기본 현미경과 스마트폰을 사용하여 보리(Hordeum vulgare)에 벼 돌풍병(Magnaporthe oryzae)의 초기 감염 부위 시각화

요약

이것은 최소한의 시약과 일반적인 실험실 장비(기본 스마트폰 포함)를 사용하는 보리 잎 덮개 분석의 간단한 프로토콜입니다. 그 목적은 첨단 현미경 장비를 사용하지 않고 실험실에서 모세포 질환의 초기 감염 과정을 시각화하는 것입니다.

초록

식물과 병원체가 어떻게 상호 작용하는지, 그리고 그 상호 작용이 방어 또는 질병으로 절정에 달하는지 여부를 이해하는 것은 식물 건강을 위한 더 강력하고 지속 가능한 전략을 개발하는 데 필요합니다. 감염 및 집락화 동안 식물 병원체 샘플을 보다 효과적으로 이미지화하는 방법의 발전으로 벼와 곰팡이 병원체인 Magnaporthe oryzae 사이의 감염 및 초기 집락화 사건을 모니터링하는 데 유용한 벼잎 덮개 분석과 같은 도구가 생성되었습니다. 이 반생물영양 병원체는 벼와 기장, 호밀, 보리, 그리고 최근에는 밀을 포함한 관련 외떡잎식물에서 심각한 질병 손실을 유발합니다. 잎집 분석을 올바르게 수행하면 여러 층 두께의 광학적으로 투명한 식물 섹션을 생성하여 연구자가 병원균 공격 중에 생세포 이미징을 수행하거나 특정 기능에 대해 염색된 고정 샘플을 생성할 수 있습니다. 보리-M에 대한 상세한 세포 조사. oryzae 상호 작용은 동물과 인간의 식량 공급원이자 발효 음료로서 이 곡물의 중요성이 커지고 있음에도 불구하고 벼 숙주의 상호 작용에 뒤쳐져 있습니다. 여기에 보고된 것은 접종 후 처음 48시간 동안 M. oryzae 상호 작용에 대한 복잡한 연구를 위한 보리 잎 덮개 분석의 개발입니다. 잎집 분석은 어떤 종을 연구하든 섬세합니다. 보리 성장 조건 및 잎집 획득부터 식물 잎에 대한 병원체의 접종, 배양 및 이미징에 이르기까지 모든 것을 포괄하는 프로토콜이 제공됩니다. 이 프로토콜은 이미징 목적으로 스마트폰과 같은 간단한 것을 사용하여 고처리량 스크리닝에 최적화할 수 있습니다.

서문

벼 도풍균인 Magnaporthe oryzae는 보리, 밀, 쌀을 포함한 다양한 곡물 작물을 감염시킨다¹. 이 병원체는 치명적인 질병을 일으키고 이러한 귀중한 작물에 전 세계적으로 위협이 되어 통제하지 않으면 완전한 작물 손실을 초래합니다. 전 세계의 많은 실험실에서 벼 도열병에 초점을 맞추고 있는데, 그 이유는 벼 도열병의 전 세계적인 위협과 식물-곰팡이 상호작용을 위한 훌륭한 모델로서의 특성 때문입니다². 그것은 완전히 시퀀싱되었으며, 감염주기의 유전학, 특히 초기 사건이 확립되었습니다 ^3,4. 수명주기는 잎 표면에서 발아하는 포자로 시작하여 appressorium이라는 특수 침투 구조를 형성합니다. 감염은 잎 조직을 관통하며, 포자 형성 과정을 시작하고 질병을 퍼뜨리는 병변의 발달과 함께 감염이 계속된다⁴. 이러한 초기 사건을 예방하면 이 파괴적인 질병을 크게 억제할 수 있습니다. 결과적으로, 돌풍병에 대한 대부분의 현재 연구는 발아된 분생포자가 appressorium을 형성하는 것부터 침습성 균사 및 생물영양 계면 복합체(BIC)의 발달에 이르기까지 초기 감염 단계에 초점을 맞추고 있습니다.⁵.

