Visualizando os locais de infecção precoce da doença da explosão do arroz (Magnaporthe oryzae) em cevada (Hordeum vulgare) usando um microscópio básico e um smartphone

Resumo

Este é um protocolo simples de um ensaio de bainha de folha de cevada usando reagentes mínimos e equipamentos de laboratório comuns (incluindo um smartphone básico). O objetivo é visualizar o processo de infecção precoce da doença blástica em laboratórios sem acesso a equipamentos avançados de microscopia.

Resumo

Entender como plantas e patógenos interagem, e se essa interação culmina em defesa ou doença, é necessário para desenvolver estratégias mais fortes e sustentáveis para a saúde das plantas. Avanços em métodos que capturam amostras de fitopatógenos de forma mais eficaz durante a infecção e colonização produziram ferramentas como o ensaio da bainha foliar do arroz, que tem sido útil no monitoramento da infecção e dos eventos de colonização precoce entre o arroz e o patógeno fúngico, Magnaporthe oryzae. Este patógeno hemibiotrófico causa severa perda de doenças em arroz e monocotiledôneas relacionadas, incluindo milheto, centeio, cevada e, mais recentemente, trigo. O ensaio de bainha foliar, quando realizado corretamente, produz uma seção opticamente clara da planta, com várias camadas de espessura, o que permite aos pesquisadores realizar imagens de células vivas durante o ataque do patógeno ou gerar amostras fixas coradas para características específicas. Investigações celulares detalhadas sobre a interação cevada-M. oryzae têm ficado atrás daquelas do hospedeiro arroz, apesar da crescente importância deste grão como fonte de alimento para animais e humanos e como bebidas fermentadas. Relata-se aqui o desenvolvimento de um ensaio de bainha foliar de cevada para estudos intrincados de interações de M. oryzae durante as primeiras 48 h pós-inoculação. O ensaio da bainha foliar, independentemente da espécie estudada, é delicado; É fornecido um protocolo que abrange tudo, desde as condições de crescimento da cevada e obtenção de uma bainha foliar, até a inoculação, incubação e imagem do patógeno nas folhas das plantas. Esse protocolo pode ser otimizado para triagem de alto rendimento usando algo tão simples quanto um smartphone para fins de imagem.

Introdução

Magnaporthe oryzae, o fungo da brusone do arroz, infecta uma variedade de culturas de grãos, incluindo cevada, trigo e arroz¹. Este patógeno causa doenças devastadoras e representa uma ameaça mundial para essas valiosas culturas, causando perda completa de safra se não for controlado. Muitos laboratórios ao redor do mundo se concentram na doença da brusone do arroz devido à sua ameaça global e seus atributos como um excelente modelo para interações planta-fungos². Foi completamente sequenciada, e a genética de seu ciclo infeccioso, particularmente os eventos iniciais, foi estabelecida

Protocolo

1. Preparação de materiais experimentais

1. Prepare o ágar aveia (OMA) misturando a aveia até obter um pó fino. Adicionar 25 g de aveia em pó e 15 g de ágar a 500 mL de ddH₂O e autoclave em ciclo de meio (alternativamente, deixe ferver por 20 min). Despeje o meio em placas de Petri estéreis de 60 mm.
   NOTA: Outros tipos de meios que induzem esporulação, como ágar V8, são aceitáveis para este protocolo.
2. A placa M. oryzae filtra diretamente nas placas OMA usando pinças estéreis e permite que cubram toda a placa (9-12 dias). Coloque as placas em uma incubadora de crescimento a 25 °C com ciclos dia:noite de 12:12 h p....

Resultados

Uma representação do fluxo de trabalho inicial para essa técnica é exibida na Figura 1. As bainhas foram colhidas de plantas de cevada (H. vulgare) suscetíveis aos 14 dias de idade. Os conídios foram colhidos de placas de OMA esporulantes de M. oryzae com 10 dias de idade, com uma suspensão de conídios preparada com ddH₂O estéril para uma concentração final de 5 x 10⁴ esporos por mL. A suspensão de inóculo foi aplicada diretamente nas bain.......

Discussão

Existem muitos ensaios comumente utilizados disponíveis para testar cepas de M. oryzae que fornecem uma visão em nível macroscópico de uma resposta infecciosa compatível ou incompatível, como inoculações em spray ou gotículas, e o uso de sistemas de classificação para quantificar o tamanho das lesões^13,14. Outro ensaio comum para M. oryzae é testar a capacidade do patógeno de formar sua estrutura de penetração especializada, o ap.......

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetic acid	Sigma-Aldrich	A6283
Cell phone	Google	Pixel 4A	Any smartphone with a rear facing camera that can be mounted in an a holder will suffice.
Cell phone Microscope adapter	Vankey	B01788LT3S	https://www.amazon.com/Vankey-Cellphone-Telescope-Binocular-Microscope/dp/B01788LT3S/ref=sr_1_2_sspa?keywords=vankey+cellphone+telescope+adapter+mount&qid=1662568182&sprefix= vankey+%2Caps%2C63&sr=8-2 -spons&psc=1&spLa=ZW5jcnlwd GVkUXVhbGlmaWVyPUFKNklBR jlCREJaMEcmZW5jcnlwdGVkSWQ 9QTA2MDMxNjhBRFYxQTMzNk9E M0YmZW5jcnlwdGVkQWRJZD1BM DQxMzAzOTMxNzI1TzE3M1ZGTEI md2lkZ2V0TmFtZT1zcF9hdGYmY WN0aW9uPWNsaWNrUmVkaXJlY3 QmZG9Ob3RMb2dDbGljaz10cnVl
Glycerol	Sigma-Aldrich	G5516
Microscope	AmScope	FM690TC	40x–2500x Trinocular upright epi-fluorescence microscope
Oatmeal old fashioned rolled oats	Quaker	N/A	https://www.amazon.com/Quaker-Oats-Old-Fashioned-Pack/dp/B00IIVBNK4/ref=asc_df_B00IIVBNK4/?tag=hyprod-20&linkCode=df0 &hvadid=312253390021&hvpos= &hvnetw=g&hvrand=98212627704 6839544&hvpone=&hvptwo=&hvq mt=&hvdev=c&hvdvcmdl=&hvlocint =&hvlocphy=9007494&hvtargid =pla-568492637928&psc=1
ProMix BX	ProMix	1038500RG
Rectangular coverglass	Corning	CLS2975245
Slides, microscope	Sigma-Aldrich	S8902
Stage micrometer	OMAX	A36CALM7	0.1 mm and 0.01 mm Microscope calibration slide
Trypan blue	Sigma-Aldrich	T6146