Индукция пародонтита с помощью комбинации лигатуры и инъекции липополисахарида на крысиной модели

Резюме

В этом исследовании крысиная модель индукции пародонтита представлена с помощью комбинации ретенционной лигатуры и повторяющихся инъекций липополисахарида, полученного из Porphyromonas gingivalis, в течение 14 дней вокруг первых верхнечелюстных моляров. Методы лигирования и инъекции ЛПС были эффективны в индуцировании перидонтита, что приводило к потере альвеолярной кости и воспалению.

Аннотация

Пародонтит (БП) является широко распространенным хроническим иммуновоспалительным заболеванием пародонта, которое приводит к потере мягких тканей десны, периодонтальной связки, цемента и альвеолярной кости. В данном исследовании описан простой метод индукции БП у крыс. Мы предоставляем подробные инструкции по размещению лигатурной модели вокруг первых верхнечелюстных моляров (M1) и комбинации инъекций липополисахарида (LPS), полученного из Porphyromonas gingivalis на мезио-небной стороне M1. Индукция пародонтита сохранялась в течение 14 дней, способствуя накоплению биопленки бактерий и воспалению. Для проверки животной модели IL-1β, ключевой медиатор воспаления, был определен с помощью иммуноанализа в десневой щелевой жидкости (ЗКФ), а потеря альвеолярной кости была рассчитана с использованием конусно-лучевой компьютерной томографии (КЛКТ). Этот метод был эффективен в стимулировании рецессии десны, потери альвеолярной кости и повышения уровня IL-1β в ЗКФ в конце экспериментальной процедуры через 14 дней. Этот метод был эффективен в индуцировании БП, поэтому его можно было использовать в исследованиях механизмов прогрессирования заболевания и будущих возможных методов лечения.

Введение

Пародонтит (БП) является шестым по распространенности заболеванием общественного здравоохранения во всем мире, затрагивающим примерно 11% всего населения, являясь прогрессирующей, необратимой и деструктивной формой заболевания пародонта ^1,2. БП – воспалительный процесс, поражающий ткани десны и пародонта, в результате чего происходит рецессия десны, апикальная миграция соединительного эпителия с развитием кармана, потеря альвеолярной кости³. Кроме того, болезнь Паркинсона связана с несколькими системными заболеваниями, включая сердечно-сосудистые заболевания, ожирение, диабет и ревматоидный артрит, для которых факторы окружающей среды и хозяина играют значительную роль ^4,5.

Следовательно, БП является многофакторным заболеванием, инициируемым в первую очередь накоплением микробного налета в результате дисбактериоза микробных сообществ и преувеличенным иммунным ответом хозяина на патогены пародонта, что приводит к разрушению ткани пародонта ^4,6. Среди нескольких пародонтальных бактерий грамотрицательная анаэробная бактерия Porphyromonas gingivalis является одним из ключевых патогенов PD⁴. P. gingivalis содержит в своих стенках сложный липополисахарид (ЛПС), молекулу, которая, как известно, индуцирует полиморфноядерную инфильтрацию лейкоцитов и расширение сосудов в воспаленных тканях пародонта⁷. Это приводит к выработке медиаторов воспаления, таких как интерлейкин 1 (IL-1), IL-6 и IL-8, фактор некроза опухоли (TNF) или простагландины, с последующей активацией остеокластов и резорбцией кости, что приводит к разрушению тканей и окончательной потере зубов³.

К различным преимуществам животных моделей можно отнести способность имитировать клеточные сложности, как у людей, или быть более точными, чем исследования in vitro , которые проводятся на пластиковых поверхностях с ограниченными типами клеток⁸. Для экспериментального моделирования БП in vivo использовались различные виды животных, такие как нечеловекообразные приматы, собаки, свиньи, хорьки, кролики, мыши и крысы⁹. Тем не менее, крысы являются наиболее широко изученной животной моделью патогенеза БП, потому что они недороги и просты в обращении¹⁰. Их зубная десневая ткань имеет схожие структурные особенности с десневой тканью человека, с неглубокой десневой бороздой и соединительным эпителием, прикрепленным к поверхности зуба. Кроме того, как и у человека, соединительный эпителий облегчает прохождение бактериальных, чужеродных материалов и экссудата из воспалительных клеток ⁹.

