تحريض التهاب دواعم السن عن طريق مزيج من حقن الرباط وعديد السكاريد الشحمي في نموذج الفئران

Marta Munar-Bestard; Oscar Villa; Maria del Mar Ferrà-Cañellas; Joana Maria Ramis; Marta Monjo

doi:10.3791/64842

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

Summary

في هذه الدراسة ، تم تقديم نموذج الفئران لتحريض التهاب اللثة عن طريق مزيج من الرباط المحتجز والحقن المتكرر من عديد السكاريد الدهني المشتق من Porphyromonas gingivalis ، على مدار 14 يوما حول الأضراس الفكية الأولى. كانت تقنيات الربط وحقن LPS فعالة في إحداث التهاب القلفة ، مما أدى إلى فقدان العظم السنخي والالتهاب.

Abstract

التهاب دواعم السن (PD) هو مرض التهابي مناعي مزمن منتشر للغاية يصيب اللثة ، مما يؤدي إلى فقدان الأنسجة الرخوة اللثوية والأربطة اللثوية والملاط والعظام السنخية. في هذه الدراسة ، تم وصف طريقة بسيطة لتحريض PD في الفئران. نحن نقدم تعليمات مفصلة لوضع نموذج الرباط حول الأضراس الفكية الأولى (M1) ومجموعة من حقن عديد السكاريد الشحمي (LPS) ، المشتقة من Porphyromonas gingivalis في الجانب المتوسط الحنكي من M1. تم الحفاظ على تحريض التهاب اللثة لمدة 14 يوما ، مما يعزز تراكم البكتيريا الحيوية والالتهابات. للتحقق من صحة النموذج الحيواني ، تم تحديد IL-1β ، وهو وسيط التهابي رئيسي ، بواسطة مقايسة مناعية في السائل اللثوي (GCF) ، وتم حساب فقدان العظام السنخية باستخدام التصوير المقطعي المحوسب بالشعاع المخروطي (CBCT). كانت هذه التقنية فعالة في تعزيز تراجع اللثة ، وفقدان العظام السنخية ، وزيادة مستويات IL-1β في الصندوق الأخضر للمناخ في نهاية الإجراء التجريبي بعد 14 يوما. كانت هذه الطريقة فعالة في تحفيز مرض باركنسون ، وبالتالي يمكن استخدامها في الدراسات حول آليات تطور المرض والعلاجات المستقبلية الممكنة.

Introduction

التهاب دواعم السن (PD) هو سادس أكثر حالات الصحة العامة انتشارا في جميع أنحاء العالم ، حيث يؤثر على حوالي 11٪ من إجمالي السكان ، كونه شكلا متقدما لا رجعة فيه ومدمرا لأمراض اللثة ^1,2. PD هي عملية التهابية تؤثر على أنسجة اللثة واللثة ، مما يؤدي إلى تراجع اللثة ، والهجرة القمية للظهارة الموصلية مع نمو الجيب ، وفقدان العظم السنخي³. علاوة على ذلك ، يرتبط مرض باركنسون بالعديد من الأمراض الجهازية ، بما في ذلك أمراض القلب والأوعية الدموية والسمنة والسكري والتهاب المفاصل الروماتويدي ، والتي تلعب العوامل البيئية والعوامل الخاصة بالمضيف دورا مهما^في ^4,5.

ومن ثم ، فإن مرض باركنسون هو مرض متعدد العوامل يبدأ في المقام الأول من خلال تراكم البلاك الميكروبي - الناتج عن dysbiosis للمجتمعات الميكروبية - والاستجابة المناعية للمضيف المبالغ فيها لمسببات الأمراض اللثوية ، مما يؤدي إلى انهيار أنسجة اللثة ^4,6. من بين العديد من بكتيريا اللثة ، تعد البكتيريا اللاهوائية سالبة الجرام Porphyromonas gingivalis واحدة من مسببات الأمراض الرئيسية في PD⁴. يحتوي P. gingivalis على عديد السكاريد الدهني المعقد (LPS) في جدرانه ، وهو جزيء معروف بتحفيز تسلل كريات الدم البيضاء متعددة الأشكال النووية وتوسع الأوعية الدموية في أنسجة اللثة الملتهبة⁷. ينتج عن هذا إنتاج وسطاء التهابيين ، مثل إنترلوكين 1 (IL-1) و IL-6 و IL-8 ، عامل نخر الورم (TNF) ، أو البروستاجلاندين ، مع تنشيط ناقضة العظم اللاحقة وارتشاف العظام ، مما يؤدي إلى تدمير الأنسجة وفقدان الأسنان في نهاية المطاف³.

