Visualisierung früher Infektionsherde der Reisexplosionskrankheit (Magnaporthe oryzae) an Gerste (Hordeum vulgare) mit einem einfachen Mikroskop und einem Smartphone

Zusammenfassung

Dies ist ein einfaches Protokoll eines Gerstenblattscheiden-Assays mit minimalen Reagenzien und gängigen Laborgeräten (einschließlich eines einfachen Smartphones). Ziel ist es, den frühen Infektionsprozess der Blastenkrankheit in Labors ohne Zugang zu fortschrittlichen Mikroskopiegeräten zu visualisieren.

Zusammenfassung

Zu verstehen, wie Pflanzen und Krankheitserreger interagieren und ob diese Interaktion in Abwehr oder Krankheit gipfelt, ist erforderlich, um stärkere und nachhaltigere Strategien für die Pflanzengesundheit zu entwickeln. Fortschritte bei Methoden, die Pflanzenpathogenproben während der Infektion und Besiedlung effektiver abbilden, haben Werkzeuge wie den Reisblattscheiden-Assay hervorgebracht, der sich bei der Überwachung von Infektionen und frühen Kolonisierungsereignissen zwischen Reis und dem Pilzpathogen Magnaporthe oryzae als nützlich erwiesen hat. Dieser hemi-biotrophe Erreger verursacht schwere Krankheitsverluste bei Reis und verwandten Monokotyledonen, einschließlich Hirse, Roggen, Gerste und in jüngerer Zeit Weizen. Der Blattscheiden-Assay liefert, wenn er korrekt durchgeführt wird, einen optisch klaren Pflanzenabschnitt mit einer Dicke von mehreren Schichten, der es den Forschern ermöglicht, während des Pathogenangriffs eine Bildgebung von lebenden Zellen durchzuführen oder feste Proben zu erzeugen, die für bestimmte Merkmale gefärbt sind. Detaillierte zelluläre Untersuchungen der Interaktion zwischen Gerste und M. oryzae hinkten denen des Reiswirts hinterher, trotz der wachsenden Bedeutung dieses Getreides als Nahrungsquelle für Tier und Mensch sowie als fermentierte Getränke. Hier wird über die Entwicklung eines Gerstenblattscheiden-Assays für komplizierte Studien von M. oryzae-Interaktionen während der ersten 48 Stunden nach der Inokulation berichtet. Der Blattscheiden-Assay, unabhängig davon, welche Art untersucht wird, ist heikel; Es wird ein Protokoll bereitgestellt, das alles abdeckt, von den Wachstumsbedingungen für Gerste und der Gewinnung einer Blattscheide bis hin zur Inokulation, Inkubation und Bildgebung des Erregers auf Pflanzenblättern. Dieses Protokoll kann für das Hochdurchsatz-Screening optimiert werden, indem etwas so Einfaches wie ein Smartphone für Bildgebungszwecke verwendet wird.

Einleitung

Magnaporthe oryzae, der Reisexplosionspilz, infiziert eine Reihe von Getreidekulturen, darunter Gerste, Weizen und Reis¹. Dieser Erreger verursacht verheerende Krankheiten und stellt eine weltweite Bedrohung für diese wertvollen Nutzpflanzen dar, die zu vollständigen Ernteverlusten führt, wenn er nicht kontrolliert wird. Viele Labore auf der ganzen Welt konzentrieren sich auf die Reisexplosionskrankheit aufgrund ihrer globalen Bedrohung und ihrer Eigenschaften als hervorragendes Modell für Pflanzen-Pilz-Interaktionen². Es wurde vollständig sequenziert, und die Genetik seines Infektionszyklus, insbesondere der fr....

