناعة البيرة الحرفية ، تنمو القيمة الاقتصادية للشعير. هناك مزايا واضحة لاستخدام M. oryzae والشعير كنظام مرضي لدراسة مرض الأرومة. أولا ، هناك سلالات من M. oryzae تصيب الشعير فقط ، وكذلك السلالات التي يمكن أن تصيب أنواع العشب المتعددة. على سبيل المثال ، يصيب 4091-5-8 الشعير فقط في المقام الأول ، بينما يمكن أن يصيب Guy11 و 70-15 كلا من الشعير والأرز⁸. هذه السلالات متشابهة وراثيا ، وعملية العدوى قابلة للمقارنة⁹. ثانيا ، في ظل ظروف المختبر والدفيئة القياسية ، يكون نمو الشعير أسهل ، لأنه لا يحتوي على المتطلبات المعقدة للأرز (التحكم الموجز في درجة الحرارة ، الرطوبة العالية ، أطياف الضوء المحددة). هناك أيضا تحديات تصوير مع الأرز بسبب الكارهة للماء لسطح الورقة ، والذي لا يظهره الشعير¹⁰.

يقدم هذا البروتوكول طريقة بسيطة لعزل أغلفة أوراق الشعير واستخدامها بفعالية للتحليل المجهري لمراحل العدوى المتعددة ، باستخدام لوازم المختبرات الشائعة وهاتف ذكي لجمع البيانات. هذه الطريقة لفحص غمد أوراق الشعير قابلة للتكيف مع المختبرات في جميع أنحاء العالم لأنها تتطلب الحد الأدنى من الإمدادات ، ومع ذلك توفر صورة واضحة للتفاعل المجهري بين العامل الممرض والخلايا القليلة الأولى التي يصيبها. في حين أن مقايسات الإمراضية ، مثل التلقيح بالرش أو القطيرات ، يمكن أن توفر رؤية كلية لقدرة العامل الممرض على تكوين الآفات ، فإن هذا الفحص يسمح للباحث بتصور خطوات محددة للعدوى المبكرة ، من أحداث ما قبل الاختراق إلى استعمار خلايا البشرة. علاوة على ذلك ، يمكن للباحثين بسهولة مقارنة العدوى بالفطريات البرية بالعدوى بطفرة منخفضة في الفوعة.

