השראת דלקת חניכיים באמצעות שילוב של ליגטורה והזרקת ליפופוליסכריד במודל חולדה

Marta Munar-Bestard; Oscar Villa; Maria del Mar Ferrà-Cañellas; Joana Maria Ramis; Marta Monjo

doi:10.3791/64842

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

Summary

במחקר זה, מודל חולדה של השראת דלקת חניכיים מוצג באמצעות שילוב של ליגטורה חוזרת וזריקות חוזרות ונשנות של ליפופוליסכריד שמקורו בפורפירומונס חניכיים, במשך 14 יום סביב הטוחנות המקסילריות הראשונות. טכניקות הקשירה וההזרקה LPS היו יעילות בגרימת דלקת פרידונטיקה, וכתוצאה מכך אובדן עצם מכתשית ודלקת.

Abstract

פריודונטיטיס (PD) היא מחלה דלקתית-חיסונית כרונית שכיחה ביותר של החניכיים, הגורמת לאובדן רקמת חניכיים רכה, רצועה פריודונטלית, צמנטום ועצם מכתשית. במחקר זה מתוארת שיטה פשוטה של השראת פרקינסון בחולדות. אנו מספקים הוראות מפורטות למיקום מודל הליגטורה סביב הטוחנות המקסילריות הראשונות (M1) ושילוב של זריקות ליפופוליסכריד (LPS), הנגזר מחניכיים מסוג Porphyromonas בצד המזיו-פלטלי של M1. השראת דלקת חניכיים נשמרה במשך 14 יום, קידום הצטברות של חיידקים, ביופילם ודלקת. כדי לאמת את המודל של בעלי החיים, IL-1β, מתווך דלקתי מרכזי, נקבע על ידי בדיקה חיסונית בנוזל החניכיים (GCF), ואובדן עצם מכתשית חושב באמצעות טומוגרפיה ממוחשבת של קרן חרוט (CBCT). טכניקה זו הייתה יעילה בקידום נסיגת חניכיים, אובדן עצם מכתשית ועלייה ברמות IL-1β ב- GCF בסוף הליך הניסוי לאחר 14 יום. שיטה זו הייתה יעילה בגרימת מחלת פרקינסון, ובכך ניתן היה להשתמש בה במחקרים על מנגנוני התקדמות המחלה וטיפולים אפשריים בעתיד.

Introduction

דלקת חניכיים (PD) היא מחלת בריאות הציבור השישית בשכיחותה בעולם, המשפיעה על כ-11% מכלל האוכלוסייה, בהיותה צורה מתקדמת, בלתי הפיכה והרסנית של מחלת חניכיים ^1,2. PD הוא תהליך דלקתי המשפיע על רקמות החניכיים והחניכיים, הגורם לנסיגת חניכיים, נדידה אפיקלית של אפיתל צומת עם התפתחות כיס, ואובדן עצם מכתשית³. יתר על כן, מחלת פרקינסון קשורה למספר מחלות מערכתיות, כולל מחלות לב וכלי דם, השמנת יתר, סוכרת ודלקת מפרקים שגרונית, שעבורן גורמים סביבתיים וספציפיים למארח ממלאים תפקיד משמעותי ^4,5.

לפיכך, פרקינסון היא מחלה רב-גורמית הנגרמת בעיקר על ידי הצטברות של פלאק מיקרוביאלי - הנובע מדיסביוזה של קהילות מיקרוביאליות - ועל ידי תגובה חיסונית מוגזמת של המאכסן לפתוגנים חניכיים, מה שמוביל לפירוק רקמת חניכיים ^4,6. מבין מספר חיידקי חניכיים, החיידק האנאירובי הגראם-שלילי Porphyromonas gingivalis הוא אחד הפתוגנים המרכזיים במחלת פרקינסון⁴. P. gingivalis מכיל ליפופוליסכריד מורכב (LPS) בדפנותיו, מולקולה הידועה כגורמת להסננת לויקוציטים פולימורפו-גרעיניים ולהרחבת כלי הדם ברקמות חניכיים דלקתיות⁷. התוצאה היא ייצור של מתווכי דלקת, כגון אינטרלוקין 1 (IL-1), IL-6 ו- IL-8, גורם נמק גידולי (TNF), או פרוסטגלנדינים, עם הפעלת אוסטאוקלסטים וספיגת עצם לאחר מכן, מה שמוביל להרס רקמות ולאובדן שיניים סופי³.