من بين المزايا المختلفة للنماذج الحيوانية القدرة على تقليد التعقيدات الخلوية كما هو الحال في البشر ، أو أن تكون أكثر دقة من الدراسات المختبرية ، والتي تتم على الأسطح البلاستيكية ذات أنواع الخلايا المحدودة⁸. لنمذجة PD تجريبيا في الجسم الحي ، تم استخدام أنواع حيوانية مختلفة ، مثل الرئيسيات غير البشرية والكلاب والخنازير والقوارض والأرانب والفئران والجرذان⁹. ومع ذلك ، فإن الفئران هي النموذج الحيواني الأكثر دراسة على نطاق واسع للتسبب في مرض باركنسون لأنها غير مكلفة ويسهل التعامل معها¹⁰. تتميز أنسجة اللثة السنية بسمات هيكلية مماثلة لأنسجة اللثة البشرية ، مع تلم اللثة الضحل وظهارة الموصل متصلة بسطح السن. علاوة على ذلك ، كما هو الحال في البشر ، تسهل الظهارة الموصلية مرور المواد البكتيرية والغريبة والإفرازات من الخلايا الالتهابية ⁹.

أحد أكثر النماذج التجريبية التي تم الإبلاغ عنها لتحريض PD في الفئران هو وضع الأربطة حول الأسنان ، وهو أمر صعب تقنيا ولكنه موثوق^{به 10}. يسهل وضع الرباط لوحة الأسنان وتراكم البكتيريا ، مما يؤدي إلى حدوث dysbiosis في التلم اللثوي ، والذي يسبب التهاب أنسجة اللثة وتدميرها¹¹. يمكن أن يحدث فقدان ارتباط اللثة وارتشاف العظم السنخي في 7 أيام في نموذج الفئران⁸.

نموذج حيواني آخر لمرض باركنسون يتكون من حقن LPS في أنسجة اللثة. نتيجة لذلك ، يتم تحفيز تكوين العظم وفقدان العظام. تتشابه السمات النسيجية المرضية لهذا النموذج مع مرض باركنسون الذي أنشأه الإنسان ، والذي يتميز بمستويات أعلى من السيتوكينات المسببة للالتهابات ، وتدهور الكولاجين ، وارتشاف العظام السنخية ^6,8.

وبالتالي ، كان الهدف من هذه الدراسة هو وصف نموذج فئران بسيط لمرض باركنسون التجريبي بناء على تقنيات حقن P. gingivalis-LPS (Pg-LPS) ، جنبا إلى جنب مع وضع الرباط حول أضراس الفك العلوي الأولى (M1). هذا نموذج له خصائص مماثلة لتلك التي لوحظت في مرض باركنسون البشري ، والذي يمكن استخدامه في دراسة آليات تطور المرض والعلاجات المستقبلية الممكنة.

Protocol

ملاحظة: تمت الموافقة على البروتوكول التجريبي للدراسة من قبل اللجنة الأخلاقية للتجارب على الحيوانات التابعة لمعهد البحوث الصحية لجزر البليار (CEEA-UIB ؛ الرقم المرجعي 163/03/21).