Protocol

1. إعداد المواد التجريبية

1. تحضير أجار الشوفان (OMA) عن طريق مزج دقيق الشوفان حتى يصبح مسحوقا ناعما. أضف 25 جم من مسحوق الشوفان و 15 جم من أجار إلى 500 مل من ddH₂O ، والأوتوكلاف في دورة الوسائط (بدلا من ذلك يغلى المزيج لمدة 20 دقيقة). صب الوسائط في أطباق بتري معقمة 60 مم.
   ملاحظة: أنواع الوسائط الأخرى التي تحفز التبويض ، مثل V8 agar ، مقبولة لهذا البروتوكول.
2. مخزون مرشح اللوحة M. oryzae مباشرة على ألواح OMA باستخدام ملقط معقم ، والسماح لهم بتغطية اللوحة بأكملها (9-12 يوما). ضع الألواح في حاضنة النمو عند 25 درجة مئوية مع 12:12 ساعة نهار: دورات ليلية للمساعدة في تحفيز التبويض.
   ملاحظة: تنمو بعض الطفرات بشكل أبطأ وتتطلب رعاية إضافية (على سبيل المثال ، الوسائط الكاملة أولا ، ثم نقلها إلى OMA) ، وقد تستغرق أسبوعا إضافيا لإنتاج ما يكفي من conidia.
3. ازرع بذور الشعير مباشرة (Hordeum vulgare Lacey) في وسط نمو رطب (على سبيل المثال ، وسائط تأصيص بدون تربة) مع 10-15 بذرة لكل وعاء 6 بوصات. ضع الأواني في صواني بها 1-2 بوصة من الماء.
4. اضبط ظروف غرفة نمو الشعير على 22 درجة مئوية لمدة 12 ساعة (ضوء النهار) و 19 درجة مئوية لمدة 12 ساعة (مظلمة) عند رطوبة نسبية 60٪. استمر في الماء من القاع حتى لا تزعج البذور.
5. تنمو الشعير حتى مرحلة الورقة الثانية ، لمدة 14 يوما تقريبا. باستخدام مقص معقم ، قم بقطع نبات الشعير فوق خط التربة مباشرة. باستخدام ملقط وشفرة حلاقة / مشرط ، قم بقص غمد الورقة الأولى المفتوحة طوليا بعناية ، وباستخدام الملقط ، قم بإزالته من قاعدة الورقة الثانية.
   ملاحظة: نظف الأدوات (ملقط ، مشرط ، إلخ) قبل الاستخدام باستخدام 75٪ -80٪ إيثانول. الغمد هو طبقة البشرة الرقيقة التي توفر الارتباط من الورقة الأولى إلى الورقة الثانية (الورقة الثانية إلى الثالثة ، وما إلى ذلك ؛ انظر الشكل 1).
6. ضع الورقة الأولى بشكل مسطح في طبق بتري معقم 60 مم ، يحتوي على منشفة ورقية مبللة للحفاظ على الرطوبة داخل اللوحة. باستخدام المشرط ، اقطع غالبية الورقة الأولى بعيدا عن الغمد ، تاركا 0.5 بوصة فقط من أنسجة الورقة للتركيب.
7. قم بلصق أنسجة الأوراق على قاع لوحة بتري.
   ملاحظة: يتجعد الغمد ، لكن هذا مقبول لأن الغمد المجعد يحمل القطرة المخروطية بسهولة أكبر.
8. اجمع ألواح M. oryzae البالغة من العمر 9-12 يوما ، وأضف 0.5-2 مل من الماء المعقم إلى اللوحات. باستخدام حلقة تلقيح معقمة ، كشط الفطريات برفق لتحرير الكونيديا المرفقة. ماصة بعناية تعليق conidial في أنبوب الطرد المركزي الدقيقة التي تحتوي على قطعة صغيرة من القماش القطني لتصفية أي قطع كبيرة من mycelium من تعليق conidial.
   ملاحظة: يمكن جمع الجراثيم في وقت مبكر من 7 أيام ، إذا كان النمو والأبواغ كافيين للوصول إلى تركيز البوغ المطلوب. لا يمكن أن يتأخر الجمع أكثر من 14 يوما إذا كان العمل مع طفرة وراثية بطيئة النمو
9. تركيز البوغ المطلوب هو 5 × 10 4 جراثيم لكل مل ، ولكن النطاق (1 × 10 ^4-1 × 10 5) مقبول. التركيز العالي جدا يجعل تصوير مواقع العدوى الفردية أمرا صعبا ؛ تمييع تركيز بوغ بالماء المعقم إذا لزم الأمر.
10. ماصة بعناية تعليق conidial داخل غمد ورقة المدرفلة. ابدأ ب 25 ميكرولتر (يمكن زيادة حجم القطرة اعتمادا على حجم الغمد ، حتى 50 ميكرولتر).
    ملاحظة: يوصى بإجراء ثلاث إلى خمس نسخ مكررة لكل سلالة متحولة أو خط شعير. من الشائع حدوث تلف أثناء عملية التلوين ، لذلك يوصى باستخدام نسخ غمد إضافية.
11. املأ أربع أو خمس أكواب سعة 500 مل ب ddH₂O ، وقم بتسخينها حتى تتبخر (باستخدام الميكروويف أو لوح التسخين). توخ الحذر عند تحريك أكواب الماء الساخن. امسك غطاء طبق بتري فوق إحدى الكئوس البخارية لحبس الرطوبة داخل الطبق.
12. قم بتكديس ألواح غمد الأوراق المصابة وأحيطها بالأكواب الساخنة المتبقية. هذا يخلق بيئة رطبة ورطبة ، مطلوبة لتنبت الجراثيم.
    ملاحظة: توخ الحذر عند تبخير الأغطية لضمان عدم ملامسة الماء الساخن أو البخار للأغماد.
13. احم أغلفة الأوراق من الضوء ، وقم بتغطيتها بصندوق مطاطي أو بلاستيكي بلون صلب (أسود مفضل) ، واتركها لمدة 48 ساعة أو النقطة الزمنية المطلوبة للتصوير.
    ملاحظة: صندوق الكرتون غير مناسب لأنه لا يحبس الرطوبة / الرطوبة ويمتص البخار من أكواب الماء الساخن. يعمل الحوض البلاستيكي ذو القفل بشكل جيد لاحتواء الرطوبة ، ويمكن تغطيته بقماش أسود أو حاوية داكنة أكبر لحجب الضوء.

