Visualisation des sites d’infection précoce de la maladie du souffle du riz (Magnaporthe oryzae) sur l’orge (Hordeum vulgare) à l’aide d’un microscope de base et d’un smartphone

Résumé

Il s’agit d’un protocole simple d’essai de gaine de feuilles d’orge utilisant un minimum de réactifs et un équipement de laboratoire commun (y compris un smartphone de base). L’objectif est de visualiser le processus d’infection précoce de la maladie blastique dans des laboratoires sans accès à un équipement de microscopie avancé.

Résumé

Comprendre comment les plantes et les agents pathogènes interagissent, et si cette interaction aboutit à la défense ou à la maladie, est nécessaire pour développer des stratégies plus solides et plus durables pour la santé des plantes. Les progrès des méthodes qui permettent d’imager plus efficacement les échantillons d’agents phytopathogènes pendant l’infection et la colonisation ont donné lieu à des outils tels que le test de la gaine de feuille de riz, qui a été utile pour surveiller l’infection et les événements de colonisation précoce entre le riz et l’agent pathogène fongique, Magnaporthe oryzae. Cet agent pathogène hémi-biotrophe provoque de graves pertes de maladies dans le riz et les monocotylédones apparentées, y compris le mil, le seigle, l’orge et, plus récemment, le blé. Le test de la gaine foliaire, lorsqu’il est effectué correctement, donne une section de plante optiquement claire, plusieurs couches d’épaisseur, ce qui permet aux chercheurs d’effectuer une imagerie de cellules vivantes lors d’une attaque pathogène ou de générer des échantillons fixes colorés pour des caractéristiques spécifiques. Les études cellulaires détaillées sur l’interaction orge-M. oryzae ont pris du retard par rapport à celles de l’hôte du riz, malgré l’importance croissante de cette céréale comme source de nourriture pour les animaux et les humains et comme boissons fermentées. Il est rapporté ici le développement d’un test de gaine de feuilles d’orge pour des études complexes des interactions de M. oryzae au cours des 48 premières heures suivant l’inoculation. Le dosage de la gaine foliaire, quelle que soit l’espèce étudiée, est délicat; Un protocole qui couvre tout, des conditions de croissance de l’orge à l’obtention d’une gaine foliaire, en passant par l’inoculation, l’incubation et l’imagerie de l’agent pathogène sur les feuilles des plantes. Ce protocole peut être optimisé pour le dépistage à haut débit en utilisant quelque chose d’aussi simple qu’un smartphone à des fins d’imagerie.

Introduction

Magnaporthe oryzae, le champignon de l’explosion du riz, infecte un assortiment de cultures céréalières, y compris l’orge, le blé et le riz¹. Cet agent pathogène provoque des maladies dévastatrices et constitue une menace mondiale pour ces cultures précieuses, causant une perte complète de récoltes si elle n’est pas contrôlée. De nombreux laboratoires à travers le monde se concentrent sur la maladie du riz en raison de sa menace mondiale et de ses attributs en tant qu’excellent modèle pour les interactions plantes-champignons². Il a été entièrement séquencé et la génétique de son cycle infectieux, en particulier les premiers événements, a été établie ^3,4. Le cycle de vie commence par la germination d’une spore sur la surface d’une feuille, formant la structure de pénétration spécialisée appelée appressorium. L’appressorium pénètre dans le tissu foliaire et l’infection se poursuit avec le développement de lésions qui déclenchent le processus de sporulation et propagent la maladie⁴. La prévention de l’un de ces événements précoces inhiberait considérablement cette maladie dévastatrice. Par conséquent, la plupart des recherches actuelles sur la maladie blastique se sont concentrées sur les étapes précoces de l’infection, des conidies germées formant un appressorium au développement des hyphes invasifs et du complexe interfacial biotrophique (BIC)⁵.

De nombreuses recherches sur la maladie des blastes ont été menées sur le riz, même si M. oryzae est un agent pathogène important pour diverses cultures, et que de nouvelles souches émergent comme une menace mondiale pour le blé⁶. Alors que le riz est l’une des trois principales cultures de base utilisées pour nourrir la population, avec le blé et le maïs, l’orge est la quatrième céréale en termes d’alimentation du bétail et de production de bière⁷. À mesure que l’industrie de la bière artisanale se développe, la valeur économique de l’orge augmente également. Il y a des avantages distincts à utiliser M. oryzae et l’orge comme pathosystème pour étudier la maladie blastique. Tout d’abord, il existe des souches de M. oryzae qui n’infectent que l’orge, ainsi que des souches qui peuvent infecter plusieurs espèces de graminées. Par exemple, 4091-5-8 n’infecte principalement que l’orge, tandis que Guy11 et 70-15 peuvent infecter à la fois l’orge et le riz⁸. Ces souches sont génétiquement similaires et le processus d’infection est comparable⁹. Deuxièmement, dans des conditions standard de laboratoire et de serre, l’orge est plus facile à cultiver, car elle n’a pas les exigences compliquées du riz (contrôle concis de la température, humidité élevée, spectres lumineux spécifiques). Il y a aussi des problèmes d’imagerie avec le riz en raison de l’hydrophobicité de la surface des feuilles, dont l’orge ne présente pas¹⁰.