Одной из наиболее известных экспериментальных моделей индукции БП у крыс является размещение лигатур вокруг зубов, что технически сложно, но надежно¹⁰. Размещение лигатуры способствует образованию зубного налета и накоплению бактерий, вызывая дисбактериоз в десневых бороздах, что вызывает воспаление и разрушение тканей пародонта¹¹. Потеря прикрепления пародонта и резорбция альвеолярной кости могут произойти через 7 дней у этой крысы модели⁸.

Другая животная модель БП состоит из инъекции ЛПС в десневую ткань. В результате стимулируется остеокластогенез и потеря костной массы. Гистопатологические особенности этой модели сходны с установленной человеком болезнью Паркинсона, характеризуются более высокими уровнями провоспалительных цитокинов, деградацией коллагена и резорбцией альвеолярной кости ^6,8.

Таким образом, целью данного исследования было описание простой модели экспериментальной БП на крысах, основанной на методах инъекций P. gingivalis-LPS (Pg-LPS) в сочетании с размещением лигатуры вокруг первых верхнечелюстных моляров (M1). Это модель с характеристиками, аналогичными тем, которые наблюдаются при заболевании БП человека, которая может быть использована при изучении механизмов прогрессирования заболевания и будущих возможных методов лечения.

протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: Экспериментальный протокол исследования был одобрен Этическим комитетом по экспериментам на животных Научно-исследовательского института здравоохранения Балеарских островов (CEEA-UIB; номер ссылки 163/03/21).

1. Анестезия для животных и подготовка к процедуре

1. Перед операцией стерилизуйте все хирургические инструменты (алюминиевые кляпы, стоматологический проводник, алмазное копье, хирургические ножницы, микрохирургические плоскогубцы, держатель микроиглы, резчик по полой спинке, периостальный микрохирургический элеватор и микрохирургические ножницы) (5 мин при 135 °C).
2. Приготовьте все растворы, необходимые для процедуры в стерильных условиях, как описано:
   1. Приготовьте смесь кетамина (60 мг / мл) и ксилазина (8 мг / мл), смешав 1,6 мл кетамина с 1 мл ксилазина, разбавленного в фосфатном буферном растворе (PBS) / физиологическом растворе. Храните бульон при температуре 4 °C.
   2. Разбавьте атипамезол до конечной концентрации 0,25 мг / мл в PBS / физиологическом растворе. Храните бульон при температуре 4 °C.
   3. Разбавьте бупренорфин до конечной концентрации 0,03 мг / мл в PBS / физиологическом растворе. Храните бульон при температуре 4 °C.
   4. Приготовьте 1 мл Pg-LPS (1 мг / мл) в стерильном физиологическом растворе. Храните бульон при температуре -20 °C.
3. Для эксперимента использовали самок и самцов крыс Вистар, в возрасте 12 недель и весом 210-350 г на момент операции. Содержание животных в группах в соответствующей среде и постоянных условиях (20-24 °C, 12 ч в сутки светлый-темный) с кормом и стандартной водой, предлагаемой ad libitum.
4. Чтобы вызвать анестезию, взвесьте крысу и введите смесь кетамина / ксилазина в концентрации 80/10 мг / кг внутрибрюшинно (IP), используя стерильную иглу для подкожных инъекций 25 г и шприц объемом 1 мл.
5. После того, как крыса будет обезболена, положите животное на спину на подогретую хирургическую платформу; Во время процедуры накрывайте тело животного, чтобы предотвратить потерю тепла.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Глубина анестезии оценивается по потере педального рефлекса во время процедуры и мониторингу жизненно важных функций. При необходимости используйте маленький носовой конус для поддержания анестезии с 2% изофлураном в 100% кислороде. Нанесите стерильную офтальмологическую мазь на оба глаза после индукции анестезии, чтобы защитить роговицу и предотвратить высыхание.
6. Во время процедур вводите 100% кислород с помощью небольшого носового конуса и контролируйте частоту пульса и насыщение кислородом с помощью пульсоксиметрии.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если насыщение кислородом и частота пульса падают ниже 95% и 190 ударов в минуту соответственно, прекратите процедуру и поместите животное в положение бокового пролежня до достижения нормальных значений.
7. Откройте рот крысы с помощью алюминиевого ротового кляпа вокруг резцов (верхних и нижних), втягивая им язык и стабилизируя верхнюю и нижнюю челюсти в открытом, удобном рабочем положении, обеспечивая доступ к нижнечелюстным молярам.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если животное необходимо поместить в боковой пролежень, удалите ротовой кляп, прежде чем менять его положение, чтобы способствовать выздоровлению. После того, как животное будет анестезировано, соберите десневую щельную жидкость (ЗКФ) перед операцией (образец в базальных условиях) (день 0).
8. Соберите GCF, как описано в следующих шагах:
   1. Положите животное на спину на хирургическую платформу и стабилизируйте верхнюю челюсть и нижнюю челюсть в открытом положении с помощью алюминиевых ротовых кляпов.
   2. Соберите ЗКФ, используя в общей сложности четыре (по два на каждый M1) абсорбирующий бумажный наконечник No 30 (диаметр 0,03 см x длина 3 см), вставив его в десневую щель (пространство между десневым эпителием и прилегающей эмалью) вокруг мезио-небного отдела M1 до небольшого сопротивления. Удерживайте точку бумаги в одном и том же положении в течение 30 секунд перед немедленным удалением.
   3. После сбора немедленно переложите бумажную точку в пластиковый флакон и храните при температуре -80 °C до проведения анализа.