1. تخدير الحيوان وإعداد الإجراءات

تعقيم جميع الأدوات الجراحية (كمامات الفم المصنوعة من الألومنيوم ، مستكشف الأسنان ، رمح الماس ، المقص الجراحي ، كماشة الجراحة المجهرية ، حامل الإبرة الدقيقة ، نحات هولينباك ، مصعد جراحي مجهري السمحاق ، ومقص الجراحة المجهرية) (5 دقائق عند 135 درجة مئوية) قبل الجراحة.
قم بإعداد جميع الحلول اللازمة للإجراء في ظروف معقمة ، كما هو موضح:
1. تحضير مزيج من الكيتامين (60 ملغ/مل) والزيلازين (8 ملغ/مل) عن طريق خلط 1.6 مل من الكيتامين مع 1 مل من الزيلازين المخفف في محلول الفوسفات العازل (PBS)/محلول ملحي. يخزن المرق في درجة حرارة 4 درجات مئوية.
2. خفف أتيباميزول إلى تركيز نهائي قدره 0.25 ملغم/مل في برنامج تلفزيوني/محلول ملحي. يخزن المرق في درجة حرارة 4 درجات مئوية.
3. خفف البوبرينورفين إلى تركيز نهائي قدره 0.03 ملغم / مل في برنامج تلفزيوني / محلول ملحي. يخزن المرق في درجة حرارة 4 درجات مئوية.
4. تحضير 1 مل من Pg-LPS (1 ملغ / مل) في محلول ملحي معقم. قم بتخزين المرق في درجة حرارة -20 درجة مئوية.
للتجربة ، استخدم إناث وذكور فئران Wistar ، الذين تتراوح أعمارهم بين 12 أسبوعا ويزن 210-350 جم في وقت الجراحة. حافظ على إيواء الحيوانات في مجموعات في ظل البيئة المناسبة والظروف الثابتة (20-24 درجة مئوية ، 12 ساعة في اليوم دورات الضوء والظلام) ، مع الطعام والمياه القياسية ، المقدمة حسب الحاجة.
للحث على التخدير، يجب وزن الجرذ وتطبيق مزيج الكيتامين/الزيلازين بتركيز 80/10 ملغ/كغ داخل الصفاق (IP)، وذلك باستخدام إبرة معقمة تحت الجلد سعة 25 غ وحقنة سعة 1 مل.
بعد تخدير الفئران ، ضع الحيوان على ظهره على منصة جراحية ساخنة ؛ أثناء العملية ، قم بتغطية جسم الحيوان لمنع فقدان الحرارة.
ملاحظة: يتم تقييم عمق التخدير من خلال فقدان منعكس الدواسة أثناء العملية ومراقبة العلامات الحيوية. إذا لزم الأمر ، استخدم مخروط أنف صغير للحفاظ على التخدير مع 2٪ إيزوفلوران في 100٪ أكسجين. ضع مرهما عقيما للعين على كلتا العينين بعد تحريض التخدير لحماية القرنيات ومنع الجفاف.
أثناء الإجراءات ، يتم تطبيق الأكسجين بنسبة 100٪ باستخدام مخروط أنف صغير ، ومراقبة معدل النبض وتشبع الأكسجين عن طريق قياس التأكسج النبضي.
ملاحظة: إذا انخفض تشبع الأكسجين ومعدل النبض إلى أقل من 95٪ و 190 نبضة في الدقيقة ، على التوالي ، أوقف الإجراء وضع الحيوان في وضع الاستلقاء الجانبي حتى يصل إلى القيم الطبيعية.
افتح فم الفئران باستخدام هفوة فم من الألومنيوم حول القواطع (العلوية والسفلية) ، وسحب اللسان معها وتثبيت الفك العلوي والفك السفلي في وضع عمل مفتوح ومريح ، مما يتيح الوصول إلى أضراس الفك السفلي.
ملاحظة: إذا احتاج الحيوان إلى وضعه في الاستلقاء الجانبي ، فقم بإزالة هفوة الفم قبل تغيير موضعه لصالح الشفاء. بمجرد تخدير الحيوان ، اجمع السائل اللثوي اللثوي (GCF) قبل الجراحة (عينة في الظروف القاعدية) (اليوم 0).
اجمع العامل المشترك الأكبر كما هو موضح في الخطوات التالية:
1. ضع الحيوان على ظهره على منصة جراحية وقم بتثبيت الفك العلوي والفك السفلي في وضع مفتوح مع كمامات الفم المصنوعة من الألومنيوم.
2. اجمع عامل التحكم العالمي باستخدام ما مجموعه أربعة (اثنان لكل M1) نقطة ورق ماصة رقم 30 (قطر 0.03 سم × طول 3 سم) ، عن طريق إدخالها في شق اللثة (المسافة بين ظهارة اللثة والمينا المجاورة) حول الوسط الحنكي ل M1 حتى مقاومة طفيفة. احتفظ بنقطة الورق في نفس الموضع لمدة 30 ثانية قبل الإزالة الفورية.
3. بعد التجميع ، انقل نقطة الورق على الفور إلى قنينة بلاستيكية ، وقم بتخزينها في -80 درجة مئوية حتى أداء الفحص.

2. تقنية الرباط المحتجز وحقن Pg -LPS داخل اللثة

ملاحظة: تم إنشاء نموذج الرباط (اليوم 0) عن طريق وضع رباط حريري مضفر معقم (5/0) حول M1 بشكل ثنائي داخل التلم اللثوي باستخدام أدوات جراحية مجهرية وتثبيته بعقدة الجراح على سطح الحنك. كانت الأدوات الجراحية المجهرية المستخدمة هي كماشة الجراحة المجهرية ، وحامل إبرة مجهري ، ونحات هولينباك ، ومصعد جراحي مجهري ، ومقص جراحي مجهري. كما تم استخدام العدسات الجراحية مع مصدر ضوء LED (تكبير 3.6x).