בין היתרונות השונים של מודלים בבעלי חיים ניתן למנות את היכולת לחקות מורכבויות תאיות כמו בבני אדם, או להיות מדויקים יותר מאשר מחקרי מבחנה , המתבצעים על משטחי פלסטיק עם סוגי תאים מוגבלים⁸. לצורך מידול ניסויי של PD in vivo, נעשה שימוש במינים שונים של בעלי חיים, כמו פרימטים לא אנושיים, כלבים, חזירים, חמוסים, ארנבות, עכברים וחולדות⁹. עם זאת, חולדות הן המודל הנחקר ביותר בבעלי חיים עבור הפתוגנזה של פרקינסון מכיוון שהן זולות וקלות לטיפול¹⁰. לרקמת החניכיים הדנטלית שלהם יש תכונות מבניות דומות לרקמת חניכיים אנושית, עם חריץ חניכיים רדוד ואפיתל צומת המחוברים לפני השטח של השן. יתר על כן, כמו בבני אדם, אפיתל צומת מאפשר מעבר של חיידקים זרים, ומפריש מתאים דלקתיים ⁹.

אחד המודלים הניסיוניים המדווחים ביותר של השראת פרקינסון בחולדות הוא מיקום הליגטורות סביב השיניים, שהוא מאתגר מבחינה טכנית אך אמין¹⁰. מיקום הליגטורה מאפשר הצטברות רובד שיניים וחיידקים, ויוצר דיסביוזיס בסולצ'י החניכיים, הגורם לדלקת והרס רקמת חניכיים¹¹. אובדן התקשרות חניכיים וספיגה מחדש של עצם מכתשית יכול להתרחש תוך 7 ימים במודל חולדה^{זה 8}.

מודל נוסף של בעלי חיים לפרקינסון מורכב מהזרקת LPS לרקמת החניכיים. כתוצאה מכך, osteoclastogenesis ואובדן עצם מגורים. המאפיינים ההיסטופתולוגיים של מודל זה דומים לפרקינסון שהוקם על ידי בני אדם, ומאופיין ברמות גבוהות יותר של ציטוקינים מעודדי דלקת, פירוק קולגן וספיגת עצם מכתשית ^6,8.

לפיכך, מטרת מחקר זה הייתה לתאר מודל פשוט של חולדה של PD ניסיוני המבוסס על טכניקות של זריקות P. gingivalis-LPS (Pg-LPS), בשילוב עם מיקום רצועות סביב הטוחנות המקסילריות הראשונות (M1). זהו מודל בעל מאפיינים דומים לאלה שנצפו במחלת פרקינסון בבני אדם, אשר יכול לשמש לחקר מנגנוני התקדמות המחלה וטיפולים אפשריים עתידיים.

Protocol

הערה: פרוטוקול הניסוי של המחקר אושר על ידי הוועדה האתית לניסויים בבעלי חיים של מכון המחקר לבריאות האיים הבלאריים (CEEA-UIB; מספר סימוכין 163/03/21).