2. Техника ретенционной лигатуры и интрадесневальная инъекция Pg-LPS

ПРИМЕЧАНИЕ: Модель лигатуры была создана (день 0) путем размещения стерильной плетеной шелковой лигатуры (5/0) вокруг M1 на двусторонней основе в десневой борозде с помощью микрохирургических инструментов и закрепления ее узлами хирурга на небной поверхности. В качестве микрохирургических инструментов использовались микрохирургические плоскогубцы, держатель микроиглы, резчик по полой спине, периостальный микрохирургический лифт и микрохирургические ножницы. Также использовались хирургические лупы со светодиодным источником света (3,6-кратное увеличение).

1. Расположите дистальный хвост шва на небной стороне зубного ряда и вставьте проксимальный сегмент между контактом M1 и вторыми верхнечелюстными молярами (M2).
2. Используйте периостальный микрохирургический элеватор, чтобы вставить шов в борозду. Оберните лигатуру вокруг щечной поверхности М1 очень осторожно, так как ткани на этом уровне представляют собой узкую зону прикрепленной десны. Что касается небного аспекта, убедитесь, что шов затянут с обоих концов, чтобы он был вбит в десневую борозду.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если при наложении шва между M1 и M2 наблюдается сопротивление, контакт можно слегка разомкнуть с помощью стоматологического проводника и ромбовидного бора.
3. Завяжите концы шва хирургическим узлом и обрежьте хвостики как можно короче. Вставьте узел в борозду.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Наконечники хирургических инструментов могут вызвать травму полости рта и кровотечение. Подготовьте небольшие сегменты марли или ватного тампона, чтобы удалить кровь из полости рта и надавить, чтобы остановить кровоизлияние. Тщательное лечение мягких тканей с помощью микрохирургического подхода сводит к минимуму хирургические осложнения и приводит к меньшей травматизации тканей.
4. После лигатурного позиционирования вводят 40 мкл Pg-LPS в стерильном физиологическом растворе стерильной иглой для подкожных инъекций 25 г и шприцем объемом 1 мл в поддесневую ткань (между корнем или шейкой зуба и краем десны) на мезио-небной стороне M1 на двусторонней основе (0-й день).

3. Окончание процедуры

1. После лигирования, позиционирования и применения Pg-LPS освободите крысу от хирургического состояния и поместите ее в чистую индивидуальную клетку под нагревательной лампой.
2. Вводят антагонист атипамезол (0,5 мг/кг подкожно (/к)) стерильной иглой для подкожных инъекций 25 г и шприцем объемом 1 мл.
3. Для облегчения боли вводят 0,03 мг/кг бупренорфина,/к.
4. Следите за выздоровлением животного до тех пор, пока последствия операции полностью не исчезнут. Индивидуально размещайте каждую крысу в соответствующей среде в постоянных условиях (20-24 ° C, 12 ч в день светлый-темный циклы). Предлагайте еду и деионизированную воду ad libitum.
5. В течение первых 2 дней после процедуры взвесьте животных и вводите бупренорфин SC два раза в день для облегчения боли.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Бупренорфин можно вводить перед началом процедуры для устранения эффекта завода.
6. Во время эксперимента наблюдайте за животными по весу и общей оценке поведения один-два раза в неделю.