ضع الذيل البعيد للخياطة على الجانب الحنكي من الأسنان وأدخل الجزء القريب بين ملامسة M1 وأضراس الفك العلوي الثانية (M2).
استخدم المصعد المجهري السمحاق لإدخال الخيط داخل التلم. لف الرباط حول سطح الشدق من M1 بعناية فائقة ، حيث أن الأنسجة في هذا المستوى تمثل منطقة ضيقة من اللثة المرفقة. على الجانب الحنكي ، تأكد من شد الخيط على كلا الطرفين للتأكد من دفعه إلى التلم اللثوي.
ملاحظة: إذا لوحظت مقاومة عند إدخال الخيط بين M1 و M2 ، فقد يتم فتح التلامس قليلا باستخدام مستكشف الأسنان وبر على شكل رمح الماس.
اربط نهايات الخيط بعقدة الجراح وقم بقص ذيول أقصر ما يمكن. أدخل العقدة في التلم.
ملاحظة: نصائح الأدوات الجراحية يمكن أن تسبب صدمة الفم والنزيف. تحضير شرائح صغيرة من الشاش أو مسحة القطن لإزالة الدم من تجويف الفم والضغط لوقف أي نزيف. تقلل الإدارة الدقيقة للأنسجة الرخوة باستخدام نهج الجراحة المجهرية من المضاعفات الجراحية وتؤدي إلى تقليل صدمة الأنسجة.
بعد وضع الرباط ، قم بحقن 40 ميكرولتر من Pg-LPS في محلول ملحي معقم بإبرة معقمة تحت الجلد 25 جم ومحقنة 1 مل في الأنسجة تحت اللثة (بين جذر أو عنق السن وهامش اللثة) في الجانب المتوسط الحنكي من M1 ثنائيا (اليوم 0).

3. نهاية الإجراء

بعد وضع الربط وتطبيق Pg-LPS ، حرر الفئران من الحالة الجراحية وضعها في قفص فردي نظيف تحت مصباح حراري.
حقن المضاد أتيباميزول (0.5 ملغ/كغ تحت الجلد (SC)) بإبرة معقمة تحت الجلد 25 غ ومحقنة سعة 1 مل.
لتخفيف الألم، يتم حقن 0.03 ملغ/ كغ من البوبرينورفين، SC.
راقب تعافي الحيوان حتى يتم عكس آثار العملية تماما. إيواء كل فأر بشكل فردي في البيئة المناسبة في ظل ظروف ثابتة (20-24 درجة مئوية ، 12 ساعة في اليوم دورات الضوء والظلام). تقديم الطعام والماء منزوع الأيونات ad libitum.
خلال أول 2 أيام بعد العملية ، تزن الحيوانات وحقن البوبرينورفين SC مرتين يوميا لتخفيف الآلام.
ملاحظة: يمكن إعطاء البوبرينورفين قبل البدء في الإجراء للقضاء على تأثير الريح.
خلال وقت التجربة ، راقب الحيوانات حسب الوزن وتقييم السلوك العام مرة أو مرتين في الأسبوع.

4. متابعة ما بعد الإجراء

ملاحظة: تم الحفاظ على تحريض PD لمدة 14 يوما لتعزيز تراكم البكتيريا بيوفيلم وما يترتب على ذلك من التهاب. يجب فحص الأربطة وتعديلها ، ويتم حقن Pg-LPS ثلاث مرات في الأسبوع (اليوم 2 ، اليوم 4 ، اليوم 6 ، اليوم 8 ، اليوم 10 ، واليوم 12).

فحص وضبط الرباط (اليوم 2 ، اليوم 4 ، اليوم 6 ، اليوم 8 ، اليوم 10 ، واليوم 12) على النحو التالي:
1. تخدير مع 2٪ إيزوفلوران في 100٪ أكسجين باستخدام غرفة تحريض التخدير.
2. بعد تخدير الفئران ، ضع الحيوان على ظهره واستخدم مخروط أنف صغير أثناء العملية مع 1٪ إيزوفلوران في أكسجين 100٪ للحفاظ على تخدير الحيوان.
3. افتح فم الفئران باستخدام هفوة الفم المصنوعة من الألومنيوم حول القواطع (العلوية والسفلية) ، واسحب اللسان بها وثبت الفك العلوي والفك السفلي في وضع عمل مفتوح ومريح ، مما يتيح الوصول إلى الأحرف المركبة.
4. شد الأربطة ضد اللثة بمساعدة مصعد جراحي مجهري السمحاق ، وتأكد من إدخال خياطة الأربطة ، مما يخلق التهابا حول اللثة.
  ملاحظة: من الممكن أن يتم فقدان الأربطة بعد 7-10 أيام من الجراحة. إذا حدث هذا ، فاتبع البروتوكول كما هو موضح لحقن Pg-LPS (الخطوة 2.4).
بعد ضبط الرباط ، قم بحقن 40 ميكرولتر من Pg-LPS بشكل ثنائي بإبرة معقمة تحت الجلد 25 جم ومحقنة 1 مل إلى الأنسجة تحت اللثة في الجانب المتوسط الحنكي من M1 (اليوم 2 ، اليوم 4 ، اليوم 6 ، اليوم 8 ، اليوم 10 ، واليوم 12).
إزالة مخروط الأنف للتخدير ووضع الفئران في قفصه. راقب تعافي الحيوان حتى يتم عكس آثار التخدير تماما.