M. oryzae는 다양한 작물의 중요한 병원체이며, 새로 진화한 균주가 밀에 대한 세계적인 위협으로 부상하고 있음에도 불구하고 벼에서 돌풍병에 대한 방대한 연구가 수행되었습니다⁶. 쌀은 밀, 옥수수와 함께 인구를 먹여 살리는 데 사용되는 상위 3대 주요 작물 중 하나이지만, 보리는 가축 사료 및 맥주 생산 측면에서 네 번째 곡물입니다⁷. 크래프트 맥주 산업이 성장함에 따라 보리의 경제적 가치도 커집니다. M. oryzae와 보리를 돌풍병을 연구하기 위한 병리학 시스템으로 사용하는 데에는 뚜렷한 이점이 있습니다. 첫째, 보리만 감염시키는 M. oryzae 균주와 여러 풀 종을 감염시킬 수 있는 균주가 있습니다. 예를 들어, 4091-5-8은 주로 보리만 감염시키는 반면, Guy11과 70-15는 보리와 쌀⁸을 모두 감염시킬 수 있다. 이 균주는 유전적으로 유사하며 감염 과정은 비슷합니다⁹. 둘째, 표준 실험실 및 온실 조건에서 보리는 쌀의 복잡한 요구 사항(간결한 온도 제어, 고습도, 특정 광 스펙트럼)이 없기 때문에 재배가 더 쉽습니다. 또한 보리가 나타내지 않는 잎 표면의 소수성으로 인해 쌀에 대한 이미징 문제가 있습니다¹⁰.

이 프로토콜은 데이터 수집을 위해 일반적인 실험실 용품과 스마트폰을 사용하여 여러 감염 단계의 현미경 분석을 위해 보리 잎집을 분리하고 효과적으로 활용하는 간단한 방법을 제시합니다. 보리 잎 덮개 분석을 위한 이 방법은 최소한의 공급이 필요하기 때문에 전 세계 실험실에 적용할 수 있지만 병원체와 병원체가 감염시키는 처음 몇 개의 세포 사이의 미세한 상호 작용에 대한 명확한 그림을 제공합니다. 스프레이 또는 액적 접종과 같은 병원성 분석은 병원체의 병변 형성 능력에 대한 거시적 관점을 제공할 수 있는 반면, 이 분석을 통해 연구원은 사전 침투 사건에서 표피 세포의 집락화에 이르기까지 초기 감염의 특정 단계를 시각화할 수 있습니다. 또한 연구자들은 야생형 곰팡이 감염과 독성이 감소된 돌연변이 감염을 쉽게 비교할 수 있습니다.