4. Послеоперационное наблюдение

ПРИМЕЧАНИЕ: Индукция БП поддерживалась в течение 14 дней, способствуя накоплению биопленки бактерий и последующему воспалению. Лигатуры должны быть исследованы и скорректированы, и Pg-LPS вводится три раза в неделю (день 2, день 4, день 6, день 8, день 10 и день 12).

1. Изучите и отрегулируйте лигатуру (день 2, день 4, день 6, день 8, день 10 и день 12) следующим образом:
   1. Анестезируют 2% изофлураном в 100% кислороде с помощью индукционной камеры анестезии.
   2. После того, как крыса будет анестезирована, поместите животное на спину и используйте небольшой носовой колбочку во время процедуры с 1% изофлураном в 100% кислороде для поддержания анестезии животного.
   3. Откройте рот крысы с помощью алюминиевого кляпа вокруг резцов (верхнего и нижнего), втягивая им язык и стабилизируя верхнюю челюсть и нижнюю челюсть в открытом, удобном рабочем положении, обеспечивая доступ к лигатурам.
   4. Затяните лигатуры против десны с помощью периостального микрохирургического лифта и убедитесь, что наложен шов лигатур, создавая воспаление вокруг десны.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Возможно, что через 7-10 дней после операции лигатуры будут потеряны. Если это произойдет, следуйте протоколу, описанному для инъекции Pg-LPS (шаг 2.4).
2. После коррекции лигатуры двусторонне вводят 40 мкл Pg-LPS стерильной иглой для подкожных инъекций 25 г и шприцем объемом 1 мл в поддесневую ткань на мезио-небной стороне M1 (2-й день, 4-й, 6-й, 8-й, 10-й и 12-й дни).
3. Удалите носовой конус для анестезии и поместите крысу в клетку. Следите за выздоровлением животного до тех пор, пока последствия анестезии полностью не исчезнут.

5. Жертвоприношение животных и анализ

ПРИМЕЧАНИЕ: Существуют различные варианты оценки прогрессирования болезни Паркинсона. Здесь описанный анализ состоит из оценки провоспалительных цитокинов в десневой щелевой жидкости (ЗКФ) и оценки потери альвеолярной кости.