2. عملية تلطيخ

1. تحضير وصمة عار على النحو التالي: تحضير تخفيف جديد من 45 ٪ حمض الخليك وإضافة 0.1 ٪ v / v تريبان الأزرق. القسمة 1 مل من محلول الصبغة في أنابيب الطرد المركزي الدقيقة. اضبط كتلة حرارية أو حمام مائي على 40 درجة مئوية.
2. بعناية ، باستخدام ماكينة حلاقة أو مشرط ، قم بقطع غمد الورقة بعيدا عن الشريط. باستخدام الملقط ، ضع الغمد في أنبوب الطرد المركزي الدقيق وتأكد من غمره بالكامل في محلول الصبغة. اترك 2 ساعة حتى تخترق الصبغة الورقة. تسخين العينات عند 40 درجة مئوية أثناء وقت عملية التلوين في كتلة حرارية أو حمام مائي لزيادة تغلغل الصبغة.
   ملاحظة: تحاول الأغماد أن تطفو في أنبوب الطرد المركزي الصغير ؛ لمنع الجيوب غير الملوثة من أنسجة الأوراق ، املأ الأنابيب ، واغمر الأغماد ، وأغلق الأنبوب. لا تضع أغماد متعددة في نفس أنبوب الطرد المركزي الصغير.
3. اشطف أغلفة الأوراق بعناية في 60٪ جلسرين لإزالة الصبغة الزائدة. ثلاث شطف (كل منها في الجلسرين الطازج) كافية بشكل عام. احتفظ بالغمد في الجلسرين حتى يصبح جاهزا للتركيب على الشرائح.

3. عملية التركيب والتصوير

1. ضع الغمد على شريحة زجاجية نظيفة وأضف بضع قطرات من 60٪ من الجلسرين. باستخدام مجهر تشريح وزوجين من الملقط ، قم بفك الغمد بعناية ، وترك المركز الملقح متجها لأعلى. أمسك الغمد مفتوحا بالملقط ، وضع غطاء الغطاء في الأعلى لمنع الغمد من التجعيد وسد موقع العدوى.
   ملاحظة: غمد الورقة هش للغاية ، ويجب القيام بهذه الخطوات بعناية لمنع تلف الغمد.
2. أغلق غطاء الغطاء باستخدام طلاء الأظافر للتخزين طويل الأجل ، أو الشريط للتخزين على المدى القصير. راقب الشرائح تحت مجهر ضوئي مركب.
3. التقط صورا أساسية باستخدام المجهر والهاتف الخلوي. هنا ، تم التقاط الصور باستخدام حامل محول الهاتف الخلوي وهاتف ذكي. بالنسبة لأجهزة Android ، اضبط تطبيق الكاميرا على الإعدادات التالية: إيقاف التشغيل ، وتعطيل Top Shot ، وتعطيل الضبط التلقائي للسطوع والظلال ، وضبط دقة الصورة على كاملة.
   ملاحظة: يؤدي استخدام تطبيق الكاميرا على الهاتف إلى تقليل عمر البطارية بشكل أسرع من المعتاد ، لذلك يوصى باستخدام طاقة خارجية.
4. بمجرد تركيب الهاتف الخلوي على المجهر ، التقط صورة لمقياس ميكرومتر بهدف الحصول على البيانات. تم الحصول على البيانات في هذه الدراسة عند هدف هوائي 40x 0.65 NA ، وتم تركيب محول الهاتف على عين 10x. اضبط تكبير الهاتف على 2.5x ، وحافظ على تناسقه للحفاظ على حجم بكسل ثابت.
5. يضم مركز الغمد أكبر تركيز للجراثيم ويصيب القمعية. لذلك ، استهدف 9-12 صورة لكل غمد للحصول على أرقام كبيرة للتحليل الإحصائي. يختلف عدد الجراثيم و appressoria بناء على تركيز الجراثيم المطبقة.