Ce protocole présente une méthode simple pour isoler et utiliser efficacement les gaines de feuilles d’orge pour l’analyse microscopique de plusieurs stades d’infection, en utilisant des fournitures de laboratoire courantes et un smartphone pour la collecte de données. Cette méthode pour le dosage de la gaine des feuilles d’orge est adaptable aux laboratoires du monde entier car elle nécessite un minimum de fournitures, tout en fournissant une image claire de l’interaction microscopique entre l’agent pathogène et les premières cellules qu’il infecte. Alors que les tests de pathogénicité, tels que l’inoculation par pulvérisation ou par gouttelettes, peuvent fournir une vue macro de la capacité de l’agent pathogène à former des lésions, ce test permet au chercheur de visualiser des étapes spécifiques de l’infection précoce, des événements de prépénétration à la colonisation des cellules épidermiques. En outre, les chercheurs peuvent facilement comparer l’infection par le champignon de type sauvage à l’infection par un mutant réduit en virulence.

Protocole

1. Préparation du matériel expérimental

1. Préparer la gélose à l’avoine (OMA) en mélangeant la farine d’avoine jusqu’à ce qu’elle soit une poudre fine. Ajouter 25 g de poudre d’avoine et 15 g de gélose à 500 mL de_ddH2O, et autoclaver sur le cycle du média (ou porter à ébullition pendant 20 min). Versez le média dans des boîtes de Petri stériles de 60 mm.
   REMARQUE: D’autres types de supports qui induisent la sporulation, tels que la gélose V8, sont acceptables pour ce protocole.
2. La plaque M. oryzae filtre les stocks directement sur les plaques OMA à l’aide de pinces stériles et leur permet de couvrir toute la plaque (9-12 jours). Placer les plaques dans un incubateur de croissance à 25 °C avec des cycles jour-nuit de 12h12 pour aider à induire la sporulation.
   REMARQUE : Certains mutants se développent plus lentement et nécessitent des soins supplémentaires (p. ex., un milieu complet d’abord, puis un transfert à l’OMA), et peuvent prendre une semaine supplémentaire pour produire suffisamment de conidies.
3. Plantez directement les graines d’orge (Hordeum vulgare Lacey) dans un milieu de croissance humide (p. ex., terreau sans sol) avec 10 à 15 graines par pot de 6 pouces. Placez les pots dans des plateaux avec 1-2 po d’eau.
4. Réglez les conditions de la chambre de croissance de l’orge à 22 °C pendant 12 h (lumière du jour) et à 19 °C pendant 12 h (obscurité) à 60 % d’humidité relative. Continuez à arroser par le fond pour ne pas déranger les graines.
5. Cultivez l’orge jusqu’au deuxième stade foliaire, environ pendant 14 jours. À l’aide de ciseaux stériles, coupez le plant d’orge juste au-dessus de la ligne de sol. À l’aide d’une pince et d’un rasoir / scalpel, coupez soigneusement la gaine foliaire de la première feuille ouverte longitudinalement et, à l’aide de la pince, retirez-la de la base de la deuxième feuille.
   REMARQUE: Nettoyez les outils (pinces, scalpel, etc.) avant de les utiliser avec de l’éthanol à 75% à 80%. La gaine est la fine couche d’épiderme qui assure la fixation de la première à la deuxième feuille (deuxième à troisième feuille, etc.; voir Figure 1).
6. Placez la première feuille à plat dans une boîte de Pétri stérile de 60 mm, contenant une serviette en papier humide pour maintenir l’humidité à l’intérieur de la plaque. À l’aide du scalpel, coupez la majorité de la première feuille loin de la gaine, ne laissant que 0,5 po du tissu foliaire pour le montage.
7. Collez le tissu foliaire au fond de la plaque de Petri.
   REMARQUE: La gaine s’enroule, mais cela est acceptable car une gaine enroulée retient la gouttelette conidiale plus facilement.
8. Prélever des plaques de M. oryzae âgées de 9 à 12 jours et ajouter 0,5 à 2 ml d’eau stérile dans les assiettes. À l’aide d’une boucle d’inoculation stérile, grattez doucement le mycélium pour libérer les conidies attachées. Pipeter soigneusement la suspension conidiale dans un tube microcentrifuge contenant un petit morceau d’étamine pour filtrer les gros morceaux de mycélium de la suspension conidiale.
   NOTE: Les spores peuvent être collectées dès 7 jours, si la croissance et la sporulation sont suffisantes pour atteindre la concentration de spores souhaitée. La collecte ne peut pas être retardée de plus de 14 jours si vous travaillez avec un mutant génétique à croissance lente
9. La concentration de spores souhaitée est de 5 x 10 4 spores par mL, mais une plage (1 x 10 ^4-1 x 10 5) est acceptable. Une concentration trop élevée rend difficile l’imagerie des sites d’infection individuels; Diluer la concentration de spores avec de l’eau stérile si nécessaire.
10. Pipeter soigneusement la suspension conidiale à l’intérieur de la gaine de feuilles roulées. Commencez avec 25 μL (la taille des gouttelettes peut être augmentée en fonction de la taille de la gaine, jusqu’à 50 μL).
    REMARQUE: Il est recommandé d’effectuer trois à cinq répétitions de chaque souche mutante ou lignée d’orge. Il est fréquent que des dommages se produisent pendant le processus de coloration, c’est pourquoi des répliques de gaine supplémentaires sont recommandées.
11. Remplir quatre ou cinq béchers de 500 ml avec du ddH₂O et chauffer jusqu’à cuisson à la vapeur (à l’aide d’un four à micro-ondes ou d’une plaque chauffante). Soyez prudent lorsque vous déplacez les béchers d’eau chaude. Tenez le couvercle de la boîte de Petri sur l’un des béchers fumants pour emprisonner l’humidité à l’intérieur de la plaque.
12. Empilez les plaques de gaine de feuilles infectées et entourez-les des béchers chauds restants. Cela crée un environnement humide et humide, nécessaire à la germination des spores.
    REMARQUE: Soyez prudent lorsque vous faites cuire les couvercles à la vapeur pour vous assurer qu’aucune eau chaude ou vapeur ne touche les gaines.
13. Protégez les gaines de feuilles de la lumière, couvrez d’une boîte en caoutchouc ou en plastique de couleur unie (de préférence noire) et laissez reposer pendant 48 heures ou le point de temps souhaité pour l’imagerie.
    REMARQUE: Une boîte en carton ne convient pas car elle ne bloque pas l’humidité et absorbe la vapeur des béchers d’eau chaude. Une baignoire en plastique verrouillable fonctionne bien pour contenir l’humidité, et elle peut être recouverte de tissu noir ou d’un récipient sombre plus grand pour bloquer la lumière.