1. הרדמה של בעלי חיים והכנת הליכים

יש לעקר את כל כלי הניתוח (פערי פה מאלומיניום, סייר שיניים, לאנס יהלום, מספריים כירורגיים, צבת מיקרוכירורגית, מחזיק מחט מיקרו, מגלף חלול, מעלית מיקרוכירורגית פריאוסטלית ומספריים מיקרוכירורגיים) (5 דקות ב-135°C) לפני הניתוח.
הכינו את כל הפתרונות הדרושים להליך בתנאים סטריליים, כמתואר:
1. הכינו תערובת של קטמין (60 מ"ג/מ"ל) וקסילזין (8 מ"ג/מ"ל) על ידי ערבוב של 1.6 מ"ל קטמין עם 1 מ"ל קסילזין מדולל בתמיסת חיץ פוספט (PBS)/מלוחים. אחסן את המלאי ב 4 °C.
2. לדלל Atipamezole לריכוז סופי של 0.25 מ"ג / מ"ל PBS / מלוחים. אחסן את המלאי ב 4 °C.
3. לדלל Buprenorphine לריכוז סופי של 0.03 מ"ג / מ"ל PBS / מלוחים. אחסן את המלאי ב 4 °C.
4. מכינים 1 מ"ל של Pg-LPS (1 מ"ג/מ"ל) במי מלח סטריליים. אחסן את המלאי ב -20 °C.
לצורך הניסוי, השתמשו בחולדות וויסטאר נקבות וזכרים, בנות 12 שבועות ובמשקל 210-350 גרם בזמן הניתוח. שמרו על בעלי החיים בקבוצות בסביבה המתאימה ובתנאים קבועים (20-24 מעלות צלזיוס, 12 שעות ביום מחזורי אור-חושך), עם מזון ומים סטנדרטיים, המוצעים אד ליביטום.
כדי לגרום להרדמה, לשקול את החולדה ולתת את תערובת קטמין/קסילזין בריכוז של 80/10 מ"ג/ק"ג תוך צפקי (IP), באמצעות מחט היפודרמית סטרילית 25 גרם ומזרק 1 מ"ל.
לאחר שהחולדה מורדמת, הניחו את החיה על גבה על פלטפורמה כירורגית מחוממת; במהלך ההליך, לכסות את הגוף של החיה כדי למנוע אובדן חום.
הערה: עומק ההרדמה מוערך על ידי אובדן רפלקס הדוושה במהלך ההליך ועל ידי ניטור סימנים חיוניים. במידת הצורך, השתמש בקונוס אף קטן כדי לשמור על הרדמה עם 2% איזופלורן ב-100% חמצן. יש למרוח משחת עיניים סטרילית על שתי העיניים לאחר השראת הרדמה כדי להגן על הקרניות ולמנוע התייבשות.
במהלך ההליכים, לנהל 100% חמצן באמצעות חרוט אף קטן, ולפקח על קצב הדופק וריווי חמצן על ידי אוקסימטריה הדופק.
הערה: אם ריווי החמצן וקצב הדופק יורדים מתחת ל-95% ו-190 פעימות לדקה, בהתאמה, יש להפסיק את ההליך ולמקם את בעל החיים במצב דקוביטוס לטרלי עד להגעה לערכים נורמליים.
יש לפתוח את פי החולדה באמצעות פה אלומיניום סביב החותכות (עליונות ותחתונות), למשוך את הלשון באמצעותה ולייצב את המקסילה והלסת התחתונה בתנוחת עבודה פתוחה ונוחה, המאפשרת גישה לטוחנות מנדיבולאריות.
הערה: אם בעל החיים צריך להיות ממוקם decubitus לרוחב, להסיר את הפה gag לפני שינוי המיקום שלה לטובת התאוששות. לאחר הרדמת בעל החיים, יש לאסוף את נוזל החניכיים (GCF) לפני הניתוח (דגימה בתנאי בסיס) (יום 0).
אסוף GCF כמתואר בשלבים הבאים:
1. הניחו את בעל החיים על גבו על משטח כירורגי וייצבו את המקסילה והלסת התחתונה במצב פתוח עם סתימות פה מאלומיניום.
2. יש לאסוף GCF באמצעות ארבע (שתיים לכל M1) נקודת נייר סופג nº 30 (קוטר 0.03 ס"מ x אורך 3 ס"מ), על ידי הכנסתו לנקיק החניכיים (רווח בין אפיתל חניכיים לאמייל סמוך) סביב המזו-פלטל של M1 עד להתנגדות קלה. שמור על נקודת הנייר באותו מיקום למשך 30 שניות בסך הכל לפני ההסרה המיידית.
3. לאחר האיסוף, העבירו את נקודת הנייר מיד לבקבוקון פלסטיק, ואחסנו בטמפרטורה של -80°C עד לביצועי המבחן.

2. טכניקת ליגטורה שומרת והזרקת Pg -LPS תוך חניכיים

הערה: מודל הליגטורה נוצר (יום 0) על ידי הנחת ליגטורה משי קלועה סטרילית (5/0) סביב M1 דו-צדדית בתוך חריץ החניכיים באמצעות מכשירים מיקרוכירורגיים ואבטחתו עם קשרי המנתח על משטח החיך. המכשירים המיקרוכירורגיים ששימשו היו צבת מיקרוכירורגית, מחזיק מחט מיקרו, מגלף חלול, מעלית מיקרוכירורגית פריאוסטאלית ומספריים מיקרוכירורגיים. נעשה שימוש גם בזכוכית מגדלת כירורגית עם מקור אור LED (הגדלה פי 3.6).