프로토콜

1. 실험물질의 준비

1. 오트밀이 고운 가루가 될 때까지 오트밀을 혼합하여 오트밀 한천(OMA)을 준비합니다. 오트밀 분말 25g과 한천 15g을 ddH 2O 500mL에 넣고 배지 사이클에서 오토클레이브합니다(또는₂₀분 동안 끓입니다). 멸균된 60mm 페트리 접시에 매체를 붓습니다.
   참고: V8 한천과 같이 포자 형성을 유도하는 다른 배지 유형은 이 프로토콜에 허용됩니다.
2. 플레이트 M. oryzae 필터는 멸균 집게를 사용하여 OMA 플레이트에 직접 스톡을 고정하고 전체 플레이트를 덮을 수 있도록 합니다(9-12일). 플레이트를 25°C의 성장 인큐베이터에 12:12 시간 낮:밤 주기로 놓아 포자 형성을 유도합니다.
   참고: 일부 돌연변이는 더 느리게 성장하고 추가 관리가 필요하며(예: 먼저 배지를 완성한 다음 OMA로 이식) 충분한 분생포자를 생성하는 데 일주일이 더 걸릴 수 있습니다.
3. 6인치 화분당 10-15개의 종자가 있는 촉촉한 성장 배지(예: 흙이 없는 화분 매체)에 보리(Hordeum vulgare Lacey) 종자를 직접 심습니다. 냄비를 1-2인치의 물이 담긴 쟁반에 넣습니다.
4. 보리 생장 챔버 조건을 60% 상대 습도에서 12시간(일광) 동안 22°C, 12시간(어두움) 동안 19°C로 설정합니다. 씨앗을 방해하지 않도록 바닥에서 물을 계속하십시오.
5. 약 14 일 동안 두 번째 잎 단계까지 보리를 재배하십시오. 멸균 가위를 사용하여 보리 식물을 토양 선 바로 위에 자릅니다. 집게와 면도기/메스를 사용하여 세로로 열린 첫 번째 잎의 잎 덮개를 조심스럽게 자르고 집게를 사용하여 두 번째 잎의 바닥에서 제거합니다.
   알림: 75%-80% 에탄올로 사용하기 전에 도구(집게, 메스 등)를 청소하십시오. 칼집은 첫 번째 잎에서 두 번째 잎까지 부착을 제공하는 얇은 표피층입니다 (두 번째에서 세 번째 잎 등, 그림 1 참조).
6. 접시 내부의 습도를 유지하기 위해 젖은 종이 타월이 들어있는 멸균 된 60mm 페트리 접시에 첫 번째 잎을 평평하게 놓습니다. 메스를 사용하여 첫 번째 잎의 대부분을 칼집에서 잘라내고 장착을 위해 잎 조직의 0.5인치만 남깁니다.
7. 잎 조직을 페트리 플레이트의 바닥에 테이프로 붙입니다.
   알림: 칼집이 말리지만 말려진 칼집이 분생포자 방울을 더 쉽게 잡기 때문에 허용됩니다.
8. 9-12 일 된 M. oryzae 플레이트를 수집하고 플레이트에 0.5-2mL의 멸균 수를 첨가하십시오. 멸균 접종 루프를 사용하여 균사체를 부드럽게 긁어 부착 된 분생 포자를 방출합니다. 분생 포자 현탁액을 작은 무명천 조각이 들어 있는 미세 원심분리기 튜브에 조심스럽게 피펫팅하여 분생포형 현탁액에서 큰 균사체 조각을 걸러냅니다.
   참고: 성장과 포자 형성이 원하는 포자 농도에 도달하기에 충분한 경우 빠르면 7일 이내에 포자를 수집할 수 있습니다. 수집은 느리게 성장하는 유전 돌연변이로 작업하는 경우 14 일 이상 지연 될 수 있습니다
9. 원하는 포자 농도는 mL당 5 x 10 4 포자이지만 범위(1 x 10 ^4-1 x 10 5)가 허용됩니다. 농도가 너무 높으면 개별 감염 부위를 이미징하기가 어렵습니다. 필요한 경우 멸균 된 물로 포자 농도를 희석하십시오.
10. 롤링된 잎 덮개 내부의 분생형 현탁액을 조심스럽게 피펫팅합니다. 25 μL로 시작합니다 (액적 크기는 피복 크기에 따라 최대 50 μL까지 증가 가능).
    참고: 각 돌연변이 균주 또는 보리 계통에 대해 3-5회 반복을 수행하는 것이 좋습니다. 염색 과정에서 손상이 발생하는 것이 일반적이므로 추가 피복 복제가 권장됩니다.
11. 4 개 또는 5 개의 500 mL 비커에 ddH₂O를 채우고 김이 날 때까지 가열합니다 (전자 레인지 또는 핫 플레이트 사용). 온수 비커를 이동할 때 주의하십시오. 페트리 접시의 뚜껑을 김이 나는 비커 중 하나 위에 올려 접시 내부의 습기를 가둡니다.
12. 감염된 잎 덮개 판을 쌓고 나머지 뜨거운 비커로 둘러 쌉니다. 이것은 포자가 발아하는 데 필요한 습하고 습한 환경을 만듭니다.
    알림: 뚜껑을 찜할 때 뜨거운 물이나 증기가 칼집에 닿지 않도록 주의하십시오.
13. 잎 덮개를 빛으로부터 보호하고 단색(검은색 선호) 고무 또는 플라스틱 상자로 덮고 이미징을 위해 48시간 또는 원하는 시점에 그대로 두십시오.
    알림: 골판지 상자는 습기/습기를 잠그지 않고 온수 비커의 증기를 흡수하기 때문에 적합하지 않습니다. 잠금 장치가 있는 플라스틱 욕조는 습기를 억제하는 데 적합하며 검은색 천이나 더 큰 어두운 용기로 덮어 빛을 차단할 수 있습니다.