5. التضحية بالحيوانات وتحليلها

ملاحظة: هناك خيارات مختلفة لتقييم تقدم بيانات الأداء. هنا ، يتكون التحليل الموصوف من تقييم السيتوكينات المؤيدة للالتهابات في السائل اللثوي (GCF) ، وتقييم فقدان العظم السنخي.

في اليوم 14 من الدراسة (اليوم 14) ، ضحي بالحيوانات بثاني أكسيد الكربون₂ في غرفة ثاني أكسيد الكربون. يوصى بمعدل إزاحة من 30٪ إلى 70٪ من حجم الغرفة / دقيقة للقوارض.
ملاحظة: يجب التحقق من عدم استجابة الحيوان لمنعكس الدواسة وغياب العلامات الحيوية لتأكيد القتل الرحيم.
اجمع العامل المشترك الأكبر كما هو موضح في الخطوات التالية:
ملاحظة: يتم جمع العامل المشترك الأكبر قبل تحريض PD (قبل الجراحة) (اليوم 0) وبعد تحريض PD (بعد التضحية) (اليوم 14).
1. ضع الحيوان على ظهره على منصة جراحية ، وقم بتثبيت الفك العلوي والفك السفلي في وضع مفتوح مع كمامات الفم المصنوعة من الألومنيوم.
2. اجمع العامل المشترك الأكبر باستخدام نقطة الورق الممتزة رقم 30 (قطر 0.03 سم × طول 3 سم) عن طريق إدخالها في شق اللثة حول الوسط الحنكي ل M1 حتى مقاومة طفيفة. احتفظ بنقطة الورق في نفس الموضع لمدة 30 ثانية قبل الإزالة الفورية.
3. بعد التجميع ، انقل نقطة الورق على الفور إلى قنينة بلاستيكية واحفظها في درجة حرارة -80 درجة مئوية حتى أداء الفحص.
لتقييم البروتينات داخل الصندوق الأخضر للمناخ ، قم بإعداد المحاليل التالية واتبع خطوات طريقة الشطف كما هو موضح:
ملاحظة: يتم تقييم IL-1β على العامل المشترك الأكبر (اليوم 14) باستخدام مقايسة مناعية ، وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
1. قم بإعداد محلول الشطف طازجا واحتفظ به على الجليد طوال عملية الاستخراج بأكملها لمنع نشاط الأنزيم البروتيني.
2. قم بإعداد جميع الحلول اللازمة للمخزن المؤقت للشطف كما هو موضح:
  1. تحضير 1 مل من الأبروتينين (1 ملغ / مل) في ماء عالي النقاء.
  2. تحضير 10 مل من فينيل ميثيل سلفونيل فلوريد (PMSF) (200 مللي مول) في الميثانول.
  3. أضف 125 ميكرولتر من PMSF و 250 ميكرولتر من Aprotinin إلى 24.5 مل من محلول PBS (الرقم الهيدروجيني = 7.4) لتحضير محلول الشطف.
3. قم بإذابة قرص واحد من مثبطات الفوسفاتيز التجارية مع 10 مل من محلول الشطف الطازج لمدة 10 دقائق تحت التحريك عند 4 درجات مئوية.
  ملاحظة: مدة شطف العامل المشترك الأكبر محدودة. استخدم على الفور لأجهزة الطرد المركزي بعد إضافة قرص مثبطات الفوسفاتيز خلال أول 30 دقيقة.
4. بعد إضافة مثبط الفوسفاتيز ، أضف 11 ميكرولتر من محلول الشطف الكامل مباشرة على الأنبوب مع نقاط الورق.
5. جهاز طرد مركزي الأنبوب عند 452 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
6. انقل المحتوى المستحضر إلى قارورة بلاستيكية جديدة. كرر هذه العملية أربع مرات إضافية للحصول على حجم إجمالي 50 ميكرولتر.
7. بعد الطرد المركزي الأخير ، أضف حجما إجماليا قدره 60 ميكرولتر مباشرة على نقطة الورق ، وأجهزة الطرد المركزي مرة أخيرة عند 452 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
8. استخدم الحجم المطلوب لتقييم البروتين.
بعد القتل الرحيم وجمع GCF ، بمساعدة مقص جراحي ، قم بقطع الفك العلوي للفئران. حاول أن تقشر قناع الفئران وتترك أقل قدر ممكن من الأنسجة الرخوة.
ضع الفك في مرحلة المجهر للتصور والتقط صورة بالتكبير المطلوب.
