הדמיה של אתרי זיהום מוקדמים של מחלת פיצוץ האורז (Magnaporthe oryzae) על שעורה (Hordeum vulgare) באמצעות מיקרוסקופ בסיסי וטלפון חכם

Summary

זהו פרוטוקול פשוט של בדיקת נדן עלי שעורה באמצעות ריאגנטים מינימליים וציוד מעבדה נפוץ (כולל טלפון חכם בסיסי). המטרה היא לדמיין את תהליך ההדבקה המוקדם של מחלת הפיצוץ במעבדות ללא גישה לציוד מיקרוסקופיה מתקדם.

Abstract

הבנת האופן שבו צמחים ופתוגנים מתקשרים, והאם אינטראקציה זו מגיעה לשיאה בהגנה או במחלה, נדרשת כדי לפתח אסטרטגיות חזקות ובנות קיימא יותר לבריאות הצמח. ההתקדמות בשיטות המדמה בצורה יעילה יותר דגימות פתוגן צמחי במהלך זיהום וקולוניזציה הניבה כלים כגון בדיקת נדן עלי האורז, אשר היה שימושי בניטור זיהומים ואירועי התיישבות מוקדמת בין האורז לבין הפתוגן הפטרייתי, Magnaporthe oryzae. פתוגן המי-ביוטרופי זה גורם לאובדן מחלות חמורות באורז ובמונוקוטים הקשורים אליו, כולל דוחן, שיפון, שעורה ולאחרונה גם חיטה. בדיקת נדן העלים, כאשר היא מבוצעת כראוי, מניבה חתך צמח שקוף אופטית, בעובי מספר שכבות, המאפשר לחוקרים לבצע הדמיה של תאים חיים במהלך מתקפת פתוגן או לייצר דגימות קבועות מוכתמות עבור תכונות ספציפיות. חקירות תאיות מפורטות של האינטראקציה בין שעורה ל-M. אוריזה פיגרו אחרי אלה של פונדקאי האורז, למרות חשיבותו הגוברת של דגן זה כמקור מזון לבעלי חיים ולבני אדם וכמשקאות מותססים. כאן דווח על פיתוח של בדיקת נדן עלי שעורה למחקרים מורכבים של אינטראקציות M. oryzae במהלך 48 השעות הראשונות לאחר החיסון. בדיקת נדן העלים, ללא קשר למין הנחקר, היא עדינה; מסופק פרוטוקול המכסה הכל, החל מתנאי גידול שעורה וקבלת נדן עלה, ועד חיסון, דגירה והדמיה של הפתוגן על עלי הצמח. פרוטוקול זה יכול להיות מותאם לסינון בתפוקה גבוהה באמצעות משהו פשוט כמו טלפון חכם למטרות הדמיה.

Introduction

Magnaporthe oryzae, פטריית פיצוץ האורז, מדביקה מגוון גידולי דגנים, כולל שעורה, חיטה ואורז¹. פתוגן זה גורם למחלות הרסניות ומהווה איום עולמי על גידולים יקרי ערך אלה, וגורם לאובדן יבול מוחלט אם אינו מבוקר. מעבדות רבות ברחבי העולם מתמקדות במחלת פיצוץ האורז בגלל האיום הגלובלי שלה ותכונותיה כמודל מצוין לאינטראקציות צמחיות-פטרייתיות². הוא רוצף במלואו, והגנטיקה של מחזור ההדבקה שלו, במיוחד האירועים המוקדמים, נקבעה ^3,4. מחזור החיים מתחיל בנבג הנובט על פני העלה, ויוצר את מבנה החדירה המיוחד הנקרא אפפרסוריום. האפרסוריום חודר לרקמת העלה, והזיהום ממשיך עם התפתחות נגעים המתחילים בתהליך של נבג ומפיצים מחלה⁴. מניעת כל אחד מהאירועים המוקדמים הללו תעכב באופן דרסטי את המחלה ההרסנית הזו. כתוצאה מכך, רוב המחקר הנוכחי על מחלת הפיצוץ התמקד בשלבי ההדבקה המוקדמים, החל מהקונידיה הנבטה היוצרת אפפרסויום ועד להתפתחות הקורים הפולשניים והקומפלקס הביוטרופי הבין-פנים (BIC)⁵.