2. 염색 과정

1. 다음과 같이 얼룩을 준비하십시오 : 45 % 아세트산의 신선한 희석액을 준비하고 0.1 % v / v 트리 판 블루를 첨가하십시오. 염료 용액 1mL를 미세원심분리기 튜브에 분취합니다. 열 블록 또는 수조를 40 °C로 설정하십시오.
2. 면도기 또는 메스를 사용하여 조심스럽게 잎 덮개를 테이프에서 잘라냅니다. 집게를 사용하여 피복을 미세 원심분리기 튜브에 넣고 염료 용액에 완전히 잠겼는지 확인합니다. 염료가 잎에 침투 할 때까지 2 시간 동안 기다리십시오. 염색 공정 시간 동안 샘플을 열 블록 또는 수조에서 40°C로 가열하여 염료의 침투를 증가시킵니다.
   알림: 외피는 마이크로 원심분리기 튜브에 뜨려고 합니다. 잎 조직의 얼룩지지 않은 주머니를 방지하려면 튜브를 채우고 칼집을 담그고 튜브를 닫습니다. 동일한 마이크로 원심분리기 튜브에 여러 개의 피복을 넣지 마십시오.
3. 잎 덮개를 60% 글리세롤로 조심스럽게 헹구어 여분의 염료를 제거합니다. 일반적으로 세 번의 헹굼(각각 신선한 글리세롤)으로 충분합니다. 슬라이드에 장착할 준비가 될 때까지 외피를 글리세롤에 보관하십시오.

3. 장착 및 이미징 공정

1. 깨끗한 유리 슬라이드에 칼집을 놓고 60 % 글리세롤 몇 방울을 넣으십시오. 해부 현미경과 두 쌍의 집게를 사용하여 접종 된 중심이 위를 향하도록 조심스럽게 덮개를 펼칩니다. 집게로 덮개를 열고 덮개가 말리거나 감염 부위를 막는 것을 방지하기 위해 덮개를 맨 위에 놓습니다.
   알림: 잎집은 매우 약하므로 잎집이 손상되지 않도록 주의해서 수행해야 합니다.
2. 장기 보관을 위해 매니큐어를 사용하거나 단기 보관을 위해 테이프를 사용하여 커버슬립을 밀봉합니다. 복합 광학 현미경으로 슬라이드를 관찰합니다.
3. 현미경과 휴대폰을 사용하여 기본 이미지를 촬영합니다. 여기에서는 휴대폰 어댑터 마운트와 스마트폰으로 이미지를 촬영했습니다. Android 장치의 경우 카메라 응용 프로그램을 플래시 끄기, Top Shot 비활성화, 밝기 및 그림자 자동 조정 비활성화, 사진 해상도를 최대 설정으로 조정합니다.
   참고: 휴대폰에서 카메라 애플리케이션을 사용하면 평소보다 배터리 수명이 더 빨리 줄어들므로 외부 전원을 사용하는 것이 좋습니다.
4. 휴대 전화가 현미경에 장착되면 데이터를 수집하는 데 사용할 목적으로 스케일 마이크로미터의 이미지를 찍습니다. 이 연구의 데이터는 40x 0.65 NA 공기 대물렌즈에서 수집되었으며 전화 어댑터는 10x 접안렌즈에 장착되었습니다. 휴대폰의 확대/축소를 2.5배로 조정하고 픽셀 크기를 일정하게 유지하도록 일관되게 유지합니다.
5. 칼집의 중앙에는 포자와 감염 appressoria가 가장 많이 집중되어 있습니다. 따라서 통계 분석을 위해 상당한 수를 얻기 위해 각 피복의 9-12개 이미지를 목표로 하십시오. 포자와 appressoria의 수는 적용된 포자의 농도에 따라 다릅니다.