ضع الفك مباشرة في 4٪ بارافورمالدهيد (PFA) مخفف في برنامج تلفزيوني. قم بالتحديث مرتين في الأسبوع باستخدام PFA الجديد لمدة 12 يوما للتثبيت الكامل.
تنبيه: يجب تنفيذ الخطوات التي تتضمن PFA في غطاء دخان باتباع توصيات ورقة بيانات السلامة.
بعد التثبيت الكامل للفك ، قم بتقييم فقدان العظام باستخدام ماسح التصوير المقطعي المحوسب المخروطي (CBCT) ، على النحو التالي:
1. افتح جهاز الكمبيوتر.
2. افتح برنامج تحليل CBCT.
3. حدد بروتوكول المسح الضوئي > وضع فحص طقم الأسنان.
4. حدد مجال الرؤية (FOV) > ( 11 × 8) HIRes ( 90 كيلو فولت من الجهد و 3 مللي أمبير من التيار).
5. ضع الفك العلوي الثابت للفئران في جسر الرافعة.
6. انقر فوق التالي.
7. انقر فوق زر إطلاق الأشعة السينية (اضغط على جهاز التحكم عن بعد بالأشعة السينية لإجراء الانبعاث واستمر في الضغط عليه طوال مدة الفحص).
8. إذا لزم الأمر ، قم بنقل الفك العلوي العلوي في وسط المستوى الأمامي عن طريق الضغط على زر التحكم ، ثم انقر فوق زر إطلاق الأشعة السينية (اضغط على جهاز التحكم عن بعد بالأشعة السينية لإجراء الانبعاث واستمر في الضغط عليه طوال مدة الفحص).
9. انقر فوق التالي.
10. انقر فوق زر إطلاق الأشعة السينية (اضغط على جهاز التحكم عن بعد بالأشعة السينية لإجراء الانبعاث واستمر في الضغط عليه طوال مدة الفحص).
11. إذا لزم الأمر ، انقل طقم الأسنان في وسط الطائرة السهمية عن طريق الضغط على زر التحكم ، ثم انقر فوق زر إطلاق الأشعة السينية (اضغط على جهاز التحكم عن بعد بالأشعة السينية لإجراء الانبعاث واستمر في الضغط عليه طوال مدة الفحص).
12. انقر فوق التالي.
13. انقر فوق الزر "ابدأ" (اضغط على جهاز التحكم عن بعد بالأشعة السينية لإجراء الانبعاث واستمر في الضغط عليه طوال مدة الاختبار). انتظر حتى تتلقى رسالة معالجة، ثم اتبع الإرشادات الموضحة.
14. يظهر عرض نافذة. قم بتنظيم اللون الرمادي بنسبة 65٪ وانقر فوق تطبيق.
15. لحفظ الفحص ، انقر فوق ملف واحفظه بتنسيق DICOM. ثم ، انقر فوق كل الصور وفي نافذة تحديد تصدير DICOM ، حدد جميع المعلمات المعروضة (الصورة الأولية ، المحورية الأصلية ، المحورية المعاد تنسيقها ، متعددة المستويات) وحدد النوع المحدد مسبقا.
معالجة الصور التمثيلية ثنائية الأبعاد والسهمية لأضراس الفك العلوي باستخدام برنامج تحليل، على النحو التالي:
1. افتح البرنامج.
2. انقر فوق ملف وفتح، ثم حدد المجلد الذي يحتوي على صور بتنسيق DICOM وانقر فوق فتح.
3. انتظر حتى تظهر النافذة "تحويل إلى 8 بت" ، وحدد النطاق من 0 إلى 6000 ، وانقر فوق موافق.
4. انقر على الصور الأولية.
5. حدد أعلى وأسفل التحديد للحد من منطقة الاهتمام. ابحث عن الصور الأولى والأخيرة حيث يظهر العظم السنخي وحدده باستخدام أوامر أعلى التحديد وأسفل التحديد .
  ملاحظة: يمكن تصدير صور تمثيلية ثنائية الأبعاد للعظم السنخي للأضراس ، كما في الشكل 3A ، B.
6. للحصول على صور تمثيلية سهمية ، انقر فوق تبديل شريط الملف الشخصي.
7. ارسم خطا سهميا في منتصف الحنك وانقر فوق نموذج Reslice. حدد معلمات لتحديد منطقة الاهتمام (تباعد الشرائح: 1؛ عدد الشرائح: 100) وانقر موافق. انتظر حتى ينتهي نموذج إعادة التقطيع. أخيرا ، انقر فوق حفظ الصور المقطعة.
  ملاحظة: يمكن تصدير التخيلات السهمية التمثيلية للعظم السنخي للأضراس ، كما في الشكل 3C ، D.