מקמו את הזנב הדיסטלי של התפר בצד החיך של השיניים והכניסו את המקטע הפרוקסימלי בין המגע של M1 לטוחנות מקסילריות שניות (M2).
השתמש במעלית המיקרוכירורגית הפריאוסטאלית כדי להחדיר את התפר בתוך החריץ. לעטוף את הרצועה סביב פני השטח buccal של M1 בזהירות רבה, כמו הרקמות ברמה זו להציג אזור צר של חניכיים מחובר. בהיבט החיך, יש לוודא שהתפר מהודק בשני קצותיו כדי לוודא שהוא נדחף לתוך החריץ של החניכיים.
הערה: אם נצפתה התנגדות בעת החדרת התפר בין ה-M1 ל-M2, ניתן לפתוח מעט את המגע באמצעות סייר דנטלי ובור בצורת לאנס יהלום.
קשרו את קצות התפר בקשר מנתח וקצצו את הזנבות קצרים ככל האפשר. הכנס את הקשר לחריץ.
הערה: קצוות של כלי ניתוח עלולים לגרום לטראומה ודימום דרך הפה. הכינו מקטעים קטנים של גזה או צמר גפן כדי להסיר דם מחלל הפה ולהפעיל לחץ כדי לעצור כל דימום. ניהול זהיר של רקמות רכות בגישה מיקרוכירורגית ממזער סיבוכים כירורגיים ומוביל לפחות טראומה לרקמות.
לאחר מיקום הליגטורה, יש להזריק 40 μL של Pg-LPS במי מלח סטריליים עם מחט היפודרמית סטרילית 25 G ומזרק 1 מ"ל לרקמה התת-חניכית (בין שורש או צוואר השן לשולי החניכיים) בצד המזו-פלטלי של M1 באופן דו-צדדי (יום 0).

3. סיום ההליך

לאחר מיקום הקשירה ויישום Pg-LPS, שחררו את החולדה מהמצב הניתוחי והניחו אותה בכלוב אישי נקי תחת מנורת חום.
הזריקו לאנטגוניסט Atipamezole (0.5 מ"ג/ק"ג תת עורית (SC)) מחט היפודרמית סטרילית 25 גרם ומזרק 1 מ"ל.
להקלה על כאבים, יש להזריק 0.03 מ"ג/ק"ג Buprenorphine, SC.
עקוב אחר התאוששות החיה עד שהשפעות הפעולה מתהפכות לחלוטין. לשכן כל חולדה בנפרד בסביבה המתאימה בתנאים קבועים (20-24 מעלות צלזיוס, 12 שעות ביום מחזורי אור-חושך). הציעו מזון ומים נטולי יונים.
במהלך היומיים הראשונים לאחר ההליך, לשקול את בעלי החיים ולהזריק Buprenorphine SC פעמיים ביום להקלה על הכאב.
הערה: Buprenorphine יכול להינתן לפני תחילת ההליך כדי לחסל את אפקט בסופו של דבר.
במהלך הניסוי, עקוב אחר בעלי החיים לפי משקל והערכת התנהגות כללית פעם או פעמיים בשבוע.

4. מעקב לאחר ההליך

הערה: השראת פרקינסון נשמרה במשך 14 יום כדי לקדם הצטברות של ביופילם חיידקים ודלקת כתוצאה מכך. יש לבדוק ולהתאים את הליגטורות, ומוזרק Pg-LPS שלוש פעמים בשבוע (יום 2, יום 4, יום 6, יום 8, יום 10 ויום 12).

בדוק והתאם את הרצועה (יום 2, יום 4, יום 6, יום 8, יום 10 ויום 12) באופן הבא:
1. מרדימים עם 2% איזופלורן ב-100% חמצן באמצעות תא השראת הרדמה.
2. לאחר שהחולדה מורדמת, הניחו את בעל החיים על גבו והשתמשו במהלך ההליך בחרוט אף קטן עם 1% איזופלורן ב-100% חמצן לתחזוקת חומר ההרדמה של החיה.
3. יש לפתוח את פי החולדה באמצעות פיו של האלומיניום סביב החותכות (עליונות ותחתונות), למשוך באמצעותו את הלשון ולייצב את המקסילה והלסת התחתונה בתנוחת עבודה פתוחה ונוחה, המאפשרת גישה לליגטורות.
4. הדקו את הרצועות כנגד החניכיים בעזרת מעלית מיקרוכירורגית פריאוסטיאלית, וודאו שתפר הליגטורות מוכנס, מה שיוצר דלקת סביב החניכיים.
  הערה: ייתכן כי 7-10 ימים לאחר הניתוח, ליגטורות אובדות. אם זה קורה, בצע את הפרוטוקול כפי שהוסבר עבור הזרקת Pg-LPS (שלב 2.4).
לאחר התאמת הליגטורה, יש להזריק באופן דו-צדדי 40 מיקרוליטר של Pg-LPS עם מחט היפודרמית סטרילית של 25 גרם ומזרק של 1 מ"ל לרקמה התת-חניכית בצד המזו-פלטלי של M1 (יום 2, יום 4, יום 6, יום 8, יום 10 ויום 12).
הסר את חרוט האף להרדמה והכנס את החולדה לכלוב שלה. עקוב אחר התאוששות בעל החיים עד שהשפעות ההרדמה מתהפכות לחלוטין.