המחקר הנרחב על מחלת הפיצוץ נערך באורז, למרות ש-M. oryzae הוא פתוגן משמעותי למגוון גידולים, וזנים חדשים שהתפתחו מתגלים כאיום עולמי על חיטה⁶. בעוד שאורז הוא אחד משלושת הגידולים העיקריים המשמשים להאכלת האוכלוסייה, יחד עם חיטה ותירס, שעורה היא דגן הדגנים הרביעי במונחים של מזון לבעלי חיים וייצור בירה⁷. ככל שתעשיית בירות הקראפט גדלה, כך גדל הערך הכלכלי של שעורה. ישנם יתרונות ברורים של שימוש ב - M. oryzae ושעורה כמערכת פתו-סיסטם לחקר מחלת הפיצוץ. ראשית, ישנם זנים של M. oryzae שמדביקים רק שעורה, כמו גם זנים שיכולים להדביק מיני דשא מרובים. לדוגמה, 4091-5-8 מדביק בעיקר שעורה, בעוד Guy11 ו 70-15 יכול להדביק גם שעורה ואורז⁸. זנים אלה דומים גנטית, ותהליך ההדבקה^{דומה 9.} שנית, בתנאי מעבדה וחממה סטנדרטיים, קל יותר לגדל שעורה, מכיוון שאין לה את הדרישות המסובכות של אורז (בקרת טמפרטורה תמציתית, לחות גבוהה, ספקטרום אור ספציפי). ישנם גם אתגרי הדמיה עם אורז בשל הידרופוביות של פני העלה, אשר שעורה אינה מציגה¹⁰.

פרוטוקול זה מציג שיטה פשוטה לבידוד וניצול יעיל של נדן עלי שעורה לניתוח מיקרוסקופי של שלבי הדבקה מרובים, תוך שימוש בציוד מעבדה משותף ובסמארטפון לאיסוף נתונים. שיטה זו לבדיקת נדן עלי שעורה ניתנת להתאמה למעבדות ברחבי העולם מכיוון שהיא דורשת אספקה מינימלית, ועם זאת מספקת תמונה ברורה של האינטראקציה המיקרוסקופית בין הפתוגן לבין התאים הראשונים שהוא מדביק. בעוד שמבחני פתוגניות, כגון תרסיס או חיסון טיפתי, יכולים לספק מבט מאקרו על יכולתו של הפתוגן ליצור נגעים, בדיקה זו מאפשרת לחוקר לדמיין שלבים ספציפיים של זיהום מוקדם, החל מאירועים טרום חדירה ועד קולוניזציה של תאי אפידרמיס. יתר על כן, חוקרים יכולים בקלות להשוות זיהום עם פטרייה מסוג בר זיהום עם מוטציה מופחתת באלימות.

