Визуализация ранних очагов заражения рисовой бластной болезнью (Magnaporthe oryzae) на ячмене (Hordeum vulgare) с помощью базового микроскопа и смартфона

Резюме

Это простой протокол анализа оболочки листьев ячменя с использованием минимального количества реагентов и обычного лабораторного оборудования (включая базовый смартфон). Цель состоит в том, чтобы визуализировать ранний инфекционный процесс бластной болезни в лабораториях без доступа к передовому микроскопическому оборудованию.

Аннотация

Понимание того, как взаимодействуют растения и патогены, и приводит ли это взаимодействие к защите или болезни, необходимо для разработки более сильных и устойчивых стратегий для здоровья растений. Достижения в методах, которые более эффективно визуализируют образцы патогенов растений во время инфекции и колонизации, привели к появлению таких инструментов, как анализ оболочки рисовых листьев, который был полезен для мониторинга инфекции и ранних событий колонизации между рисом и грибковым патогеном Magnaporthe oryzae. Этот полубиотрофный патоген вызывает серьезную потерю болезней у риса и родственных однодольных растений, включая просо, рожь, ячмень и, в последнее время, пшеницу. Анализ оболочки листа при правильном выполнении дает оптически прозрачный срез растения толщиной в несколько слоев, что позволяет исследователям выполнять визуализацию живых клеток во время атаки патогена или генерировать фиксированные образцы, окрашенные по определенным признакам. Детальные клеточные исследования взаимодействия ячменя и M. oryzae отстают от таковых у рисового хозяина, несмотря на растущее значение этого зерна в качестве источника пищи для животных и людей и в качестве ферментированных напитков. Здесь сообщается о разработке анализа оболочки листьев ячменя для сложных исследований взаимодействий M. oryzae в течение первых 48 часов после инокуляции. Проба листового влагалища, независимо от того, какой вид изучается, деликатна; Предоставляется протокол, который охватывает все, от условий роста ячменя и получения листовой оболочки до инокуляции, инкубации и визуализации патогена на листьях растений. Этот протокол может быть оптимизирован для высокопроизводительного скрининга с использованием чего-то столь же простого, как смартфон для целей визуализации.

Введение

Magnaporthe oryzae, рисовый гриб, поражает ряд зерновых культур, включая ячмень, пшеницу и рис¹. Этот патоген вызывает разрушительные болезни и представляет угрозу для этих ценных культур во всем мире, вызывая полную потерю урожая, если его не контролировать. Многие лаборатории по всему миру уделяют особое внимание болезни риса из-за ее глобальной угрозы и ее свойств в качестве отличной модели взаимодействия растений и грибов². Он был полностью секвенирован, и генетика его инфекционного цикла, особенно ранних событий, была установлена ^3,4. Жизненный цикл начинается с того, что споры прорастают на поверхности листа, образуя специализированную структуру проникновения, называемую аппрессориумом. Аппрессориум проникает в ткани листа, и инфекция продолжается с развитием поражений, которые запускают процесс спороношения и распространяют болезнь⁴. Предотвращение любого из этих ранних событий резко подавило бы эту разрушительную болезнь. Следовательно, большинство современных исследований бластной болезни было сосредоточено на ранних стадиях инфекции, от проросших конидий, образующих аппрессорий, до развития инвазивных гиф и биотрофного межфазного комплекса (BIC)⁵.

Огромное количество исследований бластной болезни было проведено на рисе, несмотря на то, что M. oryzae является важным патогеном для различных сельскохозяйственных культур, а недавно выведенные штаммы становятся глобальной угрозой для пшеницы⁶. В то время как рис является одной из трех основных сельскохозяйственных культур, используемых для кормления населения, наряду с пшеницей и кукурузой, ячмень является четвертым зерновым зерном с точки зрения производства кормов для скота и пива⁷. По мере роста индустрии крафтового пива растет и экономическая ценность ячменя. Существуют явные преимущества использования M. oryzae и ячменя в качестве патосистемы для изучения бластной болезни. Во-первых, существуют штаммы M. oryzae , которые заражают только ячмень, а также штаммы, которые могут заражать несколько видов трав. Например, 4091-5-8 заражает в первую очередь только ячмень, в то время как Guy11 и 70-15 могут заражать как ячмень, так и рис⁸. Эти штаммы генетически схожи, и процесс заражения сопоставим⁹. Во-вторых, в стандартных лабораторных и тепличных условиях ячмень легче выращивать, так как он не предъявляет сложных требований к рису (лаконичный контроль температуры, высокая влажность, специфические световые спектры). Существуют также проблемы с визуализацией риса из-за гидрофобности поверхности листа, которую ячмень не проявляет¹⁰.