5. הקרבת בעלי חיים וניתוח

הערה: קיימות אפשרויות שונות להערכת ההתקדמות של מחלת פרקינסון. כאן, הניתוח המתואר מורכב מהערכה של ציטוקינים מעודדי דלקת בנוזל החניכיים (GCF), והערכה של אובדן עצם הנאדית.

ביום ה-14 של המחקר (יום 14), הקריבו את בעלי החיים עם_CO2 בתא פחמן דו-חמצני. שיעור תזוזה של 30% עד 70% מנפח התא לדקה מומלץ למכרסמים.
הערה: חוסר תגובה של בעלי חיים לרפלקס הדוושה והיעדר סימנים חיוניים חייבים להיות מאומתים כדי לאשר המתת חסד.
אסוף GCF כמתואר בשלבים הבאים:
הערה: GCF נאסף לפני השראת פרקינסון (לפני ניתוח) (יום 0) ולאחר זירוז פרקינסון (לאחר הקרבה) (יום 14).
1. הניחו את בעל החיים על גבו על משטח כירורגי, וייצבו את המקסילה והלסת התחתונה במצב פתוח עם סתימות פה מאלומיניום.
2. יש לאסוף את ה-GCF באמצעות נקודת נייר סופג מס' 30 (קוטר 0.03 ס"מ x אורך 3 ס"מ) על ידי הכנסתו לנקיק החניכיים סביב המזו-פלטל של ה-M1 עד להתנגדות קלה. שמור על נקודת הנייר באותו מיקום למשך 30 שניות בסך הכל לפני ההסרה המיידית.
3. לאחר האיסוף, העבירו את נקודת הנייר מיד לבקבוקון פלסטיק ואחסנו בטמפרטורה של -80°C עד לביצועי המבחן.
כדי להעריך חלבונים בתוך GCF, להכין את הפתרונות הבאים ובצע את השלבים של שיטת elution כמתואר:
הערה: IL-1β מוערך על GCF (יום 14) באמצעות immunoassay, על פי פרוטוקול היצרן.
1. הכינו את חיץ האלוציה טרי ושמרו אותו על קרח לאורך כל תהליך המיצוי כדי לעכב את פעילות הפרוטאז.
2. הכינו את כל הפתרונות הדרושים למאגר האלוציה כמתואר:
  1. להכין 1 מ"ל של Aprotinin (1 מ"ג / מ"ל) במים טהורים במיוחד.
  2. הכינו 10 מ"ל של פנילמתיל-סולפונילפלואוריד (PMSF) (200 מ"ל) במתנול.
  3. הוסף 125 μL של PMSF ו- 250 μL של Aprotinin ל- 24.5 מ"ל של תמיסת PBS (pH = 7.4) כדי להכין את מאגר האלוציה.
3. יש להמיס טבליה מסחרית אחת של מעכב פוספטאז עם 10 מ"ל של חיץ אלוציה טרי שהוכן למשך 10 דקות תחת תסיסה ב-4°C.
  הערה: משך הזמן של אלוציית GCF מוגבל; יש להשתמש מיד עבור צנטריפוגות לאחר הוספת טבליה מעכב phosphatase בתוך 30 הדקות הראשונות.
4. לאחר הוספת מעכב phosphatase, להוסיף 11 μL של חיץ elution מלא ישירות על הצינור עם נקודות הנייר.
5. צנטריפוגה את הצינור ב 452 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C.
6. העבירו את התוכן המדולל לבקבוקון פלסטיק חדש. חזור על תהליך זה ארבע פעמים נוספות כדי להפיק נפח כולל של 50 μL.
7. לאחר הצנטריפוגה האחרונה, הוסף נפח כולל של 60 μL ישירות על נקודת הנייר, וצנטריפוגה פעם אחרונה ב 452 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C.
8. השתמש בנפח המדולל הנדרש להערכת חלבון.
לאחר המתת חסד ואיסוף GCF, בעזרת מספריים כירורגיים, לחתוך את הלסת העליונה של החולדות. נסו לקלף את המסכה של החולדה ולהשאיר כמה שפחות רקמות רכות.
מקמו את הלסת בשלב המיקרוסקופ לצורך הדמיה וצלמו בהגדלה הרצויה.