Protocol

1. הכנת חומרים ניסיוניים

1. הכינו אגר שיבולת שועל (OMA) על ידי ערבוב שיבולת שועל עד לקבלת אבקה דקה. מוסיפים 25 גרם אבקת שיבולת שועל ו-15 גרם אגר ל-500 מ"ל של ddH₂O, ואוטוקלב במחזור המדיה (לחילופין מביאים לרתיחה למשך 20 דקות). יוצקים את המדיה לצלחות פטרי סטריליות בקוטר 60 מ"מ.
   הערה: סוגי מדיה אחרים הגורמים לנבגים, כגון אגר V8, מקובלים עבור פרוטוקול זה.
2. פילטר Plate M. oryzae נצמד ישירות ללוחות OMA באמצעות מלקחיים סטריליים, ומאפשר להם לכסות את הצלחת כולה (9-12 ימים). הניחו את הצלחות באינקובטור צמיחה ב 25 °C עם מחזורי יום:לילה 12:12 שעות כדי לעזור לגרום לנבגים.
   הערה: חלק מהמוטנטים גדלים לאט יותר ודורשים טיפול נוסף (למשל, מדיה מלאה תחילה, ואז העברה ל- OMA), ויכול לקחת שבוע נוסף כדי לייצר מספיק קונידיה.
3. שתול ישירות זרעי שעורה (Hordeum vulgare Lacey) במצע גידול לח (למשל, מצע שתילה ללא אדמה) עם 10-15 זרעים לעציץ בגודל 6 אינץ'. מניחים את הסירים במגשים עם 1-2 אינץ' מים.
4. הגדר את תנאי תא גידול השעורה כ- 22 ° C למשך 12 שעות (אור יום) ו- 19 ° C למשך 12 שעות (כהה) בלחות יחסית של 60%. ממשיכים להשקות מלמטה כדי לא להפריע לזרעים.
5. מגדלים את השעורה עד לשלב העלה השני, בערך במשך 14 יום. בעזרת מספריים סטריליים, חותכים את צמח השעורה ממש מעל קו הקרקע. בעזרת מלקחיים ותער/אזמל חותכים בזהירות את מעטפת העלה הראשון הפתוח לאורך, ובעזרת המלקחיים מסירים אותו מבסיס העלה השני.
   הערה: יש לנקות את הכלים (מלקחיים, אזמל וכו') לפני השימוש עם אתנול 75%-80%. הנדן הוא שכבת האפידרמיס הדקה שמספקת את החיבור מהעלה הראשון לשני (עלה שני לשלישי וכו'; ראו איור 1).
6. מניחים את העלה הראשון שטוח בכלי פטרי סטרילי בקוטר 60 מ"מ, המכיל מגבת נייר רטובה כדי לשמור על לחות בתוך הצלחת. בעזרת האזמל, חותכים את רוב העלה הראשון הרחק מהנדן, ומשאירים רק 0.5 אינץ' מרקמת העלה להרכבה.
7. הדביקו את רקמת העלה לתחתית צלחת הפטרי.
   הערה: הנדן מתעקל, אך זה מקובל מכיוון שנדן מסולסל מחזיק את הטיפה הקונידיאלית ביתר קלות.
8. אספו צלחות M. oryzae בנות 9-12 יום, והוסיפו 0.5-2 מ"ל מים סטריליים לצלחות. בעזרת לולאת חיסון סטרילית, מגרדים בעדינות את התפטיר כדי לשחרר את הקונידיה. בזהירות פיפטה את התרחיף conidial לתוך צינור microcentrifuge המכיל חתיכה קטנה של בד גבינה כדי לסנן כל חתיכות גדולות של תפטיר מן המתלה conidial.
   הערה: ניתן לאסוף נבגים כבר 7 ימים, אם הצמיחה והנבגים מספיקים כדי להגיע לריכוז הנבגים הרצוי. האיסוף יכול להתעכב לא יותר מ -14 יום אם עובדים עם מוטציה גנטית הגדלה לאט
9. ריכוז הנבגים הרצוי הוא 5 x 10 4 נבגים למ"ל, אך טווח (1 x 10 ^4-1 x 10 5) מקובל. ריכוז גבוה מדי הופך את הדמיה של אתרי זיהום בודדים למאתגרת; מדללים את ריכוז הנבגים במים סטריליים במידת הצורך.
10. בזהירות פיפטה את המתלה הקונידיאלי בתוך נדן העלה המגולגל. התחל עם 25 μL (ניתן להגדיל את גודל הטיפה בהתאם לגודל הנדן, עד 50 μL).
    הערה: מומלץ לבצע שלושה עד חמישה שכפולים של כל זן מוטנטי או קו שעורה. זה נפוץ עבור נזק להתרחש במהלך תהליך הצביעה, ולכן מומלץ שכפול נדן נוסף.
11. ממלאים ארבע או חמש כוסות של 500 מ"ל ב-ddH₂O, ומחממים עד לאידוי (באמצעות מיקרוגל או פלטה חשמלית). יש לנקוט משנה זהירות בעת הזזת כוסות המים החמים. החזיקו את מכסה צלחת הפטרי מעל אחת הכוסות המהבילות כדי ללכוד לחות בתוך הצלחת.
12. ערמו את צלחות נדן העלים הנגועות והקיפו אותן בכוסות החמות שנותרו. זה יוצר סביבה לחה ולחה, הנדרשת לנבגים לנבוט.
    הערה: יש לנקוט משנה זהירות בעת אידוי העפעפיים כדי להבטיח שלא ייגעו מים חמים או אדים בנדן.
13. הגנו על נדן העלה מפני אור, כסו בקופסת גומי או פלסטיק בצבע אחיד (שחור מועדף), והשאירו למשך 48 שעות או נקודת הזמן הרצויה להדמיה.
    הערה: קופסת קרטון אינה מתאימה מכיוון שהיא אינה נועלת את הלחות/לחות וסופגת את האדים מכוסות המים החמים. גיגית פלסטיק ננעלת פועלת היטב להכלת הלחות, וניתן לכסות אותה בבד שחור או במיכל כהה גדול יותר כדי לחסום את האור.