2. Processus de coloration

1. Préparer la coloration comme suit: préparer une dilution fraîche de 45% d’acide acétique et ajouter 0,1% v/v de bleu de trypan. Aliquote 1 mL de la solution de colorant dans des tubes microcentrifugés. Réglez un bloc de chaleur ou un bain-marie à 40 °C.
2. Avec précaution, à l’aide d’un rasoir ou d’un scalpel, coupez la gaine de feuilles loin du ruban. À l’aide de pinces, placez la gaine dans le tube de microcentrifugation et assurez-vous qu’elle est complètement immergée dans la solution de colorant. Laisser 2 h pour que le colorant pénètre dans la feuille. Chauffer les échantillons à 40 °C pendant le temps de coloration dans un bloc thermique ou un bain-marie pour augmenter la pénétration du colorant.
   NOTE: Les gaines essaient de flotter dans le tube de microcentrifugeuse; Pour éviter les poches non tachées de tissu foliaire, remplissez les tubes, immergez les gaines et fermez le tube. Ne mettez pas plusieurs gaines dans le même tube de microcentrifugeuse.
3. Rincez soigneusement les gaines de feuilles dans du glycérol à 60% pour éliminer le colorant supplémentaire. Trois rinçages (chacun au glycérol frais) sont généralement suffisants. Gardez la gaine dans du glycérol jusqu’à ce qu’elle soit prête à monter sur des lames.