הניחו את הלסת ישירות ב-4% פרפורמלדהיד (PFA) מדולל ב-PBS. רענן פעמיים בשבוע עם PFA חדש למשך 12 יום לקיבוע מלא.
התראה: יש לבצע צעדים הקשורים ל-PFA במכסה אדים בהתאם להמלצות גיליון נתוני הבטיחות.
לאחר קיבוע מלא של הלסת, הערך את אובדן העצם באמצעות סורק טומוגרפיה ממוחשבת של קרן חרוט (CBCT), באופן הבא:
1. פתח את המחשב.
2. פתח את תוכנית ניתוח CBCT.
3. בחר פרוטוקול סריקה > מצב סריקת תותבות.
4. בחר שדה ראייה (FOV) > (11x8) HIRes (90 kV של מתח ו- 3 mA של זרם).
5. מניחים את המקסילה העליונה הקבועה של החולדות בגן.
6. לחץ על הבא.
7. לחץ על לחצן צילום רנטגן (לחץ על שלט הרנטגן כדי לבצע את הפליטה והשאר אותו לחוץ למשך כל הסריקה).
8. במידת הצורך, מקם מחדש את המקסילה העליונה במרכז המישור הקדמי על ידי לחיצה על כפתור הבקרה, ולאחר מכן לחץ על לחצן צילום רנטגן (לחץ על שלט הרנטגן כדי לבצע את הפליטה והשאר אותו לחוץ למשך כל הסריקה).
9. לחץ על הבא.
10. לחץ על לחצן צילום רנטגן (לחץ על שלט הרנטגן כדי לבצע את הפליטה והשאר אותו לחוץ למשך כל הסריקה).
11. במידת הצורך, מקם מחדש את התותבת במרכז מישור הקשת על ידי לחיצה על כפתור הבקרה, ולאחר מכן לחץ על לחצן צילום רנטגן (לחץ על שלט הרנטגן כדי לבצע את הפליטה והשאר אותה לחוצה למשך כל הסריקה).
12. לחץ על הבא.
13. לחץ על לחצן התחל (לחץ על שלט הרנטגן כדי לבצע את הפליטה ולהשאיר אותה לחוצה במשך כל תקופת הבחינה). המתן עד לקבלת הודעת עיבוד ולאחר מכן בצע את ההוראות המוצגות.
14. מופיעה תצוגת חלון. החזירו את האפור ל- 65% ולחצו על ' החל'.
15. לשמירת הסריקה, לחץ על קובץ ושמור אותה בפורמט DICOM. לאחר מכן, לחץ על All Images ובחלון בחירת הייצוא של DICOM, בחר את כל הפרמטרים המוצגים (תמונה ראשונית, ציר מקורי, ציר מעוצב מחדש, multiplanar) ובחר סוג מוגדר מראש.
עיבוד התמונות המייצגות הדו-ממדיות והסגיטליות של הטוחנות המקסילריות באמצעות תוכנת אנליזה, באופן הבא:
1. פתח את התוכנה.
2. לחץ על File and Open, ולאחר מכן בחר בתיקייה עם תמונות בתבנית DICOM ולחץ על Open.
3. המתן עד שיופיע החלון "המר ל -8 סיביות", בחר את הטווח בין 0 ל -6,000 ולחץ על אישור.
4. לחץ על Raw images.
5. הגדר את החלק העליון והתחתון של הבחירה כדי להגביל את אזור העניין. חפש את התמונה הראשונה והאחרונה שבהן מופיעה עצם מכתשית ובחר אותה עם החלק העליון של הבחירה והחלק התחתון של פקודות הבחירה .
  הערה: ניתן לייצא תמונות דו-ממדיות מייצגות של עצם הנאדית של הטוחנות, כמו באיור 3A,B.
6. לתמונות מייצגות של קשת, לחצו על Toggle profile bar.
7. ציירו קו קשת באמצע החיך ולחצו על ' פרוסת מודל'. קבעו פרמטרים לתיחום אזור העניין (מרווח בין פרוסות: 1; מספר פרוסות: 100) ולחצו על הלחצן 'אשר'. המתן עד לסיום מודל הפריסה. לבסוף, לחץ על שמור תמונות שנפרסו.
  הערה: ניתן לייצא דמיונות סגיטליים מייצגים של עצם הנאדית של הטוחנות, כמו באיור 3C,D.