Protokoll

1. Vorbereitung von Versuchsmaterialien

1. Bereiten Sie Haferflocken-Agar (OMA) zu, indem Sie Haferflocken pürieren, bis es ein feines Pulver ist. 25 g Haferflockenpulver und 15 g Agar zu 500 ml_ddH2Ogeben und im Medienzyklus autoklavieren (alternativ 20 min zum Kochen bringen). Gießen Sie das Medium in sterile 60-mm-Petrischale.
   HINWEIS: Andere Medientypen, die eine Sporulation induzieren, wie z. B. V8-Agar, sind für dieses Protokoll akzeptabel.
2. Die Platte M. oryzae filtert die Platten mit einer sterilen Pinzette direkt auf die OMA-Platten und lässt sie die gesamte Platte bedecken (9-12 Tage). Legen Sie die Plat....

Ergebnisse

Eine Darstellung des anfänglichen Arbeitsablaufs für diese Technik ist in Abbildung 1 dargestellt. Die Scheiden wurden von 14 Tage alten anfälligen "Lacey"-Gerstenpflanzen (H. vulgare) geerntet. Die Konidien wurden aus 10 Tage alten sporulierenden M. oryzae OMA-Platten geerntet, wobei eine konidiale Suspension unter Verwendung von sterilem ddH₂O für eine Endkonzentration von 5 x 10⁴ Sporen pro ml hergestellt wurde. Die Inokulumsuspension wurde dire.......

Diskussion

Es gibt viele häufig verwendete Assays zum Testen von M. oryzae-Stämmen, die eine makroskopische Darstellung einer kompatiblen oder inkompatiblen Infektionsreaktion liefern, wie z. B. Sprüh- oder Tröpfchenimpfungen, und die Verwendung von Bewertungssystemen zur Quantifizierung der Läsionsgrößen^13,14. Ein weiterer gängiger Test für M. oryzae besteht darin, die Fähigkeit des Erregers zu testen, seine spezialisierte Penetrationsstruktur, .......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetic acid	Sigma-Aldrich	A6283
Cell phone	Google	Pixel 4A	Any smartphone with a rear facing camera that can be mounted in an a holder will suffice.
Cell phone Microscope adapter	Vankey	B01788LT3S	https://www.amazon.com/Vankey-Cellphone-Telescope-Binocular-Microscope/dp/B01788LT3S/ref=sr_1_2_sspa?keywords=vankey+cellphone+telescope+adapter+mount&qid=1662568182&sprefix= vankey+%2Caps%2C63&sr=8-2 -spons&psc=1&spLa=ZW5jcnlwd GVkUXVhbGlmaWVyPUFKNklBR jlCREJaMEcmZW5jcnlwdGVkSWQ 9QTA2MDMxNjhBRFYxQTMzNk9E M0YmZW5jcnlwdGVkQWRJZD1BM DQxMzAzOTMxNzI1TzE3M1ZGTEI md2lkZ2V0TmFtZT1zcF9hdGYmY WN0aW9uPWNsaWNrUmVkaXJlY3 QmZG9Ob3RMb2dDbGljaz10cnVl
Glycerol	Sigma-Aldrich	G5516
Microscope	AmScope	FM690TC	40x–2500x Trinocular upright epi-fluorescence microscope
Oatmeal old fashioned rolled oats	Quaker	N/A	https://www.amazon.com/Quaker-Oats-Old-Fashioned-Pack/dp/B00IIVBNK4/ref=asc_df_B00IIVBNK4/?tag=hyprod-20&linkCode=df0 &hvadid=312253390021&hvpos= &hvnetw=g&hvrand=98212627704 6839544&hvpone=&hvptwo=&hvq mt=&hvdev=c&hvdvcmdl=&hvlocint =&hvlocphy=9007494&hvtargid =pla-568492637928&psc=1
ProMix BX	ProMix	1038500RG
Rectangular coverglass	Corning	CLS2975245
Slides, microscope	Sigma-Aldrich	S8902
Stage micrometer	OMAX	A36CALM7	0.1 mm and 0.01 mm Microscope calibration slide
Trypan blue	Sigma-Aldrich	T6146