Этот протокол представляет собой простой метод выделения и эффективного использования оболочек листьев ячменя для микроскопического анализа нескольких стадий инфекции с использованием обычных лабораторных принадлежностей и смартфона для сбора данных. Этот метод анализа оболочки листьев ячменя можно адаптировать для лабораторий по всему миру, поскольку он требует минимальных поставок, но при этом дает четкую картину микроскопического взаимодействия между патогеном и первыми несколькими клетками, которые он заражает. В то время как анализы патогенности, такие как инокуляция спреем или каплями, могут обеспечить макропредставление о способности патогена образовывать поражения, этот анализ позволяет исследователю визуализировать конкретные этапы ранней инфекции, от событий до проникновения до колонизации клеток эпидермиса. Кроме того, исследователи могут легко сравнить инфекцию грибком дикого типа с инфекцией мутантом с пониженной вирулентностью.

протокол

1. Подготовка экспериментальных материалов

1. Приготовьте овсяный агар (ОМА), смешав овсянку до получения мелкого порошка. Добавьте 25 г овсяного порошка и 15 г агара к 500 мл ddH₂O и автоклавируйте в цикле среды (в качестве альтернативы доведите до кипения в течение 20 минут). Разлейте среду в стерильные чашки Петри диаметром 60 мм.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Другие типы сред, вызывающие споруляцию, такие как агар V8, приемлемы для этого протокола.
2. Пластинчатый фильтр M. oryzae наносится непосредственно на пластины OMA с помощью стерильных щипцов и позволяет им покрыть всю пластину (9-12 дней). Поместите пластины в инкубатор для роста при температуре 25 ° C с 12:12 ч дневные: ночные циклы, чтобы помочь вызвать спороношение.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Некоторые мутанты растут медленнее и требуют дополнительного ухода (например, сначала полного носителя, а затем переноса в ОМА), и может потребоваться дополнительная неделя, чтобы произвести достаточное количество конидий.
3. Непосредственно сажайте семена ячменя (Hordeum vulgare Lacey) во влажную питательную среду (например, беспочвенную горшечную среду) с 10-15 семенами в 6-дюймовом горшке. Поместите горшки в лотки с 1-2 дюймами воды.
4. Установите условия в камере выращивания ячменя 22 °C в течение 12 ч (дневной свет) и 19 °C в течение 12 ч (темно) при относительной влажности 60%. Продолжайте поливать снизу, чтобы не потревожить семена.
5. Выращивают ячмень до стадии второго листа, примерно в течение 14 дней. С помощью стерильных ножниц срежьте растение ячменя чуть выше линии почвы. С помощью щипцов и бритвы/скальпеля аккуратно разрежьте продольную оболочку первого листа и с помощью щипцов снимите его с основания второго листа.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Очистите инструменты (щипцы, скальпель и т. Д.) Перед использованием 75% -80% этанола. Оболочка представляет собой тонкий слой эпидермиса, обеспечивающий прикрепление от первого к второму листу (от второго к третьему листу и т. д.; см. рис. 1).
6. Поместите первый лист в стерильную чашку Петри диаметром 60 мм, содержащую влажное бумажное полотенце для поддержания влажности внутри тарелки. Используя скальпель, отрежьте большую часть первого листа от оболочки, оставив только 0,5 дюйма ткани листа для крепления.
7. Приклейте листовую ткань ко дну пластины Петри.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Оболочка скручивается, но это приемлемо, так как скрученная оболочка легче удерживает конидиальную капельку.
8. Соберите 9-12-дневные планшеты M. oryzae и добавьте в них 0,5-2 мл стерильной воды. Используя стерильную петлю для инокуляции, аккуратно соскребите мицелий, чтобы освободить прикрепленные конидии. Осторожно поместите конидиальную суспензию пипеткой в микроцентрифужную пробирку, содержащую небольшой кусочек марли, чтобы отфильтровать любые крупные кусочки мицелия из конидиальной суспензии.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Споры могут быть собраны уже через 7 дней, если рост и спороношение достаточны для достижения желаемой концентрации спор. Сбор может быть отложен не более чем на 14 дней, если вы работаете с медленно растущим генетическим мутантом
9. Желаемая концентрация спор составляет 5 х 10 4 спор на мл, но диапазон (1 х 10 ^4-1 х 10 5) является приемлемым. Слишком высокая концентрация затрудняет визуализацию отдельных очагов инфекции; При необходимости разбавьте концентрацию спор стерильной водой.
10. Аккуратно пипеткой наложите конидиальную суспензию внутрь свернутой листовой оболочки. Начните с 25 мкл (размер капель может быть увеличен в зависимости от размера оболочки, до 50 мкл).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется выполнить от трех до пяти повторений каждого мутантного штамма или линии ячменя. В процессе окрашивания часто возникают повреждения, поэтому рекомендуется использовать дополнительные реплики оболочки.
11. Наполните четыре или пять стаканов объемом 500 мл ddH₂O и нагрейте до приготовления на пару (с помощью микроволновой печи или плиты). Будьте осторожны при перемещении стаканов с горячей водой. Держите крышку чашки Петри над одним из дымящихся стаканов, чтобы улавливать влагу внутри тарелки.
12. Сложите зараженные пластины листовой оболочки и окружите их оставшимися горячими мензурками. Это создает влажную, влажную среду, необходимую для прорастания спор.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте осторожны при пропаривании крышек, чтобы горячая вода или пар не касались ножен.
13. Защитите оболочки листьев от света, накройте однотонной (предпочтительно черной) резиновой или пластиковой коробкой и оставьте на 48 часов или желаемый момент времени для получения изображения.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Картонная коробка не подходит, потому что она не удерживает влагу / влажность и поглощает пар из стаканов с горячей водой. Запирающаяся пластиковая ванна хорошо справляется с удержанием влажности, и ее можно накрыть черной тканью или большим темным контейнером, чтобы блокировать свет.