4. ImageJ(FIJI)를 사용한 이미지 평가 및 카운팅

1. ImageJ(FIJI)를 실행하는 컴퓨터로 이미지를 전송합니다. 이미지를 열려면 파일을 ImageJ 막대로 끌어다 놓습니다.
2. 스테이지 마이크로미터 이미지를 로드하고 스케일에 대한 두 표시 사이에 직선을 그려 이미지의 스케일을 설정합니다. 배율 설정(Set Scale)을 열고 측정된 선의 알려진 거리(Known Distance )를 입력하고 축척 단위를 입력합니다. 마이크로미터에서 이 예에서 가장 작은 선은 10μm였습니다. 전역 설정 상자를 선택하고 확인을 누릅니다. 로드된 모든 후속 이미지는 동일한 배율을 갖습니다.
3. 아프레소리아, 포자 또는 기타 물체의 개수를 계산하려면 점 도구를 선택합니다. 그런 다음 ROI 관리자를 엽니다. 키보드의 T 키를 클릭하여 목록에 점을 추가합니다. 필요한 경우 이러한 관심 영역을 저장하고 동일한 이미지에 다시 로드할 수 있습니다.
4. 실험 목표에 따라 포자 길이, 생식관 크기 및 생식관 길이와 같은 추가 측정을 수행합니다.

결과

이 기술의 초기 워크플로는 그림 1에 나와 있습니다. 칼집은 14 일 된 감수성이있는 "Lacey"보리 식물 (H. vulgare)에서 수확되었습니다. 분생포자를 10일령 포자화 M. oryzae OMA 플레이트로부터 수확하고, mL당 5 x 10⁴ 포자의 최종 농도를 위해 멸균_ddH2O를 사용하여 제조된 분생포자 현탁액으로 하였다. 접종 현탁액은 멸균 페트리 플레이트에 고정된 잎집에...

토론

스프레이 또는 비말 접종과 같은 양립하거나 양립할 수 없는 감염 반응에 대한 거시적 수준의 시각을 제공하고 병^{변 크기를 정량}화하기 위한 등급 시스템을 사용하는 M. oryzae 균주를 테스트하는 데 일반적으로 사용되는 분석법이 많이 있습니다. M. oryzae에 대한 또 다른 일반적인 분석은 병원체가 특수 침투 구조인 압프레소리움(apppressorium)?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetic acid	Sigma-Aldrich	A6283
Cell phone	Google	Pixel 4A	Any smartphone with a rear facing camera that can be mounted in an a holder will suffice.
Cell phone Microscope adapter	Vankey	B01788LT3S	https://www.amazon.com/Vankey-Cellphone-Telescope-Binocular-Microscope/dp/B01788LT3S/ref=sr_1_2_sspa?keywords=vankey+cellphone+telescope+adapter+mount&qid=1662568182&sprefix= vankey+%2Caps%2C63&sr=8-2 -spons&psc=1&spLa=ZW5jcnlwd GVkUXVhbGlmaWVyPUFKNklBR jlCREJaMEcmZW5jcnlwdGVkSWQ 9QTA2MDMxNjhBRFYxQTMzNk9E M0YmZW5jcnlwdGVkQWRJZD1BM DQxMzAzOTMxNzI1TzE3M1ZGTEI md2lkZ2V0TmFtZT1zcF9hdGYmY WN0aW9uPWNsaWNrUmVkaXJlY3 QmZG9Ob3RMb2dDbGljaz10cnVl
Glycerol	Sigma-Aldrich	G5516
Microscope	AmScope	FM690TC	40x–2500x Trinocular upright epi-fluorescence microscope
Oatmeal old fashioned rolled oats	Quaker	N/A	https://www.amazon.com/Quaker-Oats-Old-Fashioned-Pack/dp/B00IIVBNK4/ref=asc_df_B00IIVBNK4/?tag=hyprod-20&linkCode=df0 &hvadid=312253390021&hvpos= &hvnetw=g&hvrand=98212627704 6839544&hvpone=&hvptwo=&hvq mt=&hvdev=c&hvdvcmdl=&hvlocint =&hvlocphy=9007494&hvtargid =pla-568492637928&psc=1
ProMix BX	ProMix	1038500RG
Rectangular coverglass	Corning	CLS2975245
Slides, microscope	Sigma-Aldrich	S8902
Stage micrometer	OMAX	A36CALM7	0.1 mm and 0.01 mm Microscope calibration slide
Trypan blue	Sigma-Aldrich	T6146