النتائج

يتم عرض جدول زمني للخطوات التجريبية في الشكل 1. يوضح الشكل 2 أ صورة للفك السفلي بعد التدخل الجراحي ، مع وضع الرباط حول تلم M1 في الوقت 0 من التجربة. يوضح الشكل 2B كيف ، بعد 14 يوما من الإجراء ، يدخل الرباط حول M1 إلى التلم اللثوي ، مما يسبب التهاب الل...

Discussion

تصف هذه الطريقة تحريض PD في الفئران بعد تقنية مشتركة لحقن Pg-LPS ووضع الرباط حول M1 ، مما يكشف أنه يمكن إحداث تغييرات كبيرة في أنسجة اللثة والعظام السنخية في غضون 14 يوما بعد هذه الطريقة.

خلال هذا الإجراء ، يجب توفير الاهتمام بالخطوات الحاسمة المختلفة. أثناء تخدير الحيوانات و...

Disclosures

يعلن أصحاب البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح.

Acknowledgements

تم دعم هذا العمل من قبل Fundació Universitat-Empresa de les Illes Balears (دعوة إثبات المفهوم 2020) ، من قبل معهد الصحة كارلوس الثالث ، وزارة الاقتصاد والمنافسة ، بتمويل مشترك من الصندوق الاجتماعي الأوروبي ESF وصندوق التنمية الإقليمية الأوروبي ERDF (عقد مع M.M.B; FI18/00104) ومن قبل المديرية العامة للتحقيقات، وكونسيلريا دي للتحقيقات، وحاكم باليار (عقد مع M.M.F.C; FPI/040/2020). يشكر المؤلفون الدكتورة آنا توماس وماريا تورتوسا على مساعدتهما في الجراحة التجريبية ومنصة IdISBa. أخيرا ، شكرا لكلية طب الأسنان ADEMA للوصول إلى الماسح الضوئي CBCT.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adsorbent paper point nº30	Proclinc	8187
Aprotinin	Sigma-Aldrich	A1153
Atipamezole	Dechra	573751.5	Revanzol 5 mg/mL
Braided silk ligature (5/0)	Laboratorio Arago Sl	613112
Buprenorphine	Richter pharma	578816.6	Bupaq 0.3 mg/mL
Cone-beam computed tomography (CBCT) Scanner	MyRay	hyperion X9	Model Hyperion X9
CTAn software	SkyScan		Version 1.13.4.0
Dental explorer	Proclinc	99743
Diamond lance-shaped bur	Dentaltix	IT21517
Food maintenance diet	Sodispain research	ROD14
Heated surgical platform	PetSavers
Hollenback carver	Hu-FRIEDY	HF45234
Hypodermic needle	BD	300600	25G X 5/8” - 0,5 X 16 MM
Isoflurane	Karizoo		Isoflutek 1000mg/g
Ketamine	Dechra	581140.6	Anesketin 100 mg/mL
Lipopolysaccharide derived from P.Gingivalis	InvivoGen	TLRL-PGLPS
Methanol	Fisher Scientific	M/4000/PB08
Micro needle holter	Fehling Surgical Instruments	KOT-6
Microsurgical pliers	KLS Martin	12-384-06-07
microsurgical scissors	S&T microsurgical instruments	SDC-15 RV
Monitor iMEC 8 Vet	Mindray
Multiplex bead immunoassay	Procartaplex, Thermo fisher Scientific	PPX-05
Paraformaldehyde (PFA)	Sigma-Aldrich	8187151000
Periosteal microsurgical elevator	Dentaltix	CU19112468
Phenylmethylsulfonylfluoride (PMSF)	Roche	10837091001
Phosphate Buffer Solution (PBS)	Capricorn Scientific	PBS-1A
PhosSTOP	Roche	4906845001	Commercial phosphatase inhibitor tablet
Plastic vial	SPL Lifesciencies	60015	1.5mL
Saline	Cinfa	204024.3
Stereo Microscope	Zeiss		Model SteREO Discovery.V12
Surgical loupes led light	Zeiss
Surgical scissors	Zepf Surgical	08-1701-17
Syringe	BD plastipak	303172	1mL
Veterinary dental micromotor	Eickemeyer	174028
Xylazine	Calier	20102-003	Xilagesic 20 mg/mL