2. Процесс окрашивания

1. Подготовьте пятно следующим образом: приготовьте свежее разбавление из 45% уксусной кислоты и добавьте 0,1% v/v трипанового синего. Аликвотировать 1 мл раствора красителя в микроцентрифужные пробирки. Установите тепловой блок или водяную баню на 40 °C.
2. Аккуратно, с помощью бритвы или скальпеля, отрежьте листовую оболочку от скотча. С помощью щипцов поместите оболочку в микроцентрифужную трубку и убедитесь, что она полностью погружена в раствор красителя. Подождите 2 ч, чтобы краситель проник в лист. Нагрейте образцы до 40 °C во время процесса окрашивания в тепловом блоке или на водяной бане, чтобы увеличить проникновение красителя.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Оболочки пытаются плавать в микроцентрифужной трубке; Чтобы предотвратить появление неокрашенных карманов листовой ткани, заполните трубки, погрузите оболочки и закройте трубку. Не помещайте несколько оболочек в одну и ту же микроцентрифужную пробирку.
3. Тщательно промойте оболочки листьев в 60% глицерине, чтобы удалить лишний краситель. Как правило, достаточно трех полосканий (каждое из свежего глицерина). Держите оболочку в глицерине до тех пор, пока она не будет готова к установке на предметные стекла.

3. Процесс монтажа и визуализации

1. Поместите оболочку на чистое предметное стекло и добавьте несколько капель 60% глицерина. С помощью рассекающего микроскопа и двух пар щипцов осторожно разверните оболочку, оставив инокулированный центр лицевой стороной вверх. Держите оболочку открытой щипцами, а сверху поместите покровное стекло, чтобы предотвратить скручивание оболочки и блокировку места заражения.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Оболочка листа очень хрупкая, и эти шаги необходимо выполнять с осторожностью, чтобы не повредить оболочку.
2. Заклейте покровное стекло лаком для ногтей для длительного хранения или лентой для кратковременного хранения. Наблюдайте за предметными стеклами под составным световым микроскопом.
3. Делайте основные снимки с помощью микроскопа и мобильного телефона. Здесь снимки были сделаны с помощью крепления адаптера сотового телефона и смартфона. Для устройств Android настройте приложение камеры на следующие параметры: выключите вспышку, отключите Top Shot, отключите автоматическую регулировку яркости и теней и установите полное разрешение фотографии.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Использование приложения камеры на телефоне сокращает время автономной работы быстрее, чем обычно, поэтому рекомендуется использовать внешнее питание.
4. После того, как сотовый телефон установлен на микроскопе, сделайте снимок масштабного микрометра с целью, которая будет использоваться для получения данных. Данные в этом исследовании были получены на 40-кратном воздушном объективе 0,65 NA, а телефонный адаптер был установлен на 10-кратном окуляре. Отрегулируйте масштаб телефона в 2,5 раза и сохраняйте его постоянным, чтобы поддерживать постоянный размер пикселя.
5. В центре оболочки находится наибольшая концентрация спор и заражающих аппрессории; Поэтому стремитесь к 9-12 изображениям каждой оболочки, чтобы получить значимые числа для статистического анализа. Количество спор и аппрессоров варьируется в зависимости от концентрации применяемых спор.