3. Processus de montage et d’imagerie

1. Placez la gaine sur une lame de verre propre et ajoutez quelques gouttes de glycérol à 60%. À l’aide d’un microscope à dissection et de deux paires de pinces, déroulez soigneusement la gaine en laissant le centre inoculé orienté vers le haut. Tenez la gaine ouverte avec la pince et placez la lamelle de couverture sur le dessus pour empêcher la gaine de s’enrouler et de bloquer le site d’infection.
   REMARQUE: La gaine foliaire est très fragile et ces étapes doivent être effectuées avec soin pour éviter d’endommager la gaine.
2. Scellez le couvercle à l’aide de vernis à ongles pour un stockage à long terme ou de ruban adhésif pour un stockage à court terme. Observez les lames sous un microscope à lumière composée.
3. Prenez des images de base à l’aide d’un microscope et d’un téléphone cellulaire. Ici, les images ont été prises avec un support d’adaptateur de téléphone portable et un smartphone. Pour les appareils Android, réglez l’application appareil photo aux paramètres suivants: flash éteint, désactiver Top Shot, désactiver le réglage automatique de la luminosité et des ombres et définir la résolution de la photo sur complète.
   REMARQUE: L’utilisation de l’application appareil photo sur le téléphone diminue la durée de vie de la batterie plus rapidement que d’habitude, il est donc recommandé d’avoir une alimentation externe.
4. Une fois le téléphone cellulaire monté sur le microscope, prenez une image d’un micromètre à l’échelle avec l’objectif qui sera utilisé pour acquérir les données. Les données de cette étude ont été acquises à un objectif d’air 40x 0,65 NA, et l’adaptateur téléphonique a été monté sur un oculaire 10x. Ajustez le zoom du téléphone à 2,5x et maintenez-le cohérent pour maintenir une taille de pixel constante.
5. Le centre de la gaine abrite la plus grande concentration de spores et d’appressoires infectantes; Par conséquent, visez 9 à 12 images de chaque gaine pour obtenir des nombres significatifs pour l’analyse statistique. Le nombre de spores et d’appressoires varie en fonction de la concentration de spores appliquées.

4. Évaluation et comptage d’images à l’aide d’ImageJ (FIJI)

1. Transférez les images sur un ordinateur exécutant ImageJ (FIJI). Pour ouvrir les images, faites glisser et déposez les fichiers sur la barre ImageJ.
2. Définissez l’échelle des images en chargeant l’image micrométrique de la scène et en traçant une ligne droite entre deux marques pour l’échelle. Ouvrez Set Scale (Échelle définie), saisissez la distance connue de la ligne mesurée et saisissez l’unité de l’échelle. Sur le micromètre, dans cet exemple, la plus petite raie était de 10 μm. Cochez la case Définir global et appuyez sur OK. Toutes les images suivantes chargées auront la même échelle.
3. Pour compter les appressoires, les spores ou d’autres objets, sélectionnez l’outil Point . Ensuite, ouvrez le Gestionnaire de retour sur investissement. Cliquez sur la touche T du clavier pour ajouter des points à la liste. Ces régions d’intérêt peuvent être sauvegardées si nécessaire et rechargées sur la même image.
4. Selon les objectifs expérimentaux, effectuez des mesures supplémentaires, telles que la longueur des spores, la taille de l’appressoire et la longueur du tube germinatif.

Résultats

Une représentation du flux de travail initial pour cette technique est illustrée à la figure 1. Les gaines ont été récoltées sur des plants d’orge sensibles de 14 jours (H. vulgare). Les conidies ont été récoltées sur des plaques d’OMA sporulantes de M. oryzae âgées de 10 jours, avec une suspension conidiale préparée à l’aide de ddH₂O stérile pour une concentration finale de 5 x 10⁴ spores par mL. La suspension d’inoculum a ét...

Discussion

Il existe de nombreux tests couramment utilisés pour tester les souches de M. oryzae qui fournissent un visuel macroscopique d’une réponse à une infection compatible ou incompatible, tels que les inoculations par pulvérisation ou gouttelettes, et l’utilisation de systèmes d’évaluation pour quantifier les tailles de lésion^13,14. Un autre test courant pour M. oryzae consiste à tester la capacité de l’agent pathogène à former sa ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetic acid	Sigma-Aldrich	A6283
Cell phone	Google	Pixel 4A	Any smartphone with a rear facing camera that can be mounted in an a holder will suffice.
Cell phone Microscope adapter	Vankey	B01788LT3S	https://www.amazon.com/Vankey-Cellphone-Telescope-Binocular-Microscope/dp/B01788LT3S/ref=sr_1_2_sspa?keywords=vankey+cellphone+telescope+adapter+mount&qid=1662568182&sprefix= vankey+%2Caps%2C63&sr=8-2 -spons&psc=1&spLa=ZW5jcnlwd GVkUXVhbGlmaWVyPUFKNklBR jlCREJaMEcmZW5jcnlwdGVkSWQ 9QTA2MDMxNjhBRFYxQTMzNk9E M0YmZW5jcnlwdGVkQWRJZD1BM DQxMzAzOTMxNzI1TzE3M1ZGTEI md2lkZ2V0TmFtZT1zcF9hdGYmY WN0aW9uPWNsaWNrUmVkaXJlY3 QmZG9Ob3RMb2dDbGljaz10cnVl
Glycerol	Sigma-Aldrich	G5516
Microscope	AmScope	FM690TC	40x–2500x Trinocular upright epi-fluorescence microscope
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ProMix BX	ProMix	1038500RG
Rectangular coverglass	Corning	CLS2975245
Slides, microscope	Sigma-Aldrich	S8902
Stage micrometer	OMAX	A36CALM7	0.1 mm and 0.01 mm Microscope calibration slide
Trypan blue	Sigma-Aldrich	T6146