1. На 14-й день исследования (14-й день) принесите в жертву животных с_СО2 в камере углекислого газа. Для грызунов рекомендуется скорость перемещения от 30% до 70% от объема камеры / мин.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Отсутствие реакции животных на педальный рефлекс и отсутствие жизненно важных функций должны быть проверены, чтобы подтвердить эвтаназию.
2. Соберите GCF, как описано в следующих шагах:
   ПРИМЕЧАНИЕ: ЗКФ собирают до индукции БП (до операции) (0-й день) и после индукции БП (после жертвоприношения) (14-й день).
   1. Положите животное на спину на хирургическую платформу и стабилизируйте верхнюю челюсть и нижнюю челюсть в открытом положении с помощью алюминиевых ротовых кляпов.
   2. Соберите ЗКФ с помощью адсорбирующей бумаги No 30 (диаметр 0,03 см x длина 3 см), вставив его в десневую щель вокруг мезио-небной части M1 до небольшого сопротивления. Удерживайте точку бумаги в одном и том же положении в течение 30 секунд перед немедленным удалением.
   3. После сбора немедленно переложите бумажную точку в пластиковый флакон и храните при температуре -80 °C до проведения анализа.
3. Чтобы оценить белки в ЗКФ, приготовьте следующие растворы и следуйте описанным этапам метода элюирования:
   ПРИМЕЧАНИЕ: IL-1β оценивается на ЗКФ (14-й день) с использованием иммуноанализа, согласно протоколу производителя.
   1. Приготовьте буфер для элюирования в свежем виде и держите его на льду в течение всего процесса экстракции, чтобы подавить активность протеазы.
   2. Приготовьте все растворы, необходимые для элюирующего буфера, как описано:
      1. Приготовьте 1 мл апротинина (1 мг/мл) в сверхчистой воде.
      2. Приготовьте 10 мл фенилметилсульфонилфторида (PMSF) (200 мМ) в метаноле.
      3. Добавьте 125 мкл PMSF и 250 мкл апротинина к 24,5 мл раствора PBS (pH = 7,4) для приготовления элюирующего буфера.
   3. Растворите одну коммерческую таблетку ингибитора фосфатазы 10 мл свежеприготовленного буфера для элюирования в течение 10 мин при перемешивании при 4 ° C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Продолжительность элюирования ЗКФ ограничена; Использовать немедленно для центрифугирования после добавления таблетки ингибитора фосфатазы в течение первых 30 мин.
   4. После добавления ингибитора фосфатазы добавьте 11 мкл полного элюирующего буфера непосредственно на пробирку с бумажными точками.
   5. Центрифугируйте пробирку при 452 x g в течение 5 мин при 4 °C.
   6. Перелейте элюированное содержимое в новый пластиковый флакон. Повторите этот процесс еще четыре раза, чтобы получить общий объем 50 мкл.
   7. После последнего центрифугирования добавьте общий объем 60 мкл непосредственно в точку бумаги и центрифугируйте в последний раз при 452 x g в течение 5 мин при 4 °C.
   8. Используйте необходимый объем элюирования для оценки белка.
4. После эвтаназии и сбора ЗКФ с помощью хирургических ножниц у крыс вырезают верхнюю челюсть. Постарайтесь снять маску с крысы и оставить как можно меньше мягких тканей.
5. Расположите челюсть в столике микроскопа для визуализации и сделайте снимок с нужным увеличением.
6. Поместите челюсть непосредственно в 4% параформальдегид (PFA), разбавленный PBS. Обновляйте два раза в неделю новым PFA в течение 12 дней для полной фиксации.
   ВНИМАНИЕ: Действия, связанные с PFA, следует выполнять в вытяжном шкафу в соответствии с рекомендациями паспорта безопасности.
7. После полной фиксации челюсти оцените потерю костной массы с помощью конусно-лучевой компьютерной томографии (КЛКТ) следующим образом:
   1. Откройте компьютер.
   2. Откройте программу анализа КЛКТ.
   3. Выберите «Протокол сканирования» > режим сканирования зубных протезов.
   4. Выберите поле зрения (FOV) > (11x8) HIRes (напряжение 90 кВ и ток 3 мА).
   5. Поместите фиксированную верхнюю челюсть крыс в портал.
   6. Нажмите кнопку Далее.
   7. Нажмите кнопку запуска рентгеновского излучения (нажмите на пульт дистанционного управления рентгеновским излучением, чтобы сделать излучение, и удерживайте ее нажатой в течение всего сканирования).
   8. При необходимости переместите верхнюю челюсть в центр фронтальной плоскости, нажав кнопку управления, затем нажмите кнопку рентгеновского излучения (нажмите рентгеновский пульт дистанционного управления, чтобы сделать излучение, и удерживайте его нажатым в течение всего времени сканирования).
   9. Нажмите кнопку Далее.
   10. Нажмите кнопку запуска рентгеновского излучения (нажмите на пульт дистанционного управления рентгеновским излучением, чтобы сделать излучение, и удерживайте ее нажатой в течение всего сканирования).
   11. При необходимости переместите протез в центр сагиттальной плоскости, нажав кнопку управления, затем нажмите кнопку рентгеновского излучения (нажмите рентгеновский пульт дистанционного управления, чтобы сделать излучение, и удерживайте его нажатым в течение всего времени сканирования).
   12. Нажмите кнопку Далее.
   13. Нажмите кнопку «Пуск» (нажмите на рентгеновский пульт дистанционного управления, чтобы сделать излучение, и удерживайте его нажатым в течение всего исследования). Дождитесь получения сообщения об обработке, а затем следуйте приведенным инструкциям.
   14. Появится окно. Отрегулируйте серый цвет на 65% и нажмите «Применить».
   15. Для сохранения сканирования нажмите « Файл » и сохраните его в формате DICOM. Затем нажмите « Все изображения » и в окне выбора экспорта DICOM выберите все отображаемые параметры (исходное изображение, исходное осевое, переформатированное осевое, многоплоскостное) и выберите предопределенный тип.
8. Обработайте двумерные и сагиттальные репрезентативные изображения верхнечелюстных моляров с помощью аналитической программы следующим образом:
   1. Откройте программное обеспечение.
   2. Нажмите «Файл» и «Открыть», а затем выберите папку с изображениями в формате DICOM и нажмите «Открыть».
   3. Дождитесь появления окна «Преобразовать в 8 бит», выберите диапазон от 0 до 6 000 и нажмите «ОК».
   4. Нажмите Необработанные изображения.
   5. Определите верхнюю и нижнюю части выделенной области, чтобы ограничить интересующую область. Найдите первое и последнее изображения, на которых появляется альвеолярная кость, и выделите его с помощью команд «Верхняя часть выделения» и «Нижняя часть выделения ».
      ПРИМЕЧАНИЕ: Репрезентативные двумерные изображения альвеолярной кости моляров могут быть экспортированы, как показано на рисунке 3A, B.
   6. Для сагиттальных репрезентативных изображений нажмите « Переключить панель профиля».
   7. Нарисуйте сагиттальную линию в середине неба и нажмите « Срезать модель». Определите параметры для разграничения интересующей области (интервал между фрагментами: 1; количество фрагментов: 100) и нажмите кнопку «ОК». Дождитесь окончания нарезки модели. Наконец, нажмите « Сохранить нарезанные изображения».
      ПРИМЕЧАНИЕ: Репрезентативные сагиттальные представления альвеолярной кости моляров могут быть экспортированы, как показано на рисунке 3C, D.