2. תהליך צביעה

1. הכינו את הכתם באופן הבא: הכינו דילול טרי של 45% חומצה אצטית והוסיפו 0.1% v/v טריפאן כחול. Aliquot 1 מ"ל של תמיסת הצבע לתוך צינורות מיקרוצנטריפוגה. הגדר בלוק חום או אמבט מים ל 40 ° C.
2. בזהירות, באמצעות סכין גילוח או אזמל, לחתוך את נדן העלה מן הקלטת. בעזרת מלקחיים, הניחו את הנדן לתוך צינור המיקרוצנטריפוגה וודאו שהוא שקוע לחלוטין בתמיסת הצבע. המתינו שעתיים עד שהצבע יחדור לעלה. חממו את הדגימות בטמפרטורה של 40 מעלות צלזיוס בזמן תהליך הצביעה בבלוק חום או באמבט מים כדי להגביר את חדירת הצבע.
   הערה: הנדן מנסה לצוף בצינור המיקרו-צנטריפוגה; כדי למנוע כיסים לא מוכתמים של רקמת עלה, מלא את הצינורות, שקע את הנדן וסגור את הצינור. אין לשים נדנים מרובים באותו צינור מיקרו-צנטריפוגה.
3. שטפו בזהירות את נדן העלים ב-60% גליצרול כדי להסיר את הצבע העודף. שלוש שטיפות (כל אחת בגליצרול טרי) מספיקות בדרך כלל. יש לשמור את הנדן בגליצרול עד שיהיה מוכן להרכבה על מגלשות.

3. תהליך הרכבה והדמיה

1. הניחו את הנדן על מגלשת זכוכית נקייה והוסיפו כמה טיפות של 60% גליצרול. בעזרת מיקרוסקופ מנתח ושני זוגות מלקחיים, פותחים בזהירות את הנדן ומשאירים את המרכז המחוסן פונה כלפי מעלה. החזיקו את הנדן פתוח עם המלקחיים, והניחו את הכיסוי מעליו כדי למנוע מהנדן להסתלסל ולחסום את אתר הזיהום.
   הערה: נדן העלה שביר מאוד, וצעדים אלה צריכים להיעשות בזהירות כדי למנוע נזק לנדן.
2. אטמו את הכיסוי באמצעות לק לאחסון לטווח ארוך, או סרט דבק לאחסון לטווח קצר. צפו בשקופיות תחת מיקרוסקופ אור מורכב.
3. צלם תמונות בסיסיות באמצעות מיקרוסקופ וטלפון סלולרי. כאן, התמונות צולמו עם תושבת מתאם טלפון סלולרי וטלפון חכם. עבור מכשירי Android, התאם את יישום המצלמה להגדרות הבאות: מבזק כבוי, השבת את Top Shot, השבת התאמה אוטומטית של בהירות וצללים והגדר את רזולוציית התמונה למלאה.
   הערה: השימוש ביישום המצלמה בטלפון מקצר את חיי הסוללה מהר מהרגיל, ולכן מומלץ להשתמש במתח חיצוני.
4. לאחר הרכבת הטלפון הסלולרי על המיקרוסקופ, צלם תמונה של מיקרומטר בקנה מידה במטרה שתשמש להשגת הנתונים. הנתונים במחקר זה נרכשו ביעד אוויר של 40x 0.65 NA, ומתאם הטלפון הותקן על עיני 10x. כוונן את גודל הטלפון ל- 2.5x ושמור על עקביות כדי לשמור על גודל פיקסלים קבוע.
5. במרכז הנדן נמצא הריכוז הגדול ביותר של נבגים ומדביקים; לכן, יש לשאוף ל-9-12 תמונות של כל נדן כדי לקבל מספרים משמעותיים לניתוח סטטיסטי. מספר הנבגים והאפרסוריה משתנה בהתאם לריכוז הנבגים המופעלים.