תוצאות

ציר זמן של שלבי הניסוי מוצג באיור 1. איור 2A מראה תמונה של המנדיבולה לאחר התערבות כירורגית, עם מיקום רצועות סביב החריץ של M1 בזמן 0 של הניסוי. איור 2B מראה כיצד, לאחר 14 יום של ההליך, הרצועה סביב M1 נכנסת לחריץ החניכיים, מה שגורם לדלקת בחניכיים ולהצט?...

Discussion

שיטה זו מתארת השראת פרקינסון בחולדות בעקבות טכניקה משולבת של זריקות Pg-LPS ומיקום רצועות סביב M1, וחושפת כי ניתן לגרום לשינויים משמעותיים ברקמות החניכיים ובעצם הנאדית תוך 14 יום לאחר שיטה זו.

במהלך הליך זה, יש לתת תשומת לב לשלבים קריטיים שונים. במהלך הרדמת בעלי חיים והכנת פר...

Disclosures

המחברים מצהירים כי אין ניגוד עניינים.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה על ידי Fundació Universitat-Empresa de les Illes Balears (הוכחת היתכנות קריאה 2020), על ידי Instituto de Salud Carlos III, Ministerio de Economía y Competividad, במימון משותף של הקרן החברתית האירופית ESF והקרן האירופית לפיתוח אזורי ERDF (חוזה ל- M.M.B; FI18/00104) ועל ידי Direcció General d'Investigació, Conselleria d'Investigació, Govern Balear (חוזה עם M.M.F.C; פ/040/2020). המחברים מודים לד"ר אנה תומס ומריה טורטוסה על עזרתן בניתוח הניסויי ובפלטפורמה של IdISBa. לבסוף, תודה לבית הספר לרפואת שיניים ADEMA על הגישה לסורק CBCT.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adsorbent paper point nº30	Proclinc	8187
Aprotinin	Sigma-Aldrich	A1153
Atipamezole	Dechra	573751.5	Revanzol 5 mg/mL
Braided silk ligature (5/0)	Laboratorio Arago Sl	613112
Buprenorphine	Richter pharma	578816.6	Bupaq 0.3 mg/mL
Cone-beam computed tomography (CBCT) Scanner	MyRay	hyperion X9	Model Hyperion X9
CTAn software	SkyScan		Version 1.13.4.0
Dental explorer	Proclinc	99743
Diamond lance-shaped bur	Dentaltix	IT21517
Food maintenance diet	Sodispain research	ROD14
Heated surgical platform	PetSavers
Hollenback carver	Hu-FRIEDY	HF45234
Hypodermic needle	BD	300600	25G X 5/8” - 0,5 X 16 MM
Isoflurane	Karizoo		Isoflutek 1000mg/g
Ketamine	Dechra	581140.6	Anesketin 100 mg/mL
Lipopolysaccharide derived from P.Gingivalis	InvivoGen	TLRL-PGLPS
Methanol	Fisher Scientific	M/4000/PB08
Micro needle holter	Fehling Surgical Instruments	KOT-6
Microsurgical pliers	KLS Martin	12-384-06-07
microsurgical scissors	S&T microsurgical instruments	SDC-15 RV
Monitor iMEC 8 Vet	Mindray
Multiplex bead immunoassay	Procartaplex, Thermo fisher Scientific	PPX-05
Paraformaldehyde (PFA)	Sigma-Aldrich	8187151000
Periosteal microsurgical elevator	Dentaltix	CU19112468
Phenylmethylsulfonylfluoride (PMSF)	Roche	10837091001
Phosphate Buffer Solution (PBS)	Capricorn Scientific	PBS-1A
PhosSTOP	Roche	4906845001	Commercial phosphatase inhibitor tablet
Plastic vial	SPL Lifesciencies	60015	1.5mL
Saline	Cinfa	204024.3
Stereo Microscope	Zeiss		Model SteREO Discovery.V12
Surgical loupes led light	Zeiss
Surgical scissors	Zepf Surgical	08-1701-17
Syringe	BD plastipak	303172	1mL
Veterinary dental micromotor	Eickemeyer	174028
Xylazine	Calier	20102-003	Xilagesic 20 mg/mL