4. Оценка и подсчет изображений с помощью ImageJ (FIJI)

1. Перенесите изображения на компьютер под управлением ImageJ (FIJI). Чтобы открыть изображения, перетащите файлы на панель ImageJ.
2. Установите масштаб изображений, загрузив изображение микрометра и нарисовав прямую линию между двумя метками для масштаба. Откройте «Установить шкалу», введите «Известное расстояние» для измеряемой линии и введите единицу измерения для шкалы. На микрометре в этом примере наименьшая линия была 10 мкм. Установите флажок «Установить глобальный» и нажмите «ОК». Все последующие загруженные изображения будут иметь одинаковый масштаб.
3. Чтобы подсчитать аппрессории, споры или другие объекты, выберите инструмент «Точка ». Затем откройте ROI Manager. Нажмите клавишу T на клавиатуре, чтобы добавить точки в список. Эти области интереса могут быть сохранены при необходимости и перезагружены на тот же образ.
4. В зависимости от целей эксперимента проведите дополнительные измерения, такие как длина спор, размер аппрессории и длина зародышевой трубки.

Результаты

Описание начального рабочего процесса для этого метода показано на рисунке 1. Оболочки были собраны с 14-дневных восприимчивых растений ячменя «Лейси» (H. vulgare). Конидии собирали из 10-дневных спорорасширяющих пластин M. oryzae OMA с конидиальной суспензией, приготовле...

Обсуждение

Существует множество широко используемых анализов для тестирования штаммов M. oryzae, которые обеспечивают макроскопическое визуальное изображение совместимого или несовместимого ответа на инфекцию, такого как прививки спреем или воздушно-капельным способом, а также использовани?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetic acid	Sigma-Aldrich	A6283
Cell phone	Google	Pixel 4A	Any smartphone with a rear facing camera that can be mounted in an a holder will suffice.
Cell phone Microscope adapter	Vankey	B01788LT3S	https://www.amazon.com/Vankey-Cellphone-Telescope-Binocular-Microscope/dp/B01788LT3S/ref=sr_1_2_sspa?keywords=vankey+cellphone+telescope+adapter+mount&qid=1662568182&sprefix= vankey+%2Caps%2C63&sr=8-2 -spons&psc=1&spLa=ZW5jcnlwd GVkUXVhbGlmaWVyPUFKNklBR jlCREJaMEcmZW5jcnlwdGVkSWQ 9QTA2MDMxNjhBRFYxQTMzNk9E M0YmZW5jcnlwdGVkQWRJZD1BM DQxMzAzOTMxNzI1TzE3M1ZGTEI md2lkZ2V0TmFtZT1zcF9hdGYmY WN0aW9uPWNsaWNrUmVkaXJlY3 QmZG9Ob3RMb2dDbGljaz10cnVl
Glycerol	Sigma-Aldrich	G5516
Microscope	AmScope	FM690TC	40x–2500x Trinocular upright epi-fluorescence microscope
Oatmeal old fashioned rolled oats	Quaker	N/A	https://www.amazon.com/Quaker-Oats-Old-Fashioned-Pack/dp/B00IIVBNK4/ref=asc_df_B00IIVBNK4/?tag=hyprod-20&linkCode=df0 &hvadid=312253390021&hvpos= &hvnetw=g&hvrand=98212627704 6839544&hvpone=&hvptwo=&hvq mt=&hvdev=c&hvdvcmdl=&hvlocint =&hvlocphy=9007494&hvtargid =pla-568492637928&psc=1
ProMix BX	ProMix	1038500RG
Rectangular coverglass	Corning	CLS2975245
Slides, microscope	Sigma-Aldrich	S8902
Stage micrometer	OMAX	A36CALM7	0.1 mm and 0.01 mm Microscope calibration slide
Trypan blue	Sigma-Aldrich	T6146