4. הערכה וספירה של תמונות באמצעות ImageJ (FIJI)

1. העבר את התמונות למחשב שבו פועל ImageJ (FIJI). כדי לפתוח את התמונות, גרור ושחרר את הקבצים בסרגל ImageJ.
2. הגדר את קנה המידה של התמונות על-ידי טעינת תמונת המיקרומטר של הבמה וציור קו ישר בין שני סימונים עבור קנה המידה. פתח את 'קבע קנה מידה', הקלד את 'מרחק ידוע' עבור הקו שנמדד והקלד ביחידה של קנה המידה. במיקרומטר, בדוגמה זו, הקו הקטן ביותר היה 10 מיקרומטר. סמן את הגדר גלובל תיבה ולחץ על אישור. כל התמונות הבאות שנטענו יהיו באותו קנה מידה.
3. לספירת דפרסים, נבגים או עצמים אחרים, בחרו בכלי נקודה . לאחר מכן, פתח את מנהל החזר ההשקעה. לחץ על מקש T בלוח המקשים כדי להוסיף נקודות לרשימה. ניתן לשמור אזורי עניין אלה במידת הצורך ולטעון אותם מחדש על אותה תמונה.
4. בהתאם למטרות הניסוי, בצע מדידות נוספות, כגון אורך נבג, גודל אפרסוריה ואורך צינור נבט.

תוצאות

תיאור של זרימת העבודה הראשונית עבור טכניקה זו מוצג באיור 1. הנדן נקטף מצמחי שעורה רגישים "לייסי" בני 14 יום (H. vulgare). הקונידיה נקטפה מצלחות M. oryzae OMA בנות 10 ימים, עם תרחיף קונידיאלי שהוכן באמצעות ddH₂O סטרילי לריכוז סופי של 5 x 10⁴ נבגים למ"ל. תרחיף החיסון הוחל ישי?...

Discussion

ישנן בדיקות נפוצות רבות הזמינות לבדיקת זני M. oryzae המספקות ראייה ברמה מקרוסקופית של תגובת זיהום תואמת או לא תואמת, כגון חיסוני תרסיס או טיפות, ושימוש במערכות דירוג לכימות גדלים^13,14. בדיקה נפוצה נוספת עבור M. oryzae היא לבדוק את יכולתו של הפתוגן ליצור את מ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetic acid	Sigma-Aldrich	A6283
Cell phone	Google	Pixel 4A	Any smartphone with a rear facing camera that can be mounted in an a holder will suffice.
Cell phone Microscope adapter	Vankey	B01788LT3S	https://www.amazon.com/Vankey-Cellphone-Telescope-Binocular-Microscope/dp/B01788LT3S/ref=sr_1_2_sspa?keywords=vankey+cellphone+telescope+adapter+mount&qid=1662568182&sprefix= vankey+%2Caps%2C63&sr=8-2 -spons&psc=1&spLa=ZW5jcnlwd GVkUXVhbGlmaWVyPUFKNklBR jlCREJaMEcmZW5jcnlwdGVkSWQ 9QTA2MDMxNjhBRFYxQTMzNk9E M0YmZW5jcnlwdGVkQWRJZD1BM DQxMzAzOTMxNzI1TzE3M1ZGTEI md2lkZ2V0TmFtZT1zcF9hdGYmY WN0aW9uPWNsaWNrUmVkaXJlY3 QmZG9Ob3RMb2dDbGljaz10cnVl
Glycerol	Sigma-Aldrich	G5516
Microscope	AmScope	FM690TC	40x–2500x Trinocular upright epi-fluorescence microscope
Oatmeal old fashioned rolled oats	Quaker	N/A	https://www.amazon.com/Quaker-Oats-Old-Fashioned-Pack/dp/B00IIVBNK4/ref=asc_df_B00IIVBNK4/?tag=hyprod-20&linkCode=df0 &hvadid=312253390021&hvpos= &hvnetw=g&hvrand=98212627704 6839544&hvpone=&hvptwo=&hvq mt=&hvdev=c&hvdvcmdl=&hvlocint =&hvlocphy=9007494&hvtargid =pla-568492637928&psc=1
ProMix BX	ProMix	1038500RG
Rectangular coverglass	Corning	CLS2975245
Slides, microscope	Sigma-Aldrich	S8902
Stage micrometer	OMAX	A36CALM7	0.1 mm and 0.01 mm Microscope calibration slide
Trypan blue	Sigma-Aldrich	T6146