References

Carvalho, J. D. S., et al. Impact of citrus flavonoid supplementation on inflammation in lipopolysaccharide-induced periodontal disease in mice. Food and Function. 12 (11), 5007-5017 (2021).
Nazir, M. A. Prevalence of periodontal disease, its association with systemic diseases and prevention. International Journal of Health Sciences. 1 (2), 72-80 (2017).
Dumitrescu, A. L., El-Aleem, S. A., Morales-Aza, B., Donaldson, L. F. A model of periodontitis in the rat: Effect of lipopolysaccharide on bone resorption, osteoclast activity, and local peptidergic innervation. Journal of Clinical Periodontology. 31 (8), 596-603 (2004).
Wang, H. Y., et al. Preventive effects of the novel antimicrobial peptide Nal-P-113 in a rat Periodontitis model by limiting the growth of Porphyromonas gingivalis and modulating IL-1β and TNF-α production. BMC Complementary and Alternative Medicine. 17 (1), 1-10 (2017).
Guan, J., Zhang, D., Wang, C. Identifying periodontitis risk factors through a retrospective analysis of 80 cases. Pakistan Journal of Medical Sciences. 38 (1), 293-296 (2021).
Khajuria, D. K., Patil, O. N., Karasik, D., Razdan, R. Development and evaluation of novel biodegradable chitosan based metformin intrapocket dental film for the management of periodontitis and alveolar bone loss in a rat model. Archives of Oral Biology. 85, 120-129 (2018).
Nishida, E., et al. Bone resorption and local interleukin-1alpha and interleukin-1beta synthesis induced by Actinobacillus actinomycetemcomitans and Porphyromonas gingivalis lipopolysaccharide. Journal of Periodontal Research. 36 (1), 1-8 (2001).
Graves, D. T., Kang, J., Andriankaja, O., Wada, K., Rossa, C. Animal models to study host-bacteria interactions involved in periodontitis. Bone. 23 (1), 1-7 (2008).
Struillou, X., Boutigny, H., Soueidan, A., Layrolle, P. Experimental animal models in periodontology: a review. The Open Dentistry Journal. 4 (1), 37-47 (2010).
Mustafa, H., et al. Induction of periodontal disease via retentive ligature, lipopolysaccharide injection, and their combination in a rat model. Polish Journal of Veterinary Sciences. 24 (3), 365-373 (2021).
Chadwick, J. W., Glogauer, M. Robust ligature-induced model of murine periodontitis for the evaluation of oral neutrophils. Journal of Visualized Experiments. 2020 (155), 6-13 (2019).
Cheng, R., Wu, Z., Li, M., Shao, M., Hu, T. Interleukin-1β is a potential therapeutic target for periodontitis: a narrative review. International Journal of Oral Science. 12 (1), 1-9 (2020).
Abe, T., Hajishengallis, G. Optimization of the ligature-induced periodontitis model in mice. Journal of Immunological Methods. 394 (1-2), 49-54 (2013).
Jeong-Hyon, K., Bon-Hyuk, G., Sang-Soo, N., Yeon-Cheol, P. A review of rat models of periodontitis treated with natural extracts. Journal of Traditional Chinese Medical Sciences. 7 (2), 95-103 (2020).
Marchesan, J., et al. An experimental murine model to study periodontitis. Nature Protocols. 13 (10), 2247-2267 (2018).
Lin, P., et al. Application of ligature-induced periodontitis in mice to explore the molecular mechanism of periodontal disease. International Journal of Molecular Sciences. 22 (16), 8900 (2021).
Irie, M. S., et al. Use of micro-computed tomography for bone evaluation in dentistry. Brazilian Dental Journal. 29 (3), 227-238 (2018).
Haas, L. F., Zimmermann, G. S., De Luca Canto, G., Flores-Mir, C., Corrêa, M. Precision of cone beam CT to assess periodontal bone defects: a systematic review and meta-analysis. Dentomaxillofacial Radiology. 47 (2), 20170084 (2018).
Kamburoğlu, K., Ereş, G., Akgün, C. Qualitative and quantitative assessment of alveolar bone destruction in adult rats using CBCT. Journal of Veterinary Dentistry. 36 (4), 245-250 (2019).
Sousa Melo, S. L., Rovaris, K., Javaheri, A. M., de Rezen de Barbosa, G. L. Cone-beam computed tomography (CBCT) imaging for the assessment of periodontal disease. Current Oral Health Reports. 7 (4), 376-380 (2020).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

192

This article has been published

Video Coming Soon

Keep me updated:

Method Article