4. تقييم الصور وعدها باستخدام ImageJ (فيجي)

1. انقل الصور إلى كمبيوتر يقوم بتشغيل ImageJ (فيجي). لفتح الصور، اسحب الملفات وأفلتها على شريط ImageJ.
2. اضبط مقياس الصور عن طريق تحميل صورة ميكرومتر المرحلة ورسم خط مستقيم بين علامتين للمقياس. افتح Set Scale، واكتب المسافة المعروفة للخط الذي تم قياسه، واكتب وحدة المقياس. على الميكرومتر ، في هذا المثال ، كان أصغر خط 10 ميكرومتر. حدد مربع تعيين عام واضغط على موافق. جميع الصور اللاحقة التي تم تحميلها سيكون لها نفس المقياس.
3. لحساب عدد الضغط، الجراثيم، أو كائنات أخرى، حدد أداة النقطة . بعد ذلك ، افتح مدير عائد الاستثمار. انقر فوق المفتاح T على لوحة المفاتيح لإضافة نقاط إلى القائمة. يمكن حفظ مناطق الاهتمام هذه إذا لزم الأمر وإعادة تحميلها على نفس الصورة.
4. اعتمادا على الأهداف التجريبية ، قم بإجراء قياسات إضافية ، مثل طول البوغ وحجم appressoria وطول الأنبوب الجرثومي.

النتائج

يتم عرض تصوير لسير العمل الأولي لهذه التقنية في الشكل 1. تم حصاد الأغماد من نباتات الشعير "لاسي" الحساسة البالغة من العمر 14 يوما (H. vulgare). تم حصاد الكونيديا من صفائح M. oryzae OMA المبوغة البالغة من العمر 10 أيام ، مع تعليق كونيدي معد باستخدام ddH₂O المعقم لتركيز نهائي ق?...

Discussion

هناك العديد من المقايسات شائعة الاستخدام المتاحة لاختبار سلالات M. oryzae التي توفر رؤية على المستوى العياني لاستجابة عدوى متوافقة أو غير متوافقة ، مثل تلقيح الرش أو القطيرات ، واستخدام أنظمة التصنيف لتحديد أحجام الآفة^13,14. اختبار شائع آخر ل M. oryzae هو ا...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetic acid	Sigma-Aldrich	A6283
Cell phone	Google	Pixel 4A	Any smartphone with a rear facing camera that can be mounted in an a holder will suffice.
Cell phone Microscope adapter	Vankey	B01788LT3S	https://www.amazon.com/Vankey-Cellphone-Telescope-Binocular-Microscope/dp/B01788LT3S/ref=sr_1_2_sspa?keywords=vankey+cellphone+telescope+adapter+mount&qid=1662568182&sprefix= vankey+%2Caps%2C63&sr=8-2 -spons&psc=1&spLa=ZW5jcnlwd GVkUXVhbGlmaWVyPUFKNklBR jlCREJaMEcmZW5jcnlwdGVkSWQ 9QTA2MDMxNjhBRFYxQTMzNk9E M0YmZW5jcnlwdGVkQWRJZD1BM DQxMzAzOTMxNzI1TzE3M1ZGTEI md2lkZ2V0TmFtZT1zcF9hdGYmY WN0aW9uPWNsaWNrUmVkaXJlY3 QmZG9Ob3RMb2dDbGljaz10cnVl
Glycerol	Sigma-Aldrich	G5516
Microscope	AmScope	FM690TC	40x–2500x Trinocular upright epi-fluorescence microscope
Oatmeal old fashioned rolled oats	Quaker	N/A	https://www.amazon.com/Quaker-Oats-Old-Fashioned-Pack/dp/B00IIVBNK4/ref=asc_df_B00IIVBNK4/?tag=hyprod-20&linkCode=df0 &hvadid=312253390021&hvpos= &hvnetw=g&hvrand=98212627704 6839544&hvpone=&hvptwo=&hvq mt=&hvdev=c&hvdvcmdl=&hvlocint =&hvlocphy=9007494&hvtargid =pla-568492637928&psc=1
ProMix BX	ProMix	1038500RG
Rectangular coverglass	Corning	CLS2975245
Slides, microscope	Sigma-Aldrich	S8902
Stage micrometer	OMAX	A36CALM7	0.1 mm and 0.01 mm Microscope calibration slide
Trypan blue	Sigma-Aldrich	T6146