References

Carvalho, J. D. S., et al. Impact of citrus flavonoid supplementation on inflammation in lipopolysaccharide-induced periodontal disease in mice. Food and Function. 12 (11), 5007-5017 (2021).
Nazir, M. A. Prevalence of periodontal disease, its association with systemic diseases and prevention. International Journal of Health Sciences. 1 (2), 72-80 (2017).
Dumitrescu, A. L., El-Aleem, S. A., Morales-Aza, B., Donaldson, L. F. A model of periodontitis in the rat: Effect of lipopolysaccharide on bone resorption, osteoclast activity, and local peptidergic innervation. Journal of Clinical Periodontology. 31 (8), 596-603 (2004).
Wang, H. Y., et al. Preventive effects of the novel antimicrobial peptide Nal-P-113 in a rat Periodontitis model by limiting the growth of Porphyromonas gingivalis and modulating IL-1β and TNF-α production. BMC Complementary and Alternative Medicine. 17 (1), 1-10 (2017).
Guan, J., Zhang, D., Wang, C. Identifying periodontitis risk factors through a retrospective analysis of 80 cases. Pakistan Journal of Medical Sciences. 38 (1), 293-296 (2021).
Khajuria, D. K., Patil, O. N., Karasik, D., Razdan, R. Development and evaluation of novel biodegradable chitosan based metformin intrapocket dental film for the management of periodontitis and alveolar bone loss in a rat model. Archives of Oral Biology. 85, 120-129 (2018).
Nishida, E., et al. Bone resorption and local interleukin-1alpha and interleukin-1beta synthesis induced by Actinobacillus actinomycetemcomitans and Porphyromonas gingivalis lipopolysaccharide. Journal of Periodontal Research. 36 (1), 1-8 (2001).
Graves, D. T., Kang, J., Andriankaja, O., Wada, K., Rossa, C. Animal models to study host-bacteria interactions involved in periodontitis. Bone. 23 (1), 1-7 (2008).
Struillou, X., Boutigny, H., Soueidan, A., Layrolle, P. Experimental animal models in periodontology: a review. The Open Dentistry Journal. 4 (1), 37-47 (2010).
Mustafa, H., et al. Induction of periodontal disease via retentive ligature, lipopolysaccharide injection, and their combination in a rat model. Polish Journal of Veterinary Sciences. 24 (3), 365-373 (2021).
Chadwick, J. W., Glogauer, M. Robust ligature-induced model of murine periodontitis for the evaluation of oral neutrophils. Journal of Visualized Experiments. 2020 (155), 6-13 (2019).
Cheng, R., Wu, Z., Li, M., Shao, M., Hu, T. Interleukin-1β is a potential therapeutic target for periodontitis: a narrative review. International Journal of Oral Science. 12 (1), 1-9 (2020).
Abe, T., Hajishengallis, G. Optimization of the ligature-induced periodontitis model in mice. Journal of Immunological Methods. 394 (1-2), 49-54 (2013).
Jeong-Hyon, K., Bon-Hyuk, G., Sang-Soo, N., Yeon-Cheol, P. A review of rat models of periodontitis treated with natural extracts. Journal of Traditional Chinese Medical Sciences. 7 (2), 95-103 (2020).
Marchesan, J., et al. An experimental murine model to study periodontitis. Nature Protocols. 13 (10), 2247-2267 (2018).
Lin, P., et al. Application of ligature-induced periodontitis in mice to explore the molecular mechanism of periodontal disease. International Journal of Molecular Sciences. 22 (16), 8900 (2021).
Irie, M. S., et al. Use of micro-computed tomography for bone evaluation in dentistry. Brazilian Dental Journal. 29 (3), 227-238 (2018).
Haas, L. F., Zimmermann, G. S., De Luca Canto, G., Flores-Mir, C., Corrêa, M. Precision of cone beam CT to assess periodontal bone defects: a systematic review and meta-analysis. Dentomaxillofacial Radiology. 47 (2), 20170084 (2018).
Kamburoğlu, K., Ereş, G., Akgün, C. Qualitative and quantitative assessment of alveolar bone destruction in adult rats using CBCT. Journal of Veterinary Dentistry. 36 (4), 245-250 (2019).
Sousa Melo, S. L., Rovaris, K., Javaheri, A. M., de Rezen de Barbosa, G. L. Cone-beam computed tomography (CBCT) imaging for the assessment of periodontal disease. Current Oral Health Reports. 7 (4), 376-380 (2020).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

192

This article has been published

Video Coming Soon

Keep me updated:

Method Article