Результаты

График экспериментальных шагов представлен на рисунке 1. На рисунке 2А показано изображение нижней челюсти после хирургического вмешательства с размещением лигатуры вокруг борозды М1 в момент 0 эксперимента. На рисунке 2B показано, как че?...

Обсуждение

Этот метод описывает индукцию БП у крыс после комбинированной техники инъекций Pg-LPS и размещения лигатуры вокруг M1, показывая, что значительные изменения в тканях пародонта и альвеолярной кости могут быть вызваны через 14 дней после этого метода.

Во время этой процед?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adsorbent paper point nº30	Proclinc	8187
Aprotinin	Sigma-Aldrich	A1153
Atipamezole	Dechra	573751.5	Revanzol 5 mg/mL
Braided silk ligature (5/0)	Laboratorio Arago Sl	613112
Buprenorphine	Richter pharma	578816.6	Bupaq 0.3 mg/mL
Cone-beam computed tomography (CBCT) Scanner	MyRay	hyperion X9	Model Hyperion X9
CTAn software	SkyScan		Version 1.13.4.0
Dental explorer	Proclinc	99743
Diamond lance-shaped bur	Dentaltix	IT21517
Food maintenance diet	Sodispain research	ROD14
Heated surgical platform	PetSavers
Hollenback carver	Hu-FRIEDY	HF45234
Hypodermic needle	BD	300600	25G X 5/8” - 0,5 X 16 MM
Isoflurane	Karizoo		Isoflutek 1000mg/g
Ketamine	Dechra	581140.6	Anesketin 100 mg/mL
Lipopolysaccharide  derived from P.Gingivalis	InvivoGen	TLRL-PGLPS
Methanol	Fisher Scientific	M/4000/PB08
Micro needle holter	Fehling Surgical Instruments	KOT-6
Microsurgical pliers	KLS Martin	12-384-06-07
microsurgical scissors	S&T microsurgical instruments	SDC-15 RV
Monitor iMEC 8 Vet	Mindray
Multiplex bead immunoassay	Procartaplex, Thermo fisher Scientific	PPX-05
Paraformaldehyde (PFA)	Sigma-Aldrich	8187151000
Periosteal microsurgical elevator	Dentaltix	CU19112468
Phenylmethylsulfonylfluoride (PMSF)	Roche	10837091001
Phosphate Buffer Solution (PBS)	Capricorn Scientific	PBS-1A
PhosSTOP	Roche	4906845001	Commercial phosphatase inhibitor tablet
Plastic vial	SPL Lifesciencies	60015	1.5mL
Saline	Cinfa	204024.3
Stereo Microscope	Zeiss		Model SteREO Discovery.V12
Surgical loupes led light	Zeiss
Surgical scissors	Zepf Surgical	08-1701-17
Syringe	BD plastipak	303172	1mL
Veterinary dental micromotor	Eickemeyer	174028
Xylazine	Calier	20102-003	Xilagesic